Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila

Riepilogo

Un metodo di registrazione elettrofisiologica raramente utilizzato, la registrazione di base, consente l'analisi di caratteristiche della codifica del gusto che non possono essere esaminate con i metodi di registrazione convenzionali. La registrazione delle basi consente anche l'analisi delle risposte gustative a stimoli idrofobici che non possono essere studiati con metodi elettrofisiologici tradizionali.

Abstract

Gli insetti assaporano il mondo esterno attraverso i peli del gusto, o sensilla, che hanno i pori sulla punta. Quando un sensillum entra in contatto con una potenziale fonte di cibo, i composti della fonte di cibo entrano attraverso il poro e attivano i neuroni all'interno. Per oltre 50 anni, queste risposte sono state registrate utilizzando una tecnica chiamata registrazione delle mance. Tuttavia, questo metodo presenta importanti limitazioni, tra cui l'incapacità di misurare l'attività neurale prima o dopo il contatto con lo stimolo e il requisito che i tastanti siano solubili in soluzioni acquose. Descriviamo qui una tecnica che chiamiamo registrazione di base, che supera queste limitazioni. La registrazione delle basi consente di misurare l'attività dei neuroni del gusto prima, durante e dopo lo stimolo. Pertanto, consente un'analisi approfondita delle risposte OFF che si verificano dopo uno stimolo gustativo. Può essere utilizzato per studiare composti idrofobici come i feromoni a catena lunga che hanno una solubilità molto bassa in acqua. In sintesi, la registrazione di base offre i vantaggi dell'elettrofisiologia a singolo sensillum come mezzo per misurare l'attività neuronale - alta risoluzione spaziale e temporale, senza la necessità di strumenti genetici - e supera i limiti chiave della tradizionale tecnica di registrazione della punta.

Introduzione

Gli insetti, comprese le mosche drosofilide, sono dotati di un sofisticato sistema di gusto che consente loro di estrarre informazioni chimiche complesse dall'ambiente circostante. Questo sistema consente loro di discernere la composizione chimica di varie sostanze, distinguendo tra quelle nutrienti e quelle dannose ^1,2.

Al centro di questo sistema ci sono strutture specializzate note come peli del gusto o sensilla, posizionate strategicamente su varie parti del corpo. Nelle mosche drosofilidi, questi sensilli si trovano sul labello, che è il principale organo gustativo della testa ....

Protocollo

Il seguente protocollo è conforme a tutte le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Yale.

1. Mosche

1. Mettere 10-15 mosche appena emerse in fiale di coltura standard fresche a 25 °C e 60% di umidità relativa in un ciclo luce-buio di 12:12 ore.
2. Usa le mosche quando hai 3-7 giorni.

2. Stimoli chemiosensoriali

1. Ottenere stimoli chemiosensoriali della massima purezza disponibile. Conservarli come raccomandato dal venditore fino all'uso.
2. Sciogliere gli stimoli chemiosensoriali e diluire alle concentrazioni desiderate in acqu....

Discussione

Nelle registrazioni di alcuni tipi di sensilli, può essere difficile differenziare i picchi di diversi neuroni. Ad esempio, i neuroni dello zucchero e i neuroni meccanosensoriali dei sensilli S e I producono picchi di ampiezza simile, rendendo difficile distinguerli ^4,14. Troviamo che l'uso di un elettrodo di registrazione al tungsteno molto affilato riduce l'attivazione del neurone meccanosensoriale, così come il posizionamento giudizioso dell'elettrodo di reg.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces.
Antivibration Table	TMC	63-7590E
motorized Micromanipulators	Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators	Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual Micromanipulators	Märzhäuser Micromanipulators	MM33 Micromanipulator
Magnetic stands	ENCO	Model #625-0930
Reference  and recording Electrode Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended Probe	Ockenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus Controllers	Ockenfels Syntech GmbH	Stimulus Controller CS 55
Personal Computer	Dell	Vostro	Check for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten Rod	A-M Systems	Cat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday Cage			Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Pipette Puller	Sutter Instrument Company	Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Stereomicroscope	Olympus	VMZ 1x-4x	For fly preparation
p200 Pipette Tips			Generic
Microloader tips	Eppendorf	E5242956003
1 ml Syringe			Generic
Crocodile clips
Power Transformers	STACO ENERGY PRODUCTS	STACO 3PN221B	Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay			Generic
Forceps			Generic
Plastic Tubing	Saint Gobain	Tygon S3™ E-3603
Standard culture vials	Archon Scientific		Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)	Sigma-Aldrich	Cat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)	Sigma-Aldrich	Cat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)	Sigma-Aldrich	Cat# 36542