JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Редко используемый метод электрофизиологической записи, базовая запись, позволяет анализировать особенности кодирования вкуса, которые не могут быть исследованы обычными методами записи. Регистрация оснований также позволяет анализировать вкусовые реакции на гидрофобные стимулы, которые не могут быть изучены с помощью традиционных электрофизиологических методов.

Аннотация

Насекомые пробуют внешний мир через вкусовые волоски, или сенсиллы, которые имеют поры на кончиках. Когда сенсиллум вступает в контакт с потенциальным источником пищи, соединения из источника пищи проникают через поры и активируют нейроны внутри. На протяжении более 50 лет эти ответы записывались с помощью техники, называемой записью наконечников. Однако этот метод имеет серьезные ограничения, в том числе невозможность измерения нейронной активности до или после контакта со стимулом и требование, чтобы вкусовые вещества растворялись в водных растворах. Здесь мы описываем технику, которую мы называем базовой записью, которая преодолевает эти ограничения. Базовая запись позволяет измерять активность вкусовых нейронов до, во время и после стимула. Таким образом, он позволяет проводить обширный анализ реакций OFF, которые возникают после вкусового стимула. Его можно использовать для изучения гидрофобных соединений, таких как длинноцепочечные феромоны, которые имеют очень низкую растворимость в воде. Таким образом, регистрация оснований предлагает преимущества электрофизиологии с одним сенсиллумом в качестве средства измерения активности нейронов - высокое пространственное и временное разрешение, без необходимости использования генетических инструментов - и преодолевает ключевые ограничения традиционной техники записи зондов.

Введение

Насекомые, в том числе дрозофилы, наделены сложной системой вкуса, которая позволяет им извлекать сложную химическую информацию из окружающей среды. Эта система позволяет им различать химический состав различных веществ, различая питательные и вредные 1,2.

В основе этой системы лежат специализированные структуры, известные как вкусовые волоски или сенсиллы, стратегически расположенные на различных частях тела. У мух-дрозофил эти сенсиллы расположены на лабеллуме, который является основным органом вкуса головы мухи 1,2,3,4, а также на ногах и крыльях 1,2,5,6. Лабеллум расположен на кончике хоботка и содержит две лопасти 4,7,8. Каждая доля покрыта 31 вкусовой сенсиллой, классифицируемой как короткая, длинная и промежуточная 4,7,8. Каждая из этих сенсилл содержит 2-4 вкусовых нейрона: 1,2,9,10. Эти вкусовые нейроны экспрессируют членов по крайней мере четырех различных семейств генов, а именно: вкусовых рецепторов (Gr), ионотропных рецепторов (Ir), карманных (Ppk) и транзиторных рецепторных потенциалов (Trp) 1,2,11,12,13 . Это разнообразие рецепторов и каналов наделяет насекомых способностью распознавать широкий спектр химических соединений, включая как нелетучие, так и летучие сигналы 1,2,14.

На протяжении более 50 лет ученые количественно оценивали реакцию вкусовых нейронов и их рецепторов, используя технику, называемую записью наконечников 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Однако этот метод имеет серьезные ограничения. Во-первых, нейронную активность можно измерить только во время контакта со стимулом, а не до или после контакта. Это ограничение исключает измерение спонтанной спайковой активности и предотвращает измерение реакций OFF. Во-вторых, тестировать можно только вкусовые вещества, растворимые в водных растворах.

Эти ограничения могут быть преодолены с помощью редко используемого альтернативного электрофизиологического метода, называемого «записью оснований». Здесь мы опишем эту технику, которую мы адаптировали из метода, используемого Марион-Полл и коллегами24, и покажем важнейшие особенности кодирования вкуса, которые теперь можно удобно измерить14.

протокол

Следующий протокол соответствует всем рекомендациям по уходу за животными Йельского университета.

1. Мухи

  1. Поместите 10-15 вновь появившихся мух в свежие стандартные флаконы с культурой при температуре 25 °C и относительной влажности 60% в цикле 12:12 ч свет-темнота.
  2. Используйте мух в возрасте 3-7 дней.

2. Хемосенсорные стимулы

  1. Получить хемосенсорные стимулы высочайшей доступной чистоты. Храните их в соответствии с рекомендациями продавца до использования.
  2. Растворите хемосенсорные стимулы и разбавьте до желаемой концентрации в воде или другом желаемом нетоксичном растворителе, таком как парафиновое масло. Приготовленные растворы перемешивать не менее 1 ч в случае растворенных твердых соединений.

3. Капилляр стеклянного стимула

  1. Потяните за стеклянный капилляр, чтобы удерживать стимул от капилляра из боросиликатного стекла (длина 100 мм, внешний диаметр 1 мм, внутренний диаметр 0,58 мм) с помощью инструмента для вытягивания пипетки. Стремитесь достичь диаметра наконечника от 3 до 10 μм.
  2. Заполните стеклянный капилляр предпочтительным раствором стимула с помощью наконечника для дозатора микрозагрузчика. Следите за тем, чтобы не было пузырей, которые можно удалить легким постукиванием.
  3. Если стимул кристаллизуется на кончике, очистите или замените капилляр стеклянного стимула.

4. Электроды сравнения и записи

  1. Используйте вольфрамовые стержни (диаметр 127 мкм и длина 76,2 мм) как для сравнения, так и для записывающих электродов. Заточите электроды сравнения и записывающие электроды примерно до 1 мкм в диаметре на кончике (формы этих электродов изображены в Delventhal et al.36) путем многократного погружения их в течение нескольких секунд либо в 10%-ный растворKNO3 (~1 М), либо в 10%-ный раствор KOH (1,8 М).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого раствора требуется ток (0,3-3 мА) для облегчения этого процесса.

5. Подготовка мухи к базовой записи

  1. Вытащите одну муху из флакона в аспиратор. Извлеките аспиратор и поймайте животное, положив палец на конец.
  2. Поместите муху в пластиковый наконечник для дозатора объемом 200 μл. Удерживая конец аспиратора в наконечнике пипетки, используйте конец, чтобы протолкнуть муху вперед, головой вперед, к узкому концу наконечника пипетки.
  3. Обрежьте наконечник пипетки с каждого конца (т. е. спереди и сзади животного) лезвием бритвы.
  4. Используйте глину или небольшой кусочек ваты, чтобы продвинуть муху вперед, пока половина головки не выступит из конца обрезанного кончика пипетки. С помощью щипцов осторожно надавливайте, пока не обнажится лабеллум в передней части головы.
  5. Закрепите обрезанный наконечник пипетки на предметном стекле стеклянного микроскопа с помощью глины (рисунок 1).
  6. Под стереомикроскопом расположите лабеллум сбоку на покровном стеколе так, чтобы одна доля вместе с ее 31 вкусовой сенсиллой была открыта (рис. 1). Крышка удерживает лабеллум на месте.

6. Электрофизиологический стенд

  1. Выберите помещение для установки буровой установки со стабильной температурой и относительной влажностью (<70%) и изолированное от источников электрического и механического шума, таких как холодильники и центрифуги.
  2. Поместите микроскоп в центр антивибрационного стола.
  3. Закрепите ручной микроманипулятор на антивибрационном столе (рис. 2).
  4. Прикрепите к ручному микроманипулятору стержень из нержавеющей стали, который удерживает вольфрамовый электрод сравнения (рис. 2).
  5. Подсоедините моторизованные манипуляторы - один с держателем для зонда регистрирующего электрода, а второй с держателем, соединенным с стержнем из нержавеющей стали для капилляра стеклянного стимула - к одному столу с помощью подставок (рис. 2).
  6. Подключите датчик записывающего электрода к системе интеллектуального контроллера сбора данных (IDAC) или другой системе усилителя/дигитайзера.
  7. Свяжите эту систему IDAC с компьютером на рабочей станции.
  8. Заземлите ручные и моторизованные манипуляторы в одном и том же месте на буровой установке.
  9. Установите на компьютер соответствующее программное обеспечение для сбора данных для системы IDAC. Убедитесь, что драйверы цифрового сбора данных совместимы с операционной системой (например, Windows XP-7, -8 или -10) на компьютере.

7. Запись от вкусовой сенсиллы

  1. Поместите предметное стекло на предметное стекло микроскопа объективом с малым увеличением (например, 10-кратным). Перемещайте предметный столик до тех пор, пока лабеллум не окажется в фокусе в центре поля зрения как при малом, так и при большом увеличении (например, 50-кратном) объективах.
  2. Вставьте электрод сравнения в глаз с помощью объектива с малым увеличением. Чтобы вставить электрод сравнения, нацельтесь на глаз со стороны мухи, противоположной стороне записывающего электрода, например, если записывающий электрод приближается справа, поместите электрод сравнения в левый глаз. Используйте ручной микроманипулятор для точного введения.
  3. Сфокусируйте кончик капилляра стеклянного стимула в центре поля зрения объективов как с малым, так и с большим увеличением с помощью моторизованного микроманипулятора (рис. 3).
  4. При малом увеличении поднесите записывающий электрод близко к лабеллуму с помощью второго моторизованного микроманипулятора.
  5. При большом увеличении вставьте записывающий электрод в основание вкусового сенсиллума с помощью моторизованного микроманипулятора до тех пор, пока не будет слышен звук активности нейронов на аудиовыходе системы IDAC.
  6. После установления стабильного сигнала начните запись сигнала с помощью программного обеспечения, поставляемого с системой IDAC (Рисунок 4A-D). Чтобы начать запись, нажмите кнопку Начать запись.
  7. Подведите кончик стеклянного капилляра стимула к покрытию кончика вкусового сенсиллума с помощью моторизованного манипулятора.
  8. Чтобы закончить раздражитель, удалите капилляр стеклянного стимула из сенсиллума с помощью моторизованного манипулятора.
  9. Отметьте начало и конец стимуляции вручную с помощью педали. Педаль подключена к IDAC, и ее связь с программным обеспечением облегчается через IDAC для обозначения начала/конца стимула.

8. Анализ

  1. Используйте различные функции программного обеспечения, поставляемого с системой IDAC, для сортировки популяций спайков по амплитуде (когда это возможно) и анализа динамики отклика.
    1. Чтобы подсчитать всплески, щелкните левой кнопкой мыши по интересующей записи, открыв окно для выбора. Выберите To Spikes, запустив другое окно под названием Convert waves to spikes. Введите имя в поле Новый и нажмите кнопку ОК .
    2. Ввод имени в поле Новый на шаге 8.1.1 приведет к представлению Амплитудная гистограмма . Выберите амплитуду для подсчета, затем закройте это представление. Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы добавить счетчик.
    3. Изучите пики вручную, чтобы подтвердить выводы на основе анализа с помощью программного обеспечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение также позволяет экспортировать данные в различных форматах для дальнейшего анализа.

Результаты

На рисунке 4А показаны спонтанные спайки, которые возникают из сенсиллума. Они делятся на два класса в зависимости от амплитуды: более крупные спайки происходят от нейрона, который чувствителен к горьким соединениям, и меньшие спайки от нейрона, который реагирует на сах?...

Обсуждение

В записях от некоторых типов сенсилл может быть сложно дифференцировать шипы разных нейронов. Например, сахарные нейроны и механосенсорные нейроны S и I сенсиллы производят спайки одинаковых амплитуд, что затрудняет их различие 4,14. Мы обнаружили, что исп?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы благодарим Зину Берман за поддержку, Лизу Байк за комментарии к рукописи и других членов лаборатории Карлсона за обсуждение. Эта работа была поддержана грантом NIH K01 DC020145 H.K.M.D.; и NIH предоставляет R01 DC02174, R01 DC04729 и R01 DC011697 J.R.C.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
MicroscopeOlympusBX51WIequipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. 
Antivibration TableTMC63-7590E
motorized MicromanipulatorsHarvard Apparatus and Märzhäuser MicromanipulatorsMicromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual MicromanipulatorsMärzhäuser MicromanipulatorsMM33 Micromanipulator
Magnetic standsENCOModel #625-0930
Reference  and recording Electrode HolderOckenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary HolderOckenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended ProbeOckenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus ControllersOckenfels Syntech GmbHStimulus Controller CS 55
Personal ComputerDellVostroCheck for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten RodA-M SystemsCat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday CageElectromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-4
Pipette PullerSutter Instrument CompanyModel P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
StereomicroscopeOlympusVMZ 1x-4xFor fly preparation
p200 Pipette TipsGeneric
Microloader tips EppendorfE5242956003
1 ml SyringeGeneric
Crocodile clips
Power TransformersSTACO ENERGY PRODUCTSSTACO 3PN221BAssembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling ClayGeneric
ForcepsGeneric
Plastic TubingSaint GobainTygon S3™ E-3603
Standard culture vialsArchon ScientificNarrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)Sigma-AldrichCat# 36542

Ссылки

  1. Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
  2. Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
  3. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
  4. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  5. He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
  6. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  7. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  8. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
  9. Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
  10. Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  12. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  13. Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
  15. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
  16. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
  17. Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
  18. Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
  19. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
  20. Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
  21. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  22. Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
  23. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  24. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
  25. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  26. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
  27. Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
  28. Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
  29. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
  30. Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  31. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
  32. Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
  33. Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
  34. Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
  35. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  36. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
  37. Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
  38. Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
  39. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены