Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila

Riepilogo

Un metodo di registrazione elettrofisiologica raramente utilizzato, la registrazione di base, consente l'analisi di caratteristiche della codifica del gusto che non possono essere esaminate con i metodi di registrazione convenzionali. La registrazione delle basi consente anche l'analisi delle risposte gustative a stimoli idrofobici che non possono essere studiati con metodi elettrofisiologici tradizionali.

Abstract

Gli insetti assaporano il mondo esterno attraverso i peli del gusto, o sensilla, che hanno i pori sulla punta. Quando un sensillum entra in contatto con una potenziale fonte di cibo, i composti della fonte di cibo entrano attraverso il poro e attivano i neuroni all'interno. Per oltre 50 anni, queste risposte sono state registrate utilizzando una tecnica chiamata registrazione delle mance. Tuttavia, questo metodo presenta importanti limitazioni, tra cui l'incapacità di misurare l'attività neurale prima o dopo il contatto con lo stimolo e il requisito che i tastanti siano solubili in soluzioni acquose. Descriviamo qui una tecnica che chiamiamo registrazione di base, che supera queste limitazioni. La registrazione delle basi consente di misurare l'attività dei neuroni del gusto prima, durante e dopo lo stimolo. Pertanto, consente un'analisi approfondita delle risposte OFF che si verificano dopo uno stimolo gustativo. Può essere utilizzato per studiare composti idrofobici come i feromoni a catena lunga che hanno una solubilità molto bassa in acqua. In sintesi, la registrazione di base offre i vantaggi dell'elettrofisiologia a singolo sensillum come mezzo per misurare l'attività neuronale - alta risoluzione spaziale e temporale, senza la necessità di strumenti genetici - e supera i limiti chiave della tradizionale tecnica di registrazione della punta.

Introduzione

Gli insetti, comprese le mosche drosofilide, sono dotati di un sofisticato sistema di gusto che consente loro di estrarre informazioni chimiche complesse dall'ambiente circostante. Questo sistema consente loro di discernere la composizione chimica di varie sostanze, distinguendo tra quelle nutrienti e quelle dannose ^1,2.

Al centro di questo sistema ci sono strutture specializzate note come peli del gusto o sensilla, posizionate strategicamente su varie parti del corpo. Nelle mosche drosofilidi, questi sensilli si trovano sul labello, che è il principale organo gustativo della testa della mosca 1,2,3,4, nonché sulle zampe e sulle ali ^1,2,5,6. Il labello si trova all'estremità della proboscide e contiene due lobi ^4,7,8. Ogni lobo è ricoperto da 31 sensilli gustativi classificati come corti, lunghi e intermedi ^4,7,8. Questi sensilli ospitano ciascuno 2-4 neuroni gustativi 1,2,9,10. Questi neuroni del gusto esprimono membri di almeno quattro diverse famiglie di geni, vale a dire i geni del recettore gustativo (Gr), del recettore ionotropico (Ir), del borseggiatore (Ppk) e del potenziale del recettore transitorio (Trp) ^1,2,11,12,13. Questa diversità di recettori e canali fornisce agli insetti la capacità di riconoscere un'ampia gamma di composti chimici, inclusi segnali non volatili e volatili ^1,2,14.

Per oltre 50 anni, gli scienziati hanno quantificato la risposta dei neuroni del gusto e dei loro recettori utilizzando una tecnica chiamata registrazione della punta 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ^,25,26,27,28^,
29,30,31,32,33,34,35. Tuttavia, questo metodo presenta grosse limitazioni. In primo luogo, l'attività neurale può essere misurata solo durante il contatto con lo stimolo e non prima o dopo il contatto. Questa limitazione preclude la misurazione dell'attività di picco spontaneo e impedisce la misurazione delle risposte OFF. In secondo luogo, possono essere testati solo i sapori solubili in soluzioni acquose.

Queste limitazioni possono essere superate da una tecnica elettrofisiologica alternativa raramente utilizzata chiamata "registrazione di base". Qui descriviamo questa tecnica, che abbiamo adattato da un metodo utilizzato da Marion-Poll e colleghi²⁴, e mostriamo le caratteristiche cruciali della codifica del gusto che ora può comodamente misurare¹⁴.

Protocollo

Il seguente protocollo è conforme a tutte le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Yale.

1. Mosche

1. Mettere 10-15 mosche appena emerse in fiale di coltura standard fresche a 25 °C e 60% di umidità relativa in un ciclo luce-buio di 12:12 ore.
2. Usa le mosche quando hai 3-7 giorni.

2. Stimoli chemiosensoriali

1. Ottenere stimoli chemiosensoriali della massima purezza disponibile. Conservarli come raccomandato dal venditore fino all'uso.
2. Sciogliere gli stimoli chemiosensoriali e diluire alle concentrazioni desiderate in acqua o in un altro solvente desiderato e non tossico come l'olio di paraffina. Agitare le soluzioni preparate per almeno 1 ora nel caso di composti solidi disciolti.

3. Capillare dello stimolo in vetro

1. Tirare un capillare di vetro per trattenere lo stimolo da un capillare di vetro borosilicato (lunghezza 100 mm, diametro esterno 1 mm, diametro interno 0,58 mm) utilizzando uno strumento estrattore per pipette. Mira a ottenere un diametro della punta compreso tra 3 μm e 10 μm.
2. Riempire il capillare di vetro con la soluzione di stimolo preferita utilizzando un puntale per pipetta microloader. Fare attenzione a evitare bolle, che possono essere rimosse picchiettando delicatamente.
3. Se lo stimolo cristallizza sulla punta, pulire o sostituire il capillare di stimolo in vetro.

4. Elettrodi di riferimento e di registrazione

1. Utilizzare barre di tungsteno (diametro 127 μm e lunghezza 76,2 mm) sia per gli elettrodi di riferimento che per quelli di registrazione. Affilare gli elettrodi di riferimento e di registrazione a circa 1 μm di diametro sulla punta (le forme di questi elettrodi sono raffigurate in Delventhal et al.³⁶) immergendoli ripetutamente per diversi secondi in una soluzione al 10% di KNO₃ (~1 M) o in una soluzione al 10% di KOH (1,8 M).
   NOTA: Questa soluzione richiede corrente (0,3-3 mA) per facilitare questo processo.

5. Preparazione della mosca per la registrazione della base

1. Aspirare una singola mosca dalla fiala in un aspiratore. Estrarre l'aspiratore e intrappolare l'animale mettendo un dito sopra l'estremità.
2. Espellere la mosca in un puntale per pipette di plastica da 200 μl. Tenendo l'estremità dell'aspiratore nel puntale della pipetta, utilizzare l'estremità per spingere la mosca in avanti, a testa in giù, verso l'estremità stretta del puntale della pipetta.
3. Tagliare la punta della pipetta a ciascuna estremità (cioè anteriore e posteriore all'animale) usando una lama di rasoio.
4. Usa argilla o un piccolo pezzo di cotone per spingere ulteriormente la mosca in avanti, finché metà della testa sporge dall'estremità del puntale della pipetta tagliato. Usa una pinza per spingere delicatamente fino a quando il labello nella parte anteriore della testa non è esposto.
5. Fissare la punta della pipetta tagliata su un vetrino da microscopio in vetro usando l'argilla (Figura 1).
6. Sotto lo stereomicroscopio, posizionare il labello lateralmente su un vetrino coprioggetti in modo che un lobo, insieme ai suoi 31 sensilli gustativi, sia esposto (Figura 1). Il vetrino coprioggetto mantiene il labello in posizione.

6. Impianto di elettrofisiologia

1. Selezionare una stanza per la configurazione del carro che abbia temperatura e umidità relativa stabili (<70%) e sia isolata da fonti di rumore elettrico e meccanico, come frigoriferi e centrifughe.
2. Posizionare il microscopio al centro di un tavolo antivibrante.
3. Fissare un micromanipolatore manuale al tavolo antivibrante (Figura 2).
4. Collegare uno stelo in acciaio inossidabile che trattiene l'elettrodo di riferimento in tungsteno al micromanipolatore manuale (Figura 2).
5. Collegare i manipolatori motorizzati, uno con un supporto per la sonda dell'elettrodo di registrazione e un secondo con un supporto collegato a un albero in acciaio inossidabile per il capillare dello stimolo in vetro, allo stesso tavolo utilizzando i supporti (Figura 2).
6. Collegare la sonda dell'elettrodo di registrazione a un sistema IDAC (Intelligent Data Acquisition Controller) o a un altro amplificatore/sistema digitalizzatore.
7. Collegare questo sistema IDAC al computer sulla workstation.
8. Mettere a terra i manipolatori manuali e motorizzati nella stessa posizione all'interno del carro.
9. Installare sul computer il software di acquisizione appropriato per il sistema IDAC. Assicurarsi che i driver di acquisizione digitale siano compatibili con il sistema operativo (ad esempio, Windows XP-7, -8 o -10) sul computer.

7. Registrazione dal senso del gusto

1. Posizionare il vetrino di preparazione sul tavolino del microscopio con un obiettivo a basso ingrandimento (ad es. 10x) in posizione. Spostare il tavolino finché il labello non è a fuoco al centro del campo visivo sia con obiettivi a basso ingrandimento che ad alto ingrandimento (ad es. 50x).
2. Inserire l'elettrodo di riferimento nell'occhio utilizzando l'obiettivo a basso ingrandimento. Per inserire l'elettrodo di riferimento, puntare l'occhio sul lato opposto al lato opposto al lato con l'elettrodo di registrazione, ad esample, se l'elettrodo di registrazione si avvicina da destra, posizionare l'elettrodo di riferimento nell'occhio sinistro. Utilizzare un micromanipolatore manuale per un inserimento preciso.
3. Mettere a fuoco la punta del capillare dello stimolo in vetro al centro del campo visivo degli obiettivi a basso e alto ingrandimento utilizzando un micromanipolatore motorizzato (Figura 3).
4. A basso ingrandimento, avvicinare l'elettrodo di registrazione al labello utilizzando un secondo micromanipolatore motorizzato.
5. Ad alto ingrandimento, inserire l'elettrodo di registrazione nella base di un sensillum gustativo utilizzando il micromanipolatore motorizzato fino a quando non si sente il suono dell'attività di attivazione neuronale dall'uscita audio del sistema IDAC.
6. Una volta stabilito un segnale stabile, iniziare a registrare il segnale utilizzando il software fornito con il sistema IDAC (Figura 4A-D). Per avviare la registrazione, premere il pulsante Avvia registrazione.
7. Portare la punta del vetro dello stimolo capillare per coprire la punta del sensillo gustativo utilizzando il manipolatore motorizzato.
8. Per terminare lo stimolo, rimuovere il capillare dello stimolo in vetro dal sensillum utilizzando il manipolatore motorizzato.
9. Segnare manualmente l'inizio e la fine della stimolazione utilizzando un pedale. Il pedale è collegato all'IDAC e la sua comunicazione con il software è facilitata attraverso l'IDAC per segnare l'inizio/fine dello stimolo.

8. Analisi

1. Utilizza le diverse funzioni del software fornito con il sistema IDAC per ordinare le popolazioni di spike in base all'ampiezza (quando possibile) e analizzare le dinamiche di risposta.
   1. Per contare i picchi, fai clic con il pulsante sinistro del mouse sulla registrazione di interesse, visualizzando una finestra da cui selezionare. Scegliere In picchi, avviando un'altra finestra denominata Converti onde in picchi. Immettere un nome nel campo Nuovo e premere il pulsante OK .
   2. Inserendo il nome nel campo Nuovo nel passaggio 8.1.1 si accede alla vista Istogramma di ampiezza . Scegli l'ampiezza da contare, quindi chiudi questa vista. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per aggiungere un contatore.
   3. Esamina manualmente i picchi per confermare le conclusioni basate sull'analisi con il software.
      NOTA: Il software consente anche l'esportazione dei dati in diversi formati per ulteriori analisi.

Risultati

La Figura 4A mostra i picchi spontanei che derivano da un sensillo. Si dividono in due classi in base all'ampiezza, con i picchi più grandi derivanti dal neurone che è sensibile ai composti amari e i picchi più piccoli dal neurone che risponde agli zuccheri. La relazione tra ampiezza del picco e specificità funzionale è stata corroborata da esperimenti genetici 4,14,37,38,39 .

Discussione

Nelle registrazioni di alcuni tipi di sensilli, può essere difficile differenziare i picchi di diversi neuroni. Ad esempio, i neuroni dello zucchero e i neuroni meccanosensoriali dei sensilli S e I producono picchi di ampiezza simile, rendendo difficile distinguerli ^4,14. Troviamo che l'uso di un elettrodo di registrazione al tungsteno molto affilato riduce l'attivazione del neurone meccanosensoriale, così come il posizionamento giudizioso dell'elettrodo di reg...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces.
Antivibration Table	TMC	63-7590E
motorized Micromanipulators	Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators	Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual Micromanipulators	Märzhäuser Micromanipulators	MM33 Micromanipulator
Magnetic stands	ENCO	Model #625-0930
Reference  and recording Electrode Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended Probe	Ockenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus Controllers	Ockenfels Syntech GmbH	Stimulus Controller CS 55
Personal Computer	Dell	Vostro	Check for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten Rod	A-M Systems	Cat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday Cage			Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Pipette Puller	Sutter Instrument Company	Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Stereomicroscope	Olympus	VMZ 1x-4x	For fly preparation
p200 Pipette Tips			Generic
Microloader tips	Eppendorf	E5242956003
1 ml Syringe			Generic
Crocodile clips
Power Transformers	STACO ENERGY PRODUCTS	STACO 3PN221B	Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay			Generic
Forceps			Generic
Plastic Tubing	Saint Gobain	Tygon S3™ E-3603
Standard culture vials	Archon Scientific		Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)	Sigma-Aldrich	Cat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)	Sigma-Aldrich	Cat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)	Sigma-Aldrich	Cat# 36542