JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטה נדירה של הקלטה אלקטרופיזיולוגית, הקלטת בסיס, מאפשרת ניתוח של תכונות של קידוד טעם שלא ניתן לבחון בשיטות הקלטה קונבנציונליות. הקלטה בסיסית מאפשרת גם ניתוח תגובות טעם לגירויים הידרופוביים שלא ניתן לחקור בשיטות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות.

Abstract

חרקים טועמים את העולם החיצוני דרך שערות טעם, או סנסילה, שיש להן נקבוביות בקצותיהם. כאשר סנסילום בא במגע עם מקור מזון פוטנציאלי, תרכובות ממקור המזון נכנסות דרך הנקבוביות ומפעילות תאי עצב בפנים. במשך יותר מ-50 שנה, תגובות אלה תועדו באמצעות טכניקה הנקראת הקלטת טיפים. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות משמעותיות, כולל חוסר היכולת למדוד פעילות עצבית לפני או אחרי מגע גירוי והדרישה לטעימות להיות מסיסות בתמיסות מימיות. אנו מתארים כאן טכניקה שאנו מכנים הקלטה בסיסית, המתגברת על מגבלות אלה. רישום בסיס מאפשר מדידה של פעילות נוירוני הטעם לפני, במהלך ואחרי הגירוי. לפיכך, הוא מאפשר ניתוח נרחב של תגובות OFF המתרחשות לאחר גירוי טעם. ניתן להשתמש בו כדי לחקור תרכובות הידרופוביות כגון פרומונים ארוכי שרשרת בעלי מסיסות נמוכה מאוד במים. לסיכום, הקלטה בסיסית מציעה את היתרונות של אלקטרופיזיולוגיה חד-חושית כאמצעי למדידת פעילות עצבית - רזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה, ללא צורך בכלים גנטיים - ומתגברת על מגבלות מרכזיות של טכניקת רישום החוד המסורתית.

Introduction

חרקים, כולל זבובי דרוזופילים, ניחנים במערכת טעם מתוחכמת המאפשרת להם לחלץ מידע כימי מורכב מסביבתם. מערכת זו מאפשרת להם להבחין בהרכב הכימי של חומרים שונים, תוך הבחנה בין אלה המזינים לבין אלה המזיקים 1,2.

בליבה של מערכת זו נמצאים מבנים מיוחדים המכונים שערות טעם או סנסילה, הממוקמים אסטרטגית על חלקי גוף שונים. בזבובים דרוזופיליים, סנסילה אלה ממוקמים על התווית, שהיא איבר הטעם העיקרי של ראש הזבוב 1,2,3,4, כמו גם על הרגליים והכנפיים 1,2,5,6. התווית ממוקמת בקצה החוטם ומכילה שתי אונות 4,7,8. כל אונה מכוסה ב-31 חושי טעם המסווגים כקצרים, ארוכים ובינוניים 4,7,8. כל סנסילה זו מאכלסת 2-4 נוירוני טעם 1,2,9,10. נוירוני הטעם האלה מבטאים חברים בלפחות ארבע משפחות גנים שונות, כלומר קולטן גוסטטורי (Gr), קולטן יונוטרופי (Ir), כייס (Ppk) וקולטן פוטנציאלי חולף (Trp) גנים 1,2,11,12,13 . מגוון זה של קולטנים ותעלות מצייד חרקים ביכולת לזהות מגוון רחב של תרכובות כימיות, כולל רמזים לא נדיפים ונדיפים 1,2,14.

במשך יותר מ-50 שנה, מדענים כימתו את התגובה של נוירוני טעם והקולטנים שלהם באמצעות שיטה שנקראת רישום קצה 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. עם זאת, שיטה זו יש מגבלות גדולות. ראשית, פעילות עצבית יכולה להימדד רק במהלך מגע עם הגירוי, ולא לפני או אחרי מגע. מגבלה זו מונעת מדידה של פעילות ספייקינג ספונטנית ומונעת מדידה של תגובות OFF. שנית, ניתן לבדוק רק טעמים מסיסים בתמיסות מימיות.

ניתן להתגבר על מגבלות אלה על ידי טכניקה אלקטרופיזיולוגית חלופית נדירה הנקראת "הקלטת בסיס". כאן אנו מתארים טכניקה זו, שאימצנו משיטה שבה השתמשו מריון-פול ועמיתיה24, ומראים את תכונות קידוד הטעם המכריעות שהיא יכולה כעת למדוד בנוחות14.

Protocol

הפרוטוקול הבא תואם את כל ההנחיות לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ייל.

1. זבובים

  1. מקמו 10-15 זבובים חדשים בבקבוקוני תרבית סטנדרטיים טריים בטמפרטורה של 25°C ולחות יחסית של 60% במחזור בהיר-כהה של 12:12 שעות.
  2. יש להשתמש בזבובים בגיל 3-7 ימים.

2. גירויים כימו-סנסוריים

  1. להשיג גירויים כימו-סנסוריים ברמת הטוהר הגבוהה ביותר הזמינה. אחסן אותם לפי המלצת הספק עד לשימוש.
  2. להמיס גירויים כימו-סנסוריים ולדלל לריכוזים הרצויים במים או בממס רצוי אחר שאינו רעיל כגון שמן פרפין. מערבבים את התמיסות המוכנות למשך שעה לפחות במקרה של תרכובות מוצקות מומסות.

3. זכוכית גירוי נימי

  1. משוך נימי זכוכית כדי להחזיק את הגירוי מנימי זכוכית בורוסיליקט (100 מ"מ אורך, 1 מ"מ קוטר חיצוני, 0.58 מ"מ קוטר פנימי) באמצעות מכשיר מושך פיפטה. יש לשאוף להגיע לקוטר חוד בין 3 מיקרומטר ל-10 מיקרומטר.
  2. מלאו את נימי הזכוכית בתמיסת הגירוי המועדפת באמצעות קצה פיפטה מיקרו-מעמיס. היזהרו להימנע מבועות, אותן ניתן להסיר על ידי הקשה עדינה.
  3. אם הגירוי מתגבש בקצה, נקו או החליפו את נימי גירוי הזכוכית.

4. אלקטרודות התייחסות והקלטה

  1. השתמש במוטות טונגסטן (קוטר 127 מיקרומטר ואורך 76.2 מ"מ) הן לאלקטרודות ייחוס והן לאלקטרודות הקלטה. חדדו את אלקטרודות הייחוס וההקלטה לקוטר של כ-1 מיקרומטר בקצה (הצורות של אלקטרודות אלה מתוארות ב-Delventhal et al.36) על ידי טבילתם שוב ושוב במשך מספר שניות בתמיסת 10% KNO3 (~1 M) או בתמיסת 10% KOH (1.8 M).
    הערה: פתרון זה דורש זרם (0.3-3 mA) כדי להקל על תהליך זה.

5. הכנת הזבוב להקלטת הבסיס

  1. ציירו זבוב בודד מהבקבוקון לתוך שאיפה. משוך את השואף וללכוד את החיה על ידי הנחת אצבע על הקצה.
  2. יש לגרש את הזבוב לתוך קצה פיפטה פלסטיק בנפח 200 מיקרוליטר. שומרים את קצה השואף בקצה הפיפטה, משתמשים בקצה כדי לדחוף את הזבוב קדימה, עם הראש הראשון, לכיוון הקצה הצר של קצה הפיפטה.
  3. חתכו את קצה הפיפטה בכל קצה (כלומר, קדמי ואחורי לחיה) באמצעות סכין גילוח.
  4. השתמשו בחימר או בחתיכת כותנה קטנה כדי לדחוף את הזבוב קדימה עוד יותר, עד שחצי מהראש בולט מקצה קצה הפיפטה החתוך. השתמשו במלקחיים כדי לדחוף בעדינות עד שהתווית בקדמת הראש נחשפת.
  5. קבעו את קצה הפיפטה החתוך על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית באמצעות חימר (איור 1).
  6. מתחת לסטריאומיקרוסקופ, מקמו את התווית לרוחב על פתק כיסוי כך שאונה אחת, יחד עם 31 חושי הטעם שלה, תיחשף (איור 1). החלקת הכיסוי שומרת על התווית במקומה.

6. מתקן אלקטרופיזיולוגיה

  1. בחר חדר להתקנת האסדה בעל טמפרטורה יציבה ולחות יחסית (<70%) ומבודד ממקורות רעש חשמלי ומכני, כגון מקררים וצנטריפוגות.
  2. הניחו את המיקרוסקופ במרכז שולחן נגד רטט.
  3. הצמידו מיקרומניפולטור ידני לטבלה נגד רעידות (איור 2).
  4. חברו מוט מפלדת אל-חלד שמחזיק את אלקטרודת הייחוס של טונגסטן למיקרומניפולטור הידני (איור 2).
  5. חברו מניפולטורים ממונעים – אחד עם מחזיק עבור גשושית אלקטרודת ההקלטה והשני עם מחזיק המחובר למוט נירוסטה עבור נימי הגירוי מזכוכית – לאותו שולחן באמצעות מעמדים (איור 2).
  6. חבר את גשושית אלקטרודות ההקלטה למערכת Intelligent Data Acquisition Controller (IDAC) או למערכת מגבר/דיגיטציה אחרת.
  7. קשר מערכת IDAC זו למחשב בתחנת העבודה.
  8. טחנו את המניפולטורים הידניים והממונעים לאותו מיקום בתוך האסדה.
  9. התקן תוכנת רכישה מתאימה למערכת IDAC במחשב. ודא שמנהלי ההתקן לרכישה דיגיטלית תואמים למערכת ההפעלה (לדוגמה, Windows XP-7, -8 או -10) במחשב.

7. הקלטה מ-taste sensilla

  1. הניחו את שקופית ההכנה על במת המיקרוסקופ עם מטרת הגדלה נמוכה (למשל, פי 10) במקומה. הזיזו את הבמה עד שהתווית תהיה ממוקדת במרכז שדה הראייה, הן בהגדלה נמוכה והן בהגדלה גבוהה (למשל, פי 50).
  2. הכנס את אלקטרודת הייחוס לעין באמצעות מטרת ההגדלה הנמוכה. כדי להחדיר את אלקטרודת הייחוס, כוון את העין בצד הזבוב מול הצד עם אלקטרודת ההקלטה, לדוגמה, אם אלקטרודת ההקלטה מתקרבת מימין, מקם את אלקטרודת הייחוס בעין שמאל. השתמש במיקרומניפולטור ידני להחדרה מדויקת.
  3. מקדו את קצה נימי גירוי הזכוכית במרכז שדה הראייה של מטרות הגדלה נמוכה והגדלה גבוהה באמצעות מיקרומניפולטור ממונע (איור 3).
  4. תחת הגדלה נמוכה, קרב את אלקטרודת ההקלטה לתווית באמצעות מיקרומניפולטור ממונע שני.
  5. תחת הגדלה גבוהה, הכנס את אלקטרודת ההקלטה לבסיס של סנסילום טעם באמצעות מיקרומניפולטור ממונע עד שיישמע צליל של פעילות ירי עצבית מפלט השמע של מערכת IDAC.
  6. לאחר שנוצר אות יציב, התחל להקליט את האות באמצעות התוכנה שמגיעה עם מערכת IDAC (איור 4A-D). כדי להתחיל להקליט, לחץ על התחל להקליט לחצן.
  7. הביאו את קצה נימי זכוכית הגירוי כדי לכסות את קצה חוש הטעם באמצעות המניפולטור הממונע.
  8. כדי לסיים את הגירוי, להסיר את נימי גירוי זכוכית מן sensillum באמצעות מניפולטור ממונע.
  9. סמן את ההתחלה והסוף של הגירוי באופן ידני באמצעות דוושה. הדוושה מחוברת ל-IDAC, והתקשורת שלה עם התוכנה מתאפשרת באמצעות IDAC כדי לסמן את ההתחלה/סוף של הגירוי.

8. ניתוח

  1. השתמש בפונקציות השונות של התוכנה שמגיעה עם מערכת IDAC כדי למיין אוכלוסיות ספייק לפי משרעת (במידת האפשר) ולנתח את דינמיקת התגובה.
    1. כדי לספור קוצים, לחץ לחיצה שמאלית על הקלטת עניין, העלאת חלון לבחירה. בחר קוצים, והתחל חלון נוסף בשם המר גלים לקוצים. הזן שם בשדה חדש ולחץ על הלחצן אישור .
    2. הזנת השם בשדה חדש בשלב 8.1.1 מובילה לתצוגת היסטוגרמה של משרעת . בחר את המשרעת שברצונך לספור ולאחר מכן סגור תצוגה זו. לחץ לחיצה שמאלית כדי להוסיף מונה.
    3. בדוק את הקוצים באופן ידני כדי לאשר מסקנות המבוססות על ניתוח עם תוכנה.
      הערה: התוכנה מאפשרת גם ייצוא נתונים בפורמטים שונים לניתוח נוסף.

תוצאות

איור 4A מראה קוצים ספונטניים שנובעים מסנסילום. הם מתחלקים לשני סוגים המבוססים על משרעת, כאשר הקוצים הגדולים יותר נובעים מתא העצב הרגיש לתרכובות מרות והקוצים הקטנים יותר מתא העצב שמגיב לסוכרים. הקשר בין משרעת ספייק לבין ספציפיות תפקודית אומת על ידי ניסויים גנטיים<...

Discussion

בהקלטות מסוגים מסוימים של סנסילה, זה יכול להיות מאתגר להבדיל בין קוצים של נוירונים שונים. לדוגמה, נוירוני הסוכר והנוירונים המכנו-סנסוריים של S ו-I sensilla מייצרים קוצים בעלי אמפליטודות דומות, מה שמקשה על ההבחנה ביניהם 4,14. אנו מוצאים כי השימוש באלקטרודת רישום טו?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לזינה ברמן על התמיכה, לליסה באיק על ההערות על כתב היד, ולחברים אחרים במעבדת קרלסון על הדיון. עבודה זו נתמכה במענק K01 DC020145 של NIH ל-H.K.M.D; וה-NIH מעניק R01 DC02174, R01 DC04729 ו-R01 DC011697 ל-J.R.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MicroscopeOlympusBX51WIequipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. 
Antivibration TableTMC63-7590E
motorized MicromanipulatorsHarvard Apparatus and Märzhäuser MicromanipulatorsMicromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual MicromanipulatorsMärzhäuser MicromanipulatorsMM33 Micromanipulator
Magnetic standsENCOModel #625-0930
Reference  and recording Electrode HolderOckenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary HolderOckenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended ProbeOckenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus ControllersOckenfels Syntech GmbHStimulus Controller CS 55
Personal ComputerDellVostroCheck for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten RodA-M SystemsCat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday CageElectromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-4
Pipette PullerSutter Instrument CompanyModel P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
StereomicroscopeOlympusVMZ 1x-4xFor fly preparation
p200 Pipette TipsGeneric
Microloader tips EppendorfE5242956003
1 ml SyringeGeneric
Crocodile clips
Power TransformersSTACO ENERGY PRODUCTSSTACO 3PN221BAssembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling ClayGeneric
ForcepsGeneric
Plastic TubingSaint GobainTygon S3™ E-3603
Standard culture vialsArchon ScientificNarrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)Sigma-AldrichCat# 36542

References

  1. Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
  2. Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
  3. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
  4. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  5. He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
  6. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  7. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  8. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
  9. Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
  10. Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  12. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  13. Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
  15. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
  16. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
  17. Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
  18. Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
  19. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
  20. Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
  21. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  22. Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
  23. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  24. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
  25. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  26. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
  27. Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
  28. Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
  29. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
  30. Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  31. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
  32. Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
  33. Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
  34. Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
  35. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  36. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
  37. Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
  38. Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
  39. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved