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  • Agradecimentos
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  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Um método raramente usado de registro eletrofisiológico, o registro de base, permite a análise de características da codificação do sabor que não podem ser examinadas pelos métodos convencionais de registro. O registro de base também permite a análise das respostas gustativas a estímulos hidrofóbicos que não podem ser estudados usando métodos eletrofisiológicos tradicionais.

Resumo

Os insetos saboreiam o mundo externo através de pêlos gustativos, ou sensilas, que têm poros nas pontas. Quando um sensillum entra em contato com uma fonte potencial de alimento, os compostos da fonte de alimento entram pelo poro e ativam os neurônios internos. Por mais de 50 anos, essas respostas foram registradas usando uma técnica chamada registro de pontas. No entanto, esse método tem grandes limitações, incluindo a incapacidade de medir a atividade neural antes ou depois do contato com o estímulo e a exigência de que os saborizantes sejam solúveis em soluções aquosas. Descrevemos aqui uma técnica que chamamos de gravação de base, que supera essas limitações. O registro de base permite a medição da atividade dos neurônios gustativos antes, durante e depois do estímulo. Assim, permite uma análise extensiva das respostas OFF que ocorrem após um estímulo gustativo. Pode ser usado para estudar compostos hidrofóbicos, como feromônios de cadeia longa, que têm solubilidade muito baixa em água. Em resumo, o registro de base oferece as vantagens da eletrofisiologia de sentido único como meio de medir a atividade neuronal - alta resolução espacial e temporal, sem a necessidade de ferramentas genéticas - e supera as principais limitações da técnica tradicional de registro de pontas.

Introdução

Os insetos, incluindo as moscas drosofilídeos, são dotados de um sofisticado sistema gustativo que lhes permite extrair informações químicas complexas do ambiente. Esse sistema permite discernir a composição química de várias substâncias, distinguindo entre as nutritivas e as nocivas 1,2.

No centro desse sistema estão estruturas especializadas conhecidas como pêlos gustativos ou sensilas, estrategicamente localizadas em várias partes do corpo. Nas moscas drosofilídeos, essas sensilas estão localizadas no labelo, que é o principal órgão gustativo da cabeça da mosca 1,2,3,4, bem como nas pernas e asas 1,2,5,6. O labelo está localizado na ponta da tromba e contém dois lobos 4,7,8. Cada lóbulo é coberto com 31 sensilas gustativas categorizadas como curtas, longas e intermediárias 4,7,8. Cada uma dessas sensilas abriga 2-4 neurônios gustativos 1,2,9,10. Esses neurônios gustativos expressam membros de pelo menos quatro famílias de genes diferentes, a saber, os genes do receptor gustativo (Gr), receptor ionotrópico (Ir), batedor de carteira (Ppk) e potencial receptor transitório (Trp) 1,2,11,12,13. Essa diversidade de receptores e canais equipa os insetos com a capacidade de reconhecer uma ampla gama de compostos químicos, incluindo pistas não voláteis e voláteis 1,2,14.

Por mais de 50 anos, os cientistas quantificaram a resposta dos neurônios gustativos e seus receptores usando uma técnica chamada registro de ponta 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. No entanto, esse método tem grandes limitações. Primeiro, a atividade neural pode ser medida apenas durante o contato com o estímulo, e não antes ou depois do contato. Essa limitação impede a medição da atividade espontânea de pico e impede a medição das respostas OFF. Em segundo lugar, apenas os saborizantes solúveis em soluções aquosas podem ser testados.

Essas limitações podem ser superadas por uma técnica eletrofisiológica alternativa raramente usada chamada "registro de base". Aqui descrevemos essa técnica, que adaptamos de um método usado por Marion-Poll e colegas24, e mostramos os recursos cruciais de codificação de sabor que agora podem ser convenientemente medidos14.

Protocolo

O protocolo a seguir está em conformidade com todas as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Yale.

1. Moscas

  1. Coloque 10-15 moscas recém-emergidas em frascos de cultura padrão frescos a 25 ° C e 60% de umidade relativa em um ciclo claro-escuro de 12:12 h.
  2. Use moscas quando tiver 3-7 dias de idade.

2. Estímulos quimiossensoriais

  1. Obtenha estímulos quimiossensoriais da mais alta pureza disponível. Armazene-os conforme recomendado pelo fornecedor até o uso.
  2. Dissolva os estímulos quimiossensoriais e dilua até as concentrações desejadas em água ou outro solvente não tóxico desejado, como óleo de parafina. Agitar as soluções preparadas durante um mínimo de 1 h no caso de compostos sólidos dissolvidos.

3. Capilar de estímulo de vidro

  1. Puxe um capilar de vidro para reter o estímulo de um capilar de vidro de borossilicato (100 mm de comprimento, 1 mm de diâmetro externo, 0.58 mm de diâmetro interno) usando um instrumento extrator de pipeta. Procure obter um diâmetro de ponta entre 3 μm e 10 μm.
  2. Encha o capilar de vidro com a solução de estímulo preferida usando uma ponta de pipeta microcarregadora. Tome cuidado para evitar bolhas, que podem ser removidas batendo suavemente.
  3. Se o estímulo cristalizar na ponta, limpe ou substitua o capilar do estímulo de vidro.

4. Eletrodos de referência e registro

  1. Use hastes de tungstênio (127 μm de diâmetro e 76.2 mm de comprimento) para eletrodos de referência e registro. Afie os eletrodos de referência e registro com aproximadamente 1 μm de diâmetro na ponta (as formas desses eletrodos são representadas em Delventhal et al.36) mergulhando-os repetidamente por vários segundos em uma solução de KNO3 a 10% (~ 1 M) ou uma solução de KOH a 10% (1,8 M).
    NOTA: Esta solução requer corrente (0.3-3 mA) para facilitar este processo.

5. Preparação da mosca para gravação de base

  1. Desenhe uma única mosca do frasco para um aspirador. Retire o aspirador e prenda o animal colocando um dedo sobre a extremidade.
  2. Expulse a mosca para uma ponta de pipeta de plástico de 200 μL. Mantendo a extremidade do aspirador na ponta da pipeta, use a extremidade para empurrar a mosca para frente, de cabeça, em direção à extremidade estreita da ponta da pipeta.
  3. Apare a ponta da pipeta em cada extremidade (ou seja, anterior e posterior ao animal) usando uma lâmina de barbear.
  4. Use argila ou um pequeno pedaço de algodão para empurrar a mosca para frente, até que metade da cabeça se projete da extremidade da ponta da pipeta aparada. Use uma pinça para empurrar suavemente até que o labelo na frente da cabeça fique exposto.
  5. Fixe a ponta da pipeta aparada em uma lâmina de microscópio de vidro usando argila (Figura 1).
  6. Sob o estereomicroscópio, posicione o labelo lateralmente em uma lamínula de modo que um lóbulo, junto com sua sensila gustativa, fique exposto (Figura 1). A lamínula mantém o labelo no lugar.

6. Equipamento da eletrofisiologia

  1. Selecione uma sala para a configuração da plataforma que tenha temperatura e umidade relativa estáveis (<70%) e esteja isolada de fontes de ruído elétrico e mecânico, como geladeiras e centrífugas.
  2. Coloque o microscópio no centro de uma mesa antivibração.
  3. Prenda um micromanipulador manual à mesa antivibração (Figura 2).
  4. Conecte um eixo de aço inoxidável que prende o eletrodo de referência de tungstênio ao micromanipulador manual (Figura 2).
  5. Conecte os manipuladores motorizados - um com um suporte para a sonda do eletrodo de registro e um segundo com um suporte conectado a um eixo de aço inoxidável para o capilar de estímulo de vidro - à mesma mesa usando suportes (Figura 2).
  6. Conecte a sonda do eletrodo de gravação a um sistema Intelligent Data Acquisition Controller (IDAC) ou outro sistema amplificador/digitalizador.
  7. Conecte este sistema IDAC ao computador na estação de trabalho.
  8. Aterre os manipuladores manuais e motorizados no mesmo local dentro da plataforma.
  9. Instale o software de aquisição apropriado para o sistema IDAC no computador. Certifique-se de que os drivers de aquisição digital sejam compatíveis com o sistema operacional (por exemplo, Windows XP-7, -8 ou -10) no computador.

7. Gravação de sensila gustativa

  1. Coloque a lâmina de preparação na platina do microscópio com uma objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 10x) na posição. Mova o palco até que o labelo esteja em foco no centro do campo de visão em objetivas de baixa e alta ampliação (por exemplo, 50x).
  2. Insira o eletrodo de referência no olho usando a objetiva de baixa ampliação. Para inserir o eletrodo de referência, mire no olho do lado da mosca oposto ao lado com o eletrodo de registro, por exemplo, se o eletrodo de registro estiver se aproximando da direita, coloque o eletrodo de referência no olho esquerdo. Utilize um micromanipulador manual para uma inserção precisa.
  3. Traga a ponta do capilar de estímulo de vidro em foco no centro do campo de view de objetivas de baixa e alta ampliação usando um micromanipulador motorizado (Figura 3).
  4. Em baixa ampliação, aproxime o eletrodo de gravação do labelo usando um segundo micromanipulador motorizado.
  5. Sob alta ampliação, insira o eletrodo de gravação na base de um sensillum gustativo usando o micromanipulador motorizado até que o som da atividade de disparo neuronal da saída de áudio do sistema IDAC seja ouvido.
  6. Uma vez estabelecido um sinal estável, comece a gravar o sinal usando o software que acompanha o sistema IDAC (Figura 4A-D). Para iniciar a gravação, pressione o botão Iniciar gravação.
  7. Traga a ponta do capilar de vidro de estímulo para cobrir a ponta do sensillum gustativo usando o manipulador motorizado.
  8. Para finalizar o estímulo, remova o capilar de estímulo de vidro do sensillum usando o manipulador motorizado.
  9. Marque o início e o fim da estimulação manualmente usando um pedal. O pedal é conectado ao IDAC, e sua comunicação com o software é facilitada através do IDAC para marcar o início/fim do estímulo.

8. Análise

  1. Use as diferentes funções do software que acompanha o sistema IDAC para classificar as populações de pico por amplitude (quando possível) e analisar a dinâmica da resposta.
    1. Para contar picos, clique com o botão esquerdo do mouse na gravação de interesse, abrindo uma janela para selecionar. Escolha Para picos, iniciando outra janela chamada Converter ondas em picos. Digite um nome no campo Novo e pressione o botão OK .
    2. Inserir o nome no campo Novo na etapa 8.1.1 leva à visualização do histograma de amplitude . Escolha a amplitude a ser contada e feche essa visualização. Clique com o botão esquerdo para adicionar um contador.
    3. Examine os picos manualmente para confirmar as conclusões com base na análise com software.
      NOTA: O software também permite a exportação de dados em diferentes formatos para posterior análise.

Resultados

A Figura 4A mostra picos espontâneos que surgem de um sensillum. Eles se enquadram em duas classes com base na amplitude, com os picos maiores derivados do neurônio que é sensível a compostos amargos e os picos menores do neurônio que responde aos açúcares. A relação entre a amplitude do pico e a especificidade funcional foi corroborada por experimentos genéticos 4,14,37,38,39.<...

Discussão

Em gravações de alguns tipos de sensilas, pode ser um desafio diferenciar os picos de diferentes neurônios. Por exemplo, os neurônios de açúcar e os neurônios mecanossensoriais das sensilas S e I produzem picos de amplitudes semelhantes, dificultando a distinção 4,14. Descobrimos que o uso de um eletrodo de gravação de tungstênio muito afiado reduz o disparo do neurônio mecanossensorial, assim como a colocação criteriosa do eletrodo de gravação. ...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a Zina Berman pelo apoio, a Lisa Baik pelos comentários sobre o manuscrito e a outros membros do laboratório Carlson pela discussão. Este trabalho foi apoiado pela concessão K01 do NIH DC020145 para HKMD; e o NIH concede R01 DC02174, R01 DC04729 e R01 DC011697 para J.R.C.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
MicroscopeOlympusBX51WIequipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. 
Antivibration TableTMC63-7590E
motorized MicromanipulatorsHarvard Apparatus and Märzhäuser MicromanipulatorsMicromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual MicromanipulatorsMärzhäuser MicromanipulatorsMM33 Micromanipulator
Magnetic standsENCOModel #625-0930
Reference  and recording Electrode HolderOckenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary HolderOckenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended ProbeOckenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus ControllersOckenfels Syntech GmbHStimulus Controller CS 55
Personal ComputerDellVostroCheck for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten RodA-M SystemsCat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday CageElectromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-4
Pipette PullerSutter Instrument CompanyModel P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
StereomicroscopeOlympusVMZ 1x-4xFor fly preparation
p200 Pipette TipsGeneric
Microloader tips EppendorfE5242956003
1 ml SyringeGeneric
Crocodile clips
Power TransformersSTACO ENERGY PRODUCTSSTACO 3PN221BAssembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling ClayGeneric
ForcepsGeneric
Plastic TubingSaint GobainTygon S3™ E-3603
Standard culture vialsArchon ScientificNarrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)Sigma-AldrichCat# 36542

Referências

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