Gravação de base: uma técnica para analisar as respostas dos neurônios gustativos em Drosophila

Resumo

Um método raramente usado de registro eletrofisiológico, o registro de base, permite a análise de características da codificação do sabor que não podem ser examinadas pelos métodos convencionais de registro. O registro de base também permite a análise das respostas gustativas a estímulos hidrofóbicos que não podem ser estudados usando métodos eletrofisiológicos tradicionais.

Resumo

Os insetos saboreiam o mundo externo através de pêlos gustativos, ou sensilas, que têm poros nas pontas. Quando um sensillum entra em contato com uma fonte potencial de alimento, os compostos da fonte de alimento entram pelo poro e ativam os neurônios internos. Por mais de 50 anos, essas respostas foram registradas usando uma técnica chamada registro de pontas. No entanto, esse método tem grandes limitações, incluindo a incapacidade de medir a atividade neural antes ou depois do contato com o estímulo e a exigência de que os saborizantes sejam solúveis em soluções aquosas. Descrevemos aqui uma técnica que chamamos de gravação de base, que supera essas limitações. O registro de base permite a medição da atividade dos neurônios gustativos antes, durante e depois do estímulo. Assim, permite uma análise extensiva das respostas OFF que ocorrem após um estímulo gustativo. Pode ser usado para estudar compostos hidrofóbicos, como feromônios de cadeia longa, que têm solubilidade muito baixa em água. Em resumo, o registro de base oferece as vantagens da eletrofisiologia de sentido único como meio de medir a atividade neuronal - alta resolução espacial e temporal, sem a necessidade de ferramentas genéticas - e supera as principais limitações da técnica tradicional de registro de pontas.

Introdução

Os insetos, incluindo as moscas drosofilídeos, são dotados de um sofisticado sistema gustativo que lhes permite extrair informações químicas complexas do ambiente. Esse sistema permite discernir a composição química de várias substâncias, distinguindo entre as nutritivas e as nocivas ^1,2.

No centro desse sistema estão estruturas especializadas conhecidas como pêlos gustativos ou sensilas, estrategicamente localizadas em várias partes do corpo. Nas moscas drosofilídeos, essas sensilas estão localizadas no labelo, que é o principal órgão gustativo da cabeça da mosca^<....

Protocolo

O protocolo a seguir está em conformidade com todas as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Yale.

1. Moscas

1. Coloque 10-15 moscas recém-emergidas em frascos de cultura padrão frescos a 25 ° C e 60% de umidade relativa em um ciclo claro-escuro de 12:12 h.
2. Use moscas quando tiver 3-7 dias de idade.

2. Estímulos quimiossensoriais

1. Obtenha estímulos quimiossensoriais da mais alta pureza disponível. Armazene-os conforme recomendado pelo fornecedor até o uso.
2. Dissolva os estímulos quimiossensoriais e dilua até as concentraçõe....

Resultados

A Figura 4A mostra picos espontâneos que surgem de um sensillum. Eles se enquadram em duas classes com base na amplitude, com os picos maiores derivados do neurônio que é sensível a compostos amargos e os picos menores do neurônio que responde aos açúcares. A relação entre a amplitude do pico e a especificidade funcional foi corroborada por experimentos genéticos 4,14,37,38,39.<.......

Discussão

Em gravações de alguns tipos de sensilas, pode ser um desafio diferenciar os picos de diferentes neurônios. Por exemplo, os neurônios de açúcar e os neurônios mecanossensoriais das sensilas S e I produzem picos de amplitudes semelhantes, dificultando a distinção ^4,14. Descobrimos que o uso de um eletrodo de gravação de tungstênio muito afiado reduz o disparo do neurônio mecanossensorial, assim como a colocação criteriosa do eletrodo de gravação. .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces.
Antivibration Table	TMC	63-7590E
motorized Micromanipulators	Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators	Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual Micromanipulators	Märzhäuser Micromanipulators	MM33 Micromanipulator
Magnetic stands	ENCO	Model #625-0930
Reference  and recording Electrode Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary Holder	Ockenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended Probe	Ockenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4	Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus Controllers	Ockenfels Syntech GmbH	Stimulus Controller CS 55
Personal Computer	Dell	Vostro	Check for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten Rod	A-M Systems	Cat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday Cage			Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Pipette Puller	Sutter Instrument Company	Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Stereomicroscope	Olympus	VMZ 1x-4x	For fly preparation
p200 Pipette Tips			Generic
Microloader tips	Eppendorf	E5242956003
1 ml Syringe			Generic
Crocodile clips
Power Transformers	STACO ENERGY PRODUCTS	STACO 3PN221B	Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay			Generic
Forceps			Generic
Plastic Tubing	Saint Gobain	Tygon S3™ E-3603
Standard culture vials	Archon Scientific		Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)	Sigma-Aldrich	Cat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)	Sigma-Aldrich	Cat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)	Sigma-Aldrich	Cat# 36542