Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Nadiren kullanılan bir elektrofizyolojik kayıt yöntemi olan temel kayıt, geleneksel kayıt yöntemleriyle incelenemeyen tat kodlama özelliklerinin analizine olanak tanır. Temel kayıt, geleneksel elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak incelenemeyen hidrofobik uyaranlara verilen tat tepkilerinin analizine de izin verir.

Özet

Böcekler, uçlarında gözenekler bulunan tat tüyleri veya sensilla yoluyla dış dünyanın tadına bakarlar. Bir sensillum potansiyel bir besin kaynağı ile temas ettiğinde, besin kaynağından gelen bileşikler gözenekten girer ve içindeki nöronları aktive eder. 50 yılı aşkın bir süredir, bu yanıtlar ipucu kaydı adı verilen bir teknik kullanılarak kaydedilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin, uyaran temasından önce veya sonra nöral aktivitenin ölçülememesi ve tatların sulu çözeltilerde çözünür olması gerekliliği dahil olmak üzere önemli sınırlamaları vardır. Burada, bu sınırlamaların üstesinden gelen temel kayıt dediğimiz bir tekniği açıklıyoruz. Temel kayıt, uyaran öncesinde, sırasında ve sonrasında tat nöron aktivitesinin ölçülmesine izin verir. Böylece, bir tat uyaranından sonra ortaya çıkan OFF tepkilerinin kapsamlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar. Suda çözünürlüğü çok düşük olan uzun zincirli feromonlar gibi hidrofobik bileşikleri incelemek için kullanılabilir. Özetle, temel kayıt, nöronal aktiviteyi ölçmenin bir yolu olarak tek sensillum elektrofizyolojisinin avantajlarını sunar - genetik araçlara ihtiyaç duymadan yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük - ve geleneksel uç kayıt tekniğinin temel sınırlamalarının üstesinden gelir.

Giriş

Drosophilid sinekleri de dahil olmak üzere böcekler, çevrelerinden karmaşık kimyasal bilgiler çıkarmalarını sağlayan sofistike bir tat sistemine sahiptir. Bu sistem, besleyici ve zararlı olanları ayırt ederek çeşitli maddelerin kimyasal bileşimini ayırt etmelerini sağlar 1,2.

Bu sistemin merkezinde, stratejik olarak çeşitli vücut kısımlarına yerleştirilmiş, tat kılları veya sensilla olarak bilinen özel yapılar bulunur. Drosophilid sineklerinde, bu sensillalar, sinek başının 1,2,3,4 ana tat organı olan labellum üzerinde, ayrıca bacaklarda ve kanatlarda 1,2,5,6 bulunur. Labellum, hortumun ucunda bulunur ve iki lob 4,7,8 içerir. Her lob kısa, uzun ve orta 4,7,8 olarak kategorize edilen 31 tat duyusu ile kaplıdır. Bu duyuların her biri 2-4 tat nöronları 1,2,9,10. Bu tat nöronları, Tat reseptörü (Gr), İyonotropik reseptör (Ir), Yankesici (Ppk) ve Geçici reseptör potansiyeli (Trp) genleri 1,2,11,12,13 olmak üzere en az dört farklı gen ailesinin üyelerini eksprese eder . Bu reseptör ve kanal çeşitliliği, böcekleri hem uçucu olmayan hem de uçucu ipuçları 1,2,14 dahil olmak üzere çok çeşitli kimyasal bileşikleri tanıma yeteneği ile donatır.

50 yılı aşkın bir süredir, bilim adamları tat nöronlarının ve reseptörlerinin tepkisini, 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Ancak, bu yöntemin büyük sınırlamaları vardır. İlk olarak, nöral aktivite sadece uyaranla temas sırasında ölçülebilir, temastan önce veya sonra değil. Bu sınırlama, spontan spiking aktivitesinin ölçümünü engeller ve OFF yanıtlarının ölçümünü engeller. İkincisi, sadece sulu çözeltilerde çözünen tatlar test edilebilir.

Bu sınırlamalar, "temel kayıt" adı verilen nadiren kullanılan alternatif bir elektrofizyolojik teknikle aşılabilir. Burada, Marion-Poll ve meslektaşları24 tarafından kullanılan bir yöntemden uyarladığımız bu tekniği açıklıyoruz ve artık rahatça ölçebildiği önemli tat kodlama özelliklerinigösteriyoruz 14.

Protokol

Aşağıdaki protokol, Yale Üniversitesi'nin tüm hayvan bakımı yönergelerine uygundur.

1. Sinekler

  1. Yeni çıkan 10-15 sineği 25 ° C'de ve% 60 bağıl nemde 12:12 saat aydınlık-karanlık döngüsünde taze standart kültür şişelerine yerleştirin.
  2. 3-7 günlükken sinek kullanın.

2. Kemosensoriyel uyaranlar

  1. Mevcut en yüksek saflıkta kemosensoriyel uyaranlar elde edin. Kullanana kadar satıcı tarafından tavsiye edildiği şekilde saklayın.
  2. Kemosensoriyel uyaranları çözün ve su veya parafin yağı gibi arzu edilen, toksik olmayan başka bir çözücü içinde istenen konsantrasyonlara seyreltin. Çözünmüş katı bileşikler durumunda hazırlanan çözeltileri en az 1 saat karıştırın.

3. Cam uyaran kılcal damar

  1. Bir pipet çektirme aleti kullanarak uyaranı bir borosilikat cam kılcaldan (100 mm uzunluk, 1 mm dış çap, 0.58 mm iç çap) tutmak için bir cam kılcal damar çekin. 3 μm ile 10 μm arasında bir uç çapı elde etmeyi hedefleyin.
  2. Bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak cam kılcal damarı tercih edilen uyaran solüsyonla doldurun. Hafifçe vurarak çıkarılabilen kabarcıklardan kaçınmaya dikkat edin.
  3. Uyaran uçta kristalleşirse, cam uyaran kılcal damarını temizleyin veya değiştirin.

4. Referans ve kayıt elektrotları

  1. Hem referans hem de kayıt elektrotları için tungsten çubuklar (127 μm çap ve 76,2 mm uzunluk) kullanın. Referans ve kayıt elektrotlarını uçta yaklaşık 1 μm çapa kadar keskinleştirin (bu elektrotların şekilleri Delventhal ve ark.36) % 10 KNO3 (~ 1 M) çözeltisine veya% 10 KOH (1.8 M) çözeltisine birkaç saniye boyunca tekrar tekrar daldırarak.
    NOT: Bu çözüm, bu işlemi kolaylaştırmak için akım (0.3-3 mA) gerektirir.

5. Temel kayıt için sineğin hazırlanması

  1. Şişeden bir aspiratöre tek bir sinek çekin. Aspiratörü geri çekin ve parmağınızı ucunun üzerine koyarak hayvanı tuzağa düşürün.
  2. Sineği 200 μL'lik bir plastik pipet ucuna boşaltın. Aspiratörün ucunu pipet ucunda tutarak, sineği pipet ucunun dar ucuna doğru baş üstü ileri itmek için ucunu kullanın.
  3. Pipet ucunu bir tıraş bıçağı kullanarak her iki ucundan (yani hayvanın önünde ve arkasında) kesin.
  4. Başın yarısı kesilmiş pipet ucunun ucundan dışarı çıkana kadar sineği daha da ileri itmek için kil veya küçük bir parça pamuk kullanın. Başın önündeki etiket açığa çıkana kadar hafifçe itmek için forseps kullanın.
  5. Kesilmiş pipet ucunu kil kullanarak bir cam mikroskop lamına sabitleyin (Şekil 1).
  6. Stereomikroskop altında, labellumu bir kapak fişi üzerine yanal olarak yerleştirin, böylece bir lob, 31 tat sensillası ile birlikte açığa çıkar (Şekil 1). Kapak kayması, etiketi yerinde tutar.

6. Elektrofizyoloji teçhizatı

  1. Makine kurulumu için sabit sıcaklık ve bağıl neme (%<70) sahip ve buzdolapları ve santrifüjler gibi elektriksel ve mekanik gürültü kaynaklarından izole edilmiş bir oda seçin.
  2. Mikroskobu bir titreşim önleyici masanın ortasına yerleştirin.
  3. Titreşim önleyici masaya manuel bir mikromanipülatör sabitleyin (Şekil 2).
  4. Tungsten referans elektrodunu tutan paslanmaz çelik bir şaftı manuel mikromanipülatöre takın (Şekil 2).
  5. Motorlu manipülatörleri - biri kayıt elektrot probu için bir tutucu ve ikincisi cam uyaran kılcal damarı için paslanmaz çelik bir şafta bağlı bir tutucu ile - standları kullanarak aynı masaya bağlayın (Şekil 2).
  6. Kayıt elektrot probunu bir Akıllı Veri Toplama Denetleyicisi (IDAC) sistemine veya başka bir amplifikatör/sayısallaştırıcı sisteme bağlayın.
  7. Bu IDAC sistemini iş istasyonundaki bilgisayara bağlayın.
  8. Manuel ve motorlu manipülatörleri teçhizat içinde aynı yere topraklayın.
  9. Bilgisayara IDAC sistemi için uygun edinme yazılımını yükleyin. Dijital edinme sürücülerinin bilgisayardaki işletim sistemiyle (örneğin, Windows XP-7, -8 veya -10) uyumlu olduğundan emin olun.

7. Tat sensillasından kayıt

  1. Hazırlık slaytını, düşük büyütmeli (örn. 10x) bir objektif ile mikroskop tablasına yerleştirin. Labellum hem düşük büyütmeli hem de yüksek büyütmeli (ör. 50x) hedeflerde görüş alanının merkezinde netleme olana kadar sahneyi hareket ettirin.
  2. Düşük büyütme objektifini kullanarak referans elektrodu göze yerleştirin. Referans elektrodu yerleştirmek için, gözü, kayıt elektrodunun bulunduğu tarafın karşısındaki sineğin tarafına hedefleyin, örneğinample, kayıt elektrodu sağdan yaklaşıyorsa, referans elektrodu sol göze yerleştirin. Hassas yerleştirme için manuel bir mikromanipülatör kullanın.
  3. Motorlu bir mikromanipülatör kullanarak cam uyaran kılıcının ucunu hem düşük büyütmeli hem de yüksek büyütmeli objektiflerin görüş alanının merkezinde odak haline getirin (Şekil 3).
  4. Düşük büyütme altında, ikinci bir motorlu mikromanipülatör kullanarak kayıt elektrodunu etikete yaklaştırın.
  5. Yüksek büyütme altında, IDAC sisteminin ses çıkışından gelen nöronal ateşleme aktivitesinin sesi duyulana kadar kayıt elektrodunu motorlu mikromanipülatör kullanarak bir tat duyusunun tabanına yerleştirin.
  6. Kararlı bir sinyal oluşturulduktan sonra, IDAC sistemiyle birlikte gelen yazılımı kullanarak sinyali kaydetmeye başlayın (Şekil 4A-D). Kaydı başlatmak için Kaydı başlat düğmesine basın.
  7. Motorlu manipülatörü kullanarak tat duyusunun ucunu kaplamak için uyaran cam kılcalının ucunu getirin.
  8. Uyaranı sonlandırmak için, motorlu manipülatörü kullanarak cam uyaran kılcalını sensillumdan çıkarın.
  9. Bir pedal kullanarak stimülasyonun başlangıcını ve bitişini manuel olarak işaretleyin. Pedal IDAC'a bağlanır ve uyaranın başlangıcını/bitişini işaretlemek için IDAC aracılığıyla yazılımla iletişimi kolaylaştırılır.

8. Analiz

  1. Ani popülasyonları genliğe göre sıralamak (mümkün olduğunda) ve yanıt dinamiklerini analiz etmek için IDAC sistemiyle birlikte gelen yazılımın farklı işlevlerini kullanın.
    1. Ani artışları saymak için, ilgilenilen kayda sol tıklayın ve aralarından seçim yapabileceğiniz bir pencere açın. Ani Artışlar'ı seçerek Dalgaları ani artışlara dönüştür adlı başka bir pencere başlatın. Yeni alanına bir ad girin ve OK düğmesine basın.
    2. Adım 8.1.1'deki Yeni alanına ad girildiğinde Genlik Histogramı görünümü elde edilir. Sayılacak genliği seçin, sonra bu görüntüyü kapatın. Sayaç eklemek için sol tıklayın.
    3. Yazılımla yapılan analize dayalı sonuçları doğrulamak için ani artışları manuel olarak inceleyin.
      NOT: Yazılım ayrıca daha fazla analiz için verilerin farklı formatlarda dışa aktarılmasına da izin verir.

Sonuçlar

Şekil 4A, bir sensillumdan kaynaklanan spontan sivri uçları göstermektedir. Genliğe dayalı olarak iki sınıfa ayrılırlar, daha büyük sivri uçlar acı bileşiklere duyarlı nörondan ve şekerlere yanıt veren nörondan daha küçük sivri uçlar türetilir. Spike genliği ve fonksiyonel özgüllük arasındaki ilişki, genetik deneyler 4,14,37,38,39 ile doğrulanmıştır.

Tartışmalar

Bazı sensilla türlerinden elde edilen kayıtlarda, farklı nöronların sivri uçlarını ayırt etmek zor olabilir. Örneğin, S ve I sensilla'nın şeker nöronları ve mekanosensoriyel nöronları, benzer genliklerde sivri uçlar üretirve bu da onları ayırt etmeyi zorlaştırır 4,14. Çok keskin bir tungsten kayıt elektrodunun kullanılmasının, kayıt elektrodunun akıllıca yerleştirilmesi gibi, mekanosensoriyel nöronun ateşlenmesini azalttığın...

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Destek için Zina Berman'a, el yazması hakkındaki yorumları için Lisa Baik'e ve tartışma için Carlson laboratuvarının diğer üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, H.K.M.D.'ye DC020145 NIH hibesi K01 tarafından desteklenmiştir; ve NIH, JRC'ye R01 DC02174, R01 DC04729 ve R01 DC011697 verir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
MicroscopeOlympusBX51WIequipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. 
Antivibration TableTMC63-7590E
motorized MicromanipulatorsHarvard Apparatus and Märzhäuser MicromanipulatorsMicromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual MicromanipulatorsMärzhäuser MicromanipulatorsMM33 Micromanipulator
Magnetic standsENCOModel #625-0930
Reference  and recording Electrode HolderOckenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary HolderOckenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended ProbeOckenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus ControllersOckenfels Syntech GmbHStimulus Controller CS 55
Personal ComputerDellVostroCheck for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten RodA-M SystemsCat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday CageElectromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-4
Pipette PullerSutter Instrument CompanyModel P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
StereomicroscopeOlympusVMZ 1x-4xFor fly preparation
p200 Pipette TipsGeneric
Microloader tips EppendorfE5242956003
1 ml SyringeGeneric
Crocodile clips
Power TransformersSTACO ENERGY PRODUCTSSTACO 3PN221BAssembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling ClayGeneric
ForcepsGeneric
Plastic TubingSaint GobainTygon S3™ E-3603
Standard culture vialsArchon ScientificNarrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)Sigma-AldrichCat# 36542

Referanslar

  1. Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
  2. Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
  3. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
  4. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  5. He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
  6. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  7. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  8. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
  9. Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
  10. Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  12. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  13. Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
  15. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
  16. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
  17. Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
  18. Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
  19. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
  20. Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
  21. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  22. Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
  23. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  24. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
  25. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  26. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
  27. Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
  28. Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
  29. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
  30. Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  31. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
  32. Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
  33. Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
  34. Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
  35. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  36. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
  37. Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
  38. Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
  39. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır