JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولا تجريبيا مفصلا لقياس محتوى الكربون في البلاعم في مجرى الهواء بهدف تقييم جرعة التعرض الداخلي على مستوى التعرض للجسيمات الفردية.

Abstract

تظهر البلاعم الرئوية نمطا يعتمد على الجرعة في جزيئات البلعمة. بعد الابتلاع ، تفرز هذه البلاعم لاحقا بالبلغم ، مما يجعل البلاعم والجسيمات مرئية وقابلة للقياس الكمي تحت الفحص المجهري الضوئي. والجدير بالذكر أن عنصر الكربون داخل جسم الثدييات ينشأ حصريا من الملوثات الخارجية. وبالتالي ، فإن محتوى الكربون في البلاعم في مجرى الهواء (CCAM) يعمل كمؤشر حيوي صالح للتعرض ، حيث يقدر بدقة التعرض الفردي للجسيمات المحتوية على الكربون (PM). تحدد هذه المقالة بروتوكولا يتضمن جمع البلغم وحفظه ومعالجته وإعداد الشرائح والتلوين ، بالإضافة إلى الحصول على صور البلاعم وتحليلها. بعد إزالة نوى البلاعم ، تم حساب نسبة مساحة السيتوبلازم التي تشغلها جزيئات الكربون (PCOC) لتحديد محتوى الكربون في كل ضامة. تشير النتائج إلى ارتفاع في مستويات CCAM بعد التعرض للجليلات الجسيمة المحتوية على الكربون. باختصار ، تتيح هذه الطريقة غير الغازية والدقيقة والموثوقة والموحدة القياس المباشر لجزيئات الكربون داخل الخلايا المستهدفة ويتم استخدامها للقياس الكمي على نطاق واسع ل CCAM الفردي من خلال البلغم المستحث.

Introduction

يرتبط تلوث الهواء المحيط بالوفيات الناجمة عن أمراض الجهاز التنفسي والقلب والأوعية الدموية ، مما يشكل تهديدا خطيرا لصحةالإنسان 1،2. وتشير البيانات الوبائية إلى أن التعرض المزمن للجسيمات المحيطة التي يقل قطرها عن أو يساوي 2.5 ميكرومتر (PM2.5) هو المسؤول عن الوفيات المبكرة لما بين 4 و9 ملايين شخص على الصعيد العالمي. تم تصنيف PM2.5 كخامس أهم عامل خطر للوفيات العالمية في دراسة العبء العالمي للأمراض والإصابات وعوامل الخطر (GBD) لعام 2015 3 ، 4 ، 5 ، 6. وقد وجدت الدراسات أن الالتزام بالمبادئ التوجيهية لمنظمة الصحة العالمية بشأن تلوث الهواء يمكن أن يمنع 51,213 حالة وفاة سنويا من التعرض لجسيمات الجسيمات الدقيقة2.5 3. في الوقت الحالي، تفتقر معظم الدراسات إلى تقييم التعرض داخل الأفراد وتستند فقط إلى تقييمات أولية في مواقع مراقبة إقليمية أكبر، وهي بعيدة كل البعد عن مستويات التعرض الفردي. لا تعكس المؤشرات الحيوية المتاحة للتعرض الداخلي ، مثل الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات البولية والبنزو (أ) بيرين ، الارتباطات بين التعرض للجسيمات والآثار الصحية7 ، 8 ، 9. هذا يؤدي إلى عدم القدرة على إقامة علاقة دقيقة مع الآثار الصحية. لذلك ، فإن البحث عن العلامات التي تعكس مستوى التعرض للجسيمات لدى الفرد هو أحد مفاتيح تقييم التعرض الدقيق للأفراد.

يمكن إفراز الجسيمات المستنشقة في الشعب الهوائية مع البلغم من خلال التذبذبات الهدبية في الشعب الهوائية. يعني عدم وجود نظام نقل تدفق مخاطي مهدب في الحويصلات الهوائية أن طريق الخلوص الأساسي للجسيمات التي تدخل الحويصلات الهوائية يكون من خلال البلعمة والانتقال بواسطة الضامة10،11. بناء على التركيب التشريحي للرئة ، فإن تطهيرها للجسيمات الغريبة غير القابلة للذوبان بطيئة. هذا يسمح للجسيمات بالتفاعل مع خلايا الرئة لفترات طويلة وبدء تأثيرات بيولوجية مختلفة ، مما يتسبب في تلف أنسجة الرئة والأعضاء الأخرى12،13. يؤدي التحفيز بواسطة الجسيمات إلى تنشيط البلاعم ، مما يؤدي إلى سلسلة من العوامل الالتهابية في الرئتين التي يمكن أن تسبب استجابة التهابية جهازية14. بالنظر إلى الدور الحاسم للالتهام الخلوي للبلاعم في إثارة عواصف السيتوكين في الرئتين ، يفترض أن جزيئات الكربون من البلاعم الرئوية يمكن أن تعكس الجرعة الفعالة بيولوجيا للتعرض للجسيمات المحمولة جوا بنواة الكربون15. علاوة على ذلك ، نظرا لعدم وجود تراكم للكربون الأولي في خلايا الثدييات ويمكن ملاحظة الجسيمات المحتوية على الكربون كجسيمات سوداء تحت المجهر الضوئي ، فإن جمع الضامة السنخية والشعب الهوائية وقياس محتوى الكربون فيها يمكن أن يكون بمثابة علامة لتقييم التعرض للجسيمات16.

حددت هذه الدراسة طريقة لتقييم مستويات التعرض للجسيمات الفردية بدقة ، والمعروفة باسم محتوى الكربون في ضامة مجرى الهواء (CCAM). على وجه التحديد ، تم جمع عينات البلغم السكاني بعد أن استنشق المشاركون محلول ملحي مفرط التوتر الناتج عن البخاخات بالموجات فوق الصوتية. ثم تم حفظ هذه العينات باستخدام محلول تثبيتي. تم عزل البلاعم في مجرى الهواء وتلطيخها وتصويرها تحت المجهر الضوئي لتحديد البلاعم التي تحتوي على جزيئات تحتوي على الكربون ، والتي تم تحديدها بعد ذلك. توفر هذه الطريقة علامة بيولوجية لتقييم مستويات التعرض للجسيمات الفردية بدقة. وهو يؤسس أساسا منهجيا للتحقيق في العلاقة بين التعرض للجسيمات والآثار الصحية ، ويعمل كأساس بحثي لاستكشاف الارتباطات بين التعرض للجسيمات والنتائج الصحية مثل أمراض الرئة.

Protocol

حصلت الدراسة على موافقة لجنة أخلاقيات الطب التابعة لمعهد الصحة المهنية ومكافحة السموم ، المركز الصيني لمكافحة الأمراض والوقاية منها (NIOHP201604) ، مع الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع الأشخاص قبل الدراسة وجمع العينات البيولوجية. في هذه الدراسة ، تم اختيار عمال تعبئة أسود الكربون الذين كانوا يعملون في مصنع أسود الكربون لأكثر من عام واحد وتعرضوا للهباء الجوي الأسود الكربوني. تم تجنيد عمال محطات المياه في مصنع لمحطات المياه مع عدم التعرض المهني الكبير للعوامل الضارة من المنطقة المحلية كمجموعة تحكم لإجراء الدراسة. تم اختيار معايير الإدراج والاستبعاد التالية لمجتمع الدراسة: تضمنت معايير الإدراج لتعبئة أسود الكربون الاتصال المباشر بأسود الكربون خلال معظم المناوبات والعمل لمدة عام واحد على الأقل في منطقة التعرض لأسود الكربون. تم تضمين عمال محطات المياه إذا لم يكن لديهم تعرض مهني لأسود الكربون أو الملوثات الأخرى في بيئة عملهم. وشملت معايير الاستبعاد العاملين المصابين بأمراض مزمنة مثل السرطان ، وأولئك الذين تعرضوا للأشعة السينية في الأشهر الثلاثة الماضية ، والأفراد الذين لديهم تاريخ من السل الرئوي ، والجراحة الرئوية ، والتهاب عضلة القلب الفيروسي ، وأمراض القلب الخلقية ، والحمى الأخيرة ، أو الالتهاب ، والعمال الذين تناولوا المضادات الحيوية مؤخرا. الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. الحفاظ على البلغم

  1. قم بإعداد المحلول المثبت باتباع الخطوات التالية:
    1. قم بإذابة 2٪ بولي إيثيلين جلايكول (PEG1500) في حمام مائي. خذ 20 مل من PEG1500 الذائبة في أنبوب الطرد المركزي. أضف 20 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ إلى أنبوب الطرد المركزي ورج الخليط جيدا لصنع الخمور الأم.
    2. صب تدريجيا 40 مل من الخمور الأم في 960 مل من الإيثانول بنسبة 50٪. رج المحلول جيدا لتشكيل محلول تثبيت ساكومانو. قم بتخزين المحلول في مكان بارد ومظلم.
  2. أضف 20-30 مل من محلول التثبيت المحضر إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على حوالي 2 مل من البلغم. امزج المحتويات جيدا.
    ملاحظة: تأكد من أن الحجم الإجمالي لا يتجاوز 40 مل.
  3. أغلق أنبوب الطرد المركزي بغشاء مانع للتسرب. قم بتخزينه في مكان بارد ومظلم. انقل الأنبوب إلى المختبر لمزيد من المعالجة عندما يكون جاهزا.
    ملاحظة: قم دائما بإذابة PEG1500 في حمام مائي واستخدمه حسب الجرعة المحددة.

2. تحضير تعليق الخلية في البلغم

  1. تحضير المحلول الهضمي عن طريق إذابة 0.1 جم من dithiothreitol في 100 مل من المحلول الملحي حسب الجرعة الفعلية. قم بتخزين المحلول المحضر في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة.
  2. جهاز الطرد المركزي ، الأنبوب الذي يحتوي على البلغم عند 1،998 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. تخلص من المادة الطافية. أضف كمية متساوية من هضم البلغم إلى الرواسب. دوامة ورج الخليط جيدا.
    1. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى التسييل الكامل (10-15 دقيقة).
      ملاحظة: هز الأنبوب باستمرار أثناء عملية التسييل.
  4. قم بتصفية الخليط المسال بغشاء مرشح 70 ميكرومتر.
  5. جهاز الطرد المركزي للمحلول المصفى عند 500 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. تخلص من المادة الطافية ، مع الاحتفاظ بترسيب الخلية.
  7. أعد تعليق ترسيب الخلية في مخزن فوسفات دوشين. جهاز الطرد المركزي المحلول المعلق عند 500 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على راسب خلية نقية.

3. تحضير مسحة الخلايا

  1. أضف 200-600 ميكرولتر من محلول الفوسفات إلى رواسب الخلية. امزج المحتويات جيدا. اضبط حجم المخزن المؤقت بناء على نتائج عد الخلايا (استهدف >1.0 × 105 خلايا).
  2. خذ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية وقم بإنشاء مسحة خلية باستخدام طريقة الهيماتوكريت17.
  3. دع اللطاخة تجف في الهواء بشكل طبيعي (في غضون 48 ساعة). قم بإصلاح اللطاخة بمحلول تلطيخ متاح تجاريا لمدة 10 ثوان.
  4. اغمر اللطاخة في محلول تلطيخ لمدة 8 ثوان. أثناء التلوين ، ارفع الشريحة برفق لأعلى ولأسفل ، واشطف البقعة الزائدة بالماء الجاري.
  5. تلطخ اللطاخة في محلول تلطيخ B لمدة 8 ثوان. ارفع الشريحة أثناء التلوين واشطف البقعة الزائدة تحت الماء الجاري.
    ملاحظة: تتوفر محاليل التلوين A و B في مجموعة التلوين المتوفرة تجاريا.
  6. اغمس الشريحة في الإيثانول اللامائي مرتين ، كل مرة لمدة 2-3 ثوان.
  7. بمجرد أن تجف ، ضع كمية مناسبة من العلكة المحايدة. ختم الشريحة مع أغطية.

4. التحليل الكمي ل CCAM

  1. استخدم مجهرا ضوئيا مع هدف عدسة زيتية 100x. التقط صورا للضامة المختارة عشوائيا والملطخة جيدا والسليمة شكليا. التقط 50 صورة من البلاعم بشكل عشوائي لكل عينة.
  2. قم بإجراء تحليل الصور في برنامج Image J باتباع الخطوات التالية:
    1. قم بقياس المقياس وحدد الطول الفعلي والتحويل من بكسل إلى بكسل (282 بكسل = 10 ميكرومتر). اضبط المقياس في الصورة J (تحليل > تعيين المقياس) ، وإدخال المسافة بالبكسل ، والطول الفعلي ، ووحدة الطول (ميكرومتر) ، وحدد عمومي.
    2. استخدم شكلا غير منتظم لتحديد الخطوط العريضة للخلايا. قم بإزالة الخلفية (التحديدات اليدوية ، تحرير > مسح الخارج). قياس المساحة الإجمالية للخلايا (تحليل > القياس).
    3. اقطع النواة (تحرير > قطع). قم بتحويل الصورة بتدرج الرمادي إلى أبيض وأسود (الصورة > اكتب > 8 بت).
    4. اضبط قيمة التدرج الرمادي الخاصة بكل تلطيخ خلية للحصول على عد دقيق لجزيئات الكربون (الصورة > ضبط عتبة > > تطبيق وتحليل >> القياس).
    5. احسب محتوى الكربون ل 50 وحدة بلاعم لكل عينة بناء على المساحة المقاسة وتحليل الصورة في برنامج Image J.

النتائج

أظهر البلغم ، المحفوظ والمعالج بالمحلول المثبت ، مورفولوجيا البلاعم السليمة تحت المجهر البصري أثناء الفحص المورفولوجي. أظهرت البلاعم نوى خلايا واضحة أو مستديرة أو على شكل كلية وقابلة للتلطيخ بسهولة. بعد التلوين ، ظهرت نوى الخلية أرجوانية مزرقة ، بينما كان السيتوبلازم ?...

Discussion

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا تجريبيا مفصلا لاستخدام CCAM المستحث المشتق من البلغم كعلامة بيولوجية للتعرض الداخلي للجسيمات الجوية. يمكن اكتشاف CCAM وقياسه كميا من خلال الفحص المجهري البصري ، حيث يعمل كمؤشر حيوي دقيق للتعرض الداخلي يعكس العلاقة مع الآثار الصحية. لذلك ، هناك حا...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82273669 ، 82241086 ، 42207488) ، وبرنامج علماء تايشان في مقاطعة شاندونغ (رقم tsqn202211121) ، وبرنامج الابتكار والتكنولوجيا للعلماء الشباب المتميزين للتعليم العالي في مقاطعة شاندونغ (2022KJ295).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3 mL sterile strawsShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD84202ES03
50 mL centrifuge tubeThermo Fisher Scientific, USA339652
Absolute ethyl alcoholSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD64-17-5
Cedar oilShanghai McLean Biochemical Technology Co., LTDC805296
Diff-quick staining solutionShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD40748ES76
DithiothreitolSolebo Bio Co., LTDD8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)Thermo Fisher Scientific, USA14190144
Microscope cameraOlympus Corporation of JapanDP72
Neutral tree gumSolebo Bio Co., LTDG8590
Nylon filter membrane 70umBD Falcon Bioscience, USA211755
Optical microscopeOlympus Corporation of JapanBX60
Polyethylene glycolSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD25322-68-3
UltracentrifugeThermo Fisher Scientific, USASL40R
Viscous slideJiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD188105

References

  1. Münzel, T., et al. Environmental stressors and cardio-metabolic disease: part I-epidemiologic evidence supporting a role for noise and air pollution and effects of mitigation strategies. Eur Heart J. 38 (8), 550-556 (2017).
  2. Guarnieri, M., et al. Lung function in rural Guatemalan women before and after a chimney stove intervention to reduce wood smoke exposure: results from the randomized exposure study of pollution indoors and respiratory effects and chronic respiratory effects of early childhood exposure to respirable particulate matter study. Chest. 148 (5), 1184-1192 (2015).
  3. Khomenko, S., et al. Premature mortality due to air pollution in European cities: a health impact assessment. Lancet Planet Health. 5 (3), e121-e134 (2021).
  4. Kulkarni, N., Pierse, N., Rushton, L., Grigg, J. Carbon in airway macrophages and lung function in children. N Engl J Med. 355 (1), 21-30 (2006).
  5. Krzyzanowski, M. WHO air quality guidelines for Europe. J Toxicol Environ Health A. 71 (1), 47-50 (2008).
  6. Cohen, A. J., et al. Estimates and 25-year trends of the global burden of disease attributable to ambient air pollution: An analysis of data from the Global Burden of Diseases Study 2015. Lancet. 389 (10082), 1907-1918 (2017).
  7. Hajat, A., et al. The association between long-term air pollution and urinary catecholamines: Evidence from the multi-ethnic study of atherosclerosis. Environ Health Perspect. 127 (5), 57007 (2019).
  8. . Traffic-related air pollution: A critical review of the literature on emissions, exposure, and health effects Available from: https://www.healtheffects.org/publication/traffic-related-air-pollution-critical-review-literature-emissions-exposure-and-health (2010)
  9. Uccelli, R., et al. Female lung cancer mortality and long-term exposure to particulate matter in Italy. Eur J Public Healt.h. 27 (1), 178-183 (2017).
  10. Zhang, L., et al. Indoor particulate matter in urban households: sources, pathways, characteristics, health effects, and exposure mitigation. Int J Environ Res Public Health. 18 (21), 11055 (2021).
  11. Wang, K., Zeng, R. Cough and expectoration. Handbook of Clinical Diagnostics. , 27-29 (2020).
  12. Qi, Y., et al. Passage of exogeneous fine particles from the lung into the brain in humans and animals. PNAS. 119 (26), e2117083119 (2022).
  13. Comunian, S., Dongo, D., Milani, C., Palestini, P. Air pollution and COVID-19: The role of particulate matter in the spread and increase of COVID-19's morbidity and mortality. Int J Environ Res Public Health. 17 (12), 4487 (2020).
  14. Sharma, J., et al. Emerging role of mitochondria in airborne particulate matter-induced immunotoxicity. Environ Pollut. 270, 116242 (2021).
  15. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066 (2020).
  16. Kupiainen, K., Klimont, Z. Primary emissions of fine carbonaceous particles in Europe. Atmos Environ. 41 (10), 2156-2170 (2007).
  17. Tueller, C., et al. Value of smear and PCR in bronchoalveolar lavage fluid in culture positive pulmonary tuberculosis. Eur Respir J. 26 (5), 767-772 (2005).
  18. Takiguchi, H., et al. Macrophages with reduced expressions of classical M1 and M2 surface markers in human bronchoalveolar lavage fluid exhibit pro-inflammatory gene signatures. Sci Rep. 11 (1), 8282 (2021).
  19. Andelid, K., et al. Lung macrophages drive mucus production and steroid-resistant inflammation in chronic bronchitis. Resp Res. 22 (1), 172 (2021).
  20. Weiszhar, Z., Horvath, I. Induced sputum analysis: Step by step. Eur Respiratory Soc. 9, 300-306 (2013).
  21. Popov, T., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis. Eur Respir J. 8 (4), 559-565 (1995).
  22. Sumner, H., et al. Predictors of objective cough frequency in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 187 (9), 943-949 (2013).
  23. Brugha, R. E., et al. Carbon in airway macrophages from children with asthma. Thorax. 69 (7), 654-659 (2014).
  24. Simpson, J. L., Timmins, N. L., Fakes, K., Talbot, P. I., Gibson, P. G. Effect of saliva contamination on induced sputum cell counts, IL-8 and eosinophil cationic protein levels. Eur Respir J. 23 (5), 759-762 (2004).
  25. Risse, E. K., Van't Hof, M. A., Laurini, R. N., Vooijs, P. G. Sputum cytology by the Saccomanno method in diagnosing lung malignancy. Diagn Cytopathol. 1 (4), 286-291 (1985).
  26. Eells, T. P., Pratt, D. S., Coppolo, D. P., Alpern, H. D., May, J. J. An improved method of cell recovery following bronchial brushing. Chest. 93 (4), 727-729 (1988).
  27. Bai, Y., et al. Mitochondrial DNA content in blood and carbon load in airway macrophages. A panel study in elderly subjects. Environ Int. 119, 47-53 (2018).
  28. Jary, H., Rylance, J., Patel, L., Gordon, S. B., Mortimer, K. Comparison of methods for the analysis of airway macrophage particulate load from induced sputum, a potential biomarker of air pollution exposure. BMC Pulm Med. 15, 1-9 (2015).
  29. Gilbert, D. F., Meinhof, T., Pepperkok, R., Runz, H. DetecTiff: A novel image analysis routine for high-content screening microscopy. J Biomol Screen. 14 (8), 944-955 (2009).
  30. Dai, Y., et al. Effects of occupational exposure to carbon black on peripheral white blood cell counts and lymphocyte subsets. Environ Mol Mutagen. 57 (8), 615-622 (2016).
  31. Cheng, W., et al. Carbon content in airway macrophages and genomic instability in Chinese carbon black packers. Arch Toxicol. 94 (3), 761-771 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved