塩基記録:ショウジョウバエの味覚ニューロン応答解析技術

要約

電気生理学的記録のめったに使用されない方法である塩基記録は、従来の記録方法では調べることができなかった味覚コーディングの特徴を分析することができます。塩基記録により、従来の電気生理学的手法では研究できない疎水性刺激に対する味覚応答の分析も可能になります。

要約

昆虫は、先端に毛穴がある味毛(センシラ)を通して外界を味わっています。センシラムが潜在的な食料源と接触すると、食物源からの化合物が細孔から入り、内部のニューロンを活性化します。50年以上にわたり、これらの応答はチップ記録と呼ばれる技術を使用して記録されてきました。しかし、この方法には、刺激接触の前後に神経活動を測定できないことや、味覚が水溶液に溶ける必要があることなど、大きな制限があります。ここでは、これらの制限を克服するベースレコーディングと呼ばれる手法について説明します。塩基記録により、刺激前、刺激中、刺激後の味覚ニューロンの活動を測定できます。したがって、味覚刺激後に発生するOFF応答の広範な分析が可能になります。水への溶解度が非常に低い長鎖フェロモンなどの疎水性化合物の研究に使用できます。要約すると、塩基記録は、ニューロン活動を測定する手段として単一感覚電気生理学の利点を提供し、遺伝的ツールを必要とせずに高い空間的および時間的分解能を提供し、従来の先端記録技術の主要な制限を克服します。

概要

ショウジョウバエを含む昆虫は、周囲から複雑な化学情報を抽出できる洗練された味覚システムに恵まれています。このシステムにより、さまざまな物質の化学組成を識別し、栄養価の高い物質と有害な物質を区別する^{ことができます1,2}。

このシステムの中核となるのは、味毛またはセンシラと呼ばれる特殊な構造であり、体のさまざまな部分に戦略的に配置されています。ショウジョウバエでは、これらのセンシラは、ハエの頭1,2,3,4の主要な味覚器官であるラベルと、脚と翼^1,2,5,6にあります。ラベルは吻の先端に位置し、2つの葉^4,7,8

プロトコル

以下のプロトコルは、イェール大学のすべての動物飼育ガイドラインに準拠しています。

1.ハエ

1. 10〜15匹の新しく出現したフライを、25°Cおよび60%の相対湿度で、12:12時間の明暗サイクルで新鮮な標準培養バイアルに入れます。
2. 生後3〜7日でハエを使用してください。

2. 化学感覚刺激

1. 利用可能な最高の純度の化学感覚刺激を得る。使用するまで、ベンダーの推奨に従って保管してください。
2. 化学感覚刺激を溶解し、水またはパラフィン油などの別の所望の無毒溶媒で所望の濃度に希釈する。調製した溶液を、溶解した固体化合物の場合は最低1時間攪拌する。

3.ガラス刺激毛細管

1. ピペットプーラー装置を使用して、ガラスキャピラリーを引っ張り、ホウケイ酸ガラスキャピラリー(長さ100 mm、外径1 mm、内径0.58 mm)からの刺激を保持します。先端径3μm〜10μmを目標にしてください。
2. マイクロローダーピペットチップを使用して、ガラスキャピラリーに好みの刺激溶液を充填します。気泡は軽く叩くことで取り除くことができますので、ご注意ください。

ディスカッション

ある種のセンシラからの記録では、異なるニューロンのスパイクを区別することが困難な場合がある。例えば、S感知器とI感知器の糖ニューロンと機械感覚ニューロンは、同様の振幅のスパイクを生成し、それらを区別することを困難にする^4,14。非常に鋭いタングステン記録電極を使用すると、記録電極の賢明な配置と同様に、機械感覚ニューロ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces.
Antivibration Table	TMC	63-7590E
motorized Micromanipulators	Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators	Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual Micromanipulators	Märzhäuser Micromanipulators	MM33 Micromanipulator
Magnetic stands	ENCO	Model #625-0930
Reference  and recording Electrode Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended Probe	Ockenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus Controllers	Ockenfels Syntech GmbH	Stimulus Controller CS 55
Personal Computer	Dell	Vostro	Check for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten Rod	A-M Systems	Cat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday Cage			Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Pipette Puller	Sutter Instrument Company	Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Stereomicroscope	Olympus	VMZ 1x-4x	For fly preparation
p200 Pipette Tips			Generic
Microloader tips	Eppendorf	E5242956003
1 ml Syringe			Generic
Crocodile clips
Power Transformers	STACO ENERGY PRODUCTS	STACO 3PN221B	Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay			Generic
Forceps			Generic
Plastic Tubing	Saint Gobain	Tygon S3™ E-3603
Standard culture vials	Archon Scientific		Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)	Sigma-Aldrich	Cat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)	Sigma-Aldrich	Cat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)	Sigma-Aldrich	Cat# 36542