Mesure de la teneur en carbone dans les macrophages des voies respiratoires exposés à des matières particulaires contenant du carbone

Résumé

Cet article décrit un protocole expérimental détaillé pour mesurer la teneur en carbone des macrophages des voies respiratoires dans le but d’évaluer la dose d’exposition interne au niveau de l’exposition individuelle aux particules.

Résumé

Les macrophages pulmonaires présentent un schéma dose-dépendant chez les particules phagocytisantes. Après l’engloutissement, ces macrophages sont ensuite excrétés avec des expectorations, ce qui rend les macrophages et les particules visibles et quantifiables en microscopie optique. Notamment, le carbone élémentaire dans le corps des mammifères provient exclusivement de contaminants externes. Par conséquent, la teneur en carbone dans les macrophages des voies respiratoires (CCAM) sert de biomarqueur d’exposition valide, estimant avec précision l’exposition individuelle aux particules contenant du carbone (PM). Cet article décrit un protocole impliquant la collecte, la conservation, le traitement, la préparation et la coloration des lames, ainsi que l’acquisition et l’analyse de photos de macrophages. Après avoir retiré les noyaux des macrophages, la proportion de la surface du cytoplasme occupée par les particules de carbone (PCOC) a été calculée pour quantifier la teneur en carbone de chaque macrophage. Les résultats indiquent une élévation des concentrations de CCAM après exposition à des particules contenant du carbone. En résumé, cette méthode non invasive, précise, fiable et standardisée permet de mesurer directement les particules de carbone dans les cellules cibles et est utilisée pour la quantification à grande échelle de la CCAM individuelle par expectoration induite.

Introduction

La pollution de l’air ambiant est associée à des décès dus à des maladies respiratoires et cardiovasculaires, ce qui constitue une grave menace pour la santé^humaine1,2. Les données épidémiologiques indiquent que l’exposition chronique aux particules ambiantes d’un diamètre inférieur ou égal à 2,5 m (PM2,5) est responsable de la mort prématurée de 4 à 9 millions de personnes dans le monde. Les PM2,5 ont été classées comme le cinquième facteur de risque le plus important de mortalité mondiale dans l’étude de 2015 sur la charge mondiale de morbidité, les blessures et les facteurs de risque (GBD)3,4,5,6. Des études ont montré que le respect des directives de l’OMS en matière de pollution de l’air pourrait prévenir 51 213 décès par an dus à l’exposition aux PM2,5³. À l’heure actuelle, la plupart des études n’évaluent pas l’exposition intraindividuelle et ne sont fondées que sur des évaluations sommaires effectuées dans des sites de surveillance régionaux plus vastes, qui sont loin des niveaux d’exposition individuels. Les biomarqueurs disponibles de l’exposition interne, tels que les HAP urinaires et le benzo(a)pyrène, ne reflètent pas les associations entre l’exposition aux particules et les effets sur la santé ^7,8,9. Cela conduit à l’incapacité d’établir une relation précise avec les effets sur la santé. Par conséquent, la recherche de marqueurs qui reflètent le niveau d’exposition aux particules chez un individu est l’une des clés d’une évaluation précise de l’exposition des individus.

Les particules inhalées dans les bronches peuvent être excrétées avec les expectorations par les oscillations ciliaires dans les bronches. L’absence d’un système de transport du flux muqueux cilié dans les alvéoles signifie que la principale voie d’élimination des particules entrant dans les alvéoles est la phagocytose et la translocation par les macrophages^10,11. Sur la base de la structure anatomique du poumon, son élimination des corps étrangers particulaires insolubles est lente. Cela permet aux particules d’interagir avec les cellules pulmonaires pendant de longues périodes et d’initier divers effets biologiques, causant des dommages aux tissus pulmonaires et à d’autres organes^12,13. La stimulation par les particules entraîne l’activation des macrophages, déclenchant une cascade de facteurs inflammatoires dans les poumons qui peuvent provoquer une réponse inflammatoire systémique¹⁴. Compte tenu du rôle crucial de la cytophagie des macrophages dans l’induction de tempêtes de cytokines dans les poumons, il est théorisé que les particules de carbone des macrophages pulmonaires pourraient refléter la dose biologiquement efficace d’une exposition aux particules de carbone nucléées en suspension dans l’air¹⁵. De plus, étant donné qu’il n’y a pas d’agrégation de carbone élémentaire dans les cellules de mammifères et que les particules contenant du carbone peuvent être observées sous forme de particules noires au microscope optique, la collecte de macrophages alvéolaires et bronchiques et la mesure de leur teneur en carbone peuvent servir de marqueur pour évaluer l’exposition aux particules¹⁶.

Cette étude a identifié une méthode pour évaluer avec précision les niveaux d’exposition individuelle aux particules, connue sous le nom de contenu en carbone des macrophages des voies respiratoires (CCAM). Plus précisément, des échantillons d’expectorations de population ont été prélevés après que les participants aient inhalé une solution saline hypertonique générée par un nébuliseur à ultrasons. Ces échantillons ont ensuite été conservés à l’aide d’une solution fixative. Les macrophages des voies respiratoires ont été isolés, colorés et photographiés au microscope optique afin d’identifier les macrophages contenant des particules contenant du carbone, qui ont ensuite été quantifiés. Cette méthode fournit un marqueur biologique permettant d’évaluer avec précision les niveaux d’exposition individuelle aux particules. Il établit une base méthodologique pour étudier la relation entre l’exposition aux particules et les effets sur la santé, servant de base de recherche pour l’exploration des associations entre l’exposition aux particules et les effets sur la santé tels que les maladies pulmonaires.

Protocole

L’étude a reçu l’approbation du Comité d’éthique médicale de l’Institut de la santé au travail et du contrôle antipoison du Centre chinois de contrôle et de prévention des maladies (NIOHP201604), avec un consentement éclairé écrit obtenu de tous les sujets avant l’étude et le prélèvement d’échantillons biologiques. Pour cette étude, des emballeurs de noir de carbone qui travaillaient dans une usine de noir de carbone depuis plus d’un an et qui avaient été exposés à des aérosols de noir de carbone ont été sélectionnés. Les travailleurs d’une usine de distribution d’eau n’ayant pas été exposés de manière significative à des facteurs nocifs ont été recrutés dans la région en tant que population témoin pour établir l’étude. Les critères d’inclusion et d’exclusion suivants ont été retenus pour la population étudiée : Les critères d’inclusion pour les emballeurs de noir de carbone comprenaient un contact direct avec du noir de carbone pendant la plupart des quarts de travail et un minimum d’un an de travail dans la zone d’exposition au noir de carbone. Les travailleurs des réseaux d’eau ont été inclus s’ils n’avaient pas été exposés professionnellement au noir de carbone ou à d’autres polluants dans leur environnement de travail. Les critères d’exclusion englobaient les travailleurs atteints de maladies chroniques telles que le cancer, ceux qui avaient été exposés aux rayons X au cours des trois derniers mois, les personnes ayant des antécédents de tuberculose pulmonaire, de chirurgie pulmonaire, de myocardite virale, de cardiopathie congénitale, de fièvre ou d’inflammation récente et les travailleurs qui avaient récemment pris des antibiotiques. Les réactifs et l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Conservation des expectorations

1. Préparez la solution fixatrice en suivant les étapes ci-dessous :
   1. Faites fondre du polyéthylène glycol (PEG1500) à 2 % dans un bain-marie. Prendre 20 ml de PEG1500 fondu dans un tube à centrifuger. Ajoutez 20 ml d’éthanol à 50 % dans le tube à centrifuger et secouez soigneusement le mélange pour créer la liqueur mère.
   2. Versez graduellement 40 ml de la liqueur mère dans 960 ml d’éthanol à 50 %. Bien agiter la solution pour former la solution de fixation Saccomanno. Conservez la solution dans un endroit frais et sombre.
2. Ajouter 20 à 30 ml de la solution fixatrice préparée dans un tube à centrifuger contenant environ 2 ml d’expectorations. Mélangez bien le contenu.
   REMARQUE : Assurez-vous que le volume total ne dépasse pas 40 ml.
3. Scellez le tube de centrifugation avec un film d’étanchéité. Conservez-le dans un endroit frais et sombre. Transportez le tube au laboratoire pour un traitement ultérieur lorsqu’il est prêt.
   REMARQUE : Faites toujours fondre PEG1500 dans un bain-marie et utilisez-le selon la posologie prescrite.

2. Préparation de la suspension cellulaire dans les expectorations

1. Préparez la solution digestive en dissolvant 0,1 g de dithiothréitol dans 100 ml de solution saline selon la posologie réelle. Conserver la solution préparée à 4 °C pendant 48 h au maximum.
2. Centrifuger le tube contenant les expectorations à 1 998 x g pendant 30 min à 4 °C.
3. Jetez le surnageant. Ajouter un volume égal de digestat d’expectoration au précipité. Agitez et secouez soigneusement le mélange.
   1. Placez le tube dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à liquéfaction complète (10-15 min).
      REMARQUE : Secouez continuellement le tube pendant le processus de liquéfaction.
4. Filtrez le mélange liquéfié à l’aide d’une membrane filtrante de 70 μm.
5. Centrifuger la solution filtrée à 500 x g pendant 7 min à 4 °C.
6. Jetez le surnageant en conservant le précipité cellulaire.
7. Remettre en suspension le précipité cellulaire dans le tampon phosphate de Duchenne. Centrifuger la solution remise en suspension à 500 x g pendant 7 min à 4 °C pour obtenir un précipité cellulaire pur.

3. Préparation du frottis cellulaire

1. Ajouter 200 à 600 μL de tampon phosphate au sédiment cellulaire. Mélangez soigneusement le contenu ; Ajustez le volume de la mémoire tampon en fonction des résultats du comptage des cellules (visez >1,0 × 10⁵ cellules).
2. Prélever 20 μL de suspension cellulaire et créer un frottis cellulaire à l’aide de la méthode de l’hématocrite¹⁷.
3. Laissez le frottis sécher naturellement à l’air libre (dans les 48 heures). Fixez le frottis avec une solution de coloration disponible dans le commerce pendant 10 s.
4. Immergez le frottis dans une solution de coloration pendant 8 s. Pendant la coloration, soulevez doucement la lame de haut en bas et rincez l’excès de tache à l’eau courante.
5. Teindre le frottis dans une solution de coloration B pendant 8 s. Soulevez la lame pendant la coloration et rincez l’excès de tache à l’eau courante.
   REMARQUE : Les solutions de coloration A et B sont disponibles dans le kit de coloration disponible dans le commerce.
6. Trempez la lame dans de l’éthanol anhydre deux fois, à chaque fois pendant 2-3 s.
7. Une fois sec, appliquez une quantité appropriée de gomme neutre. Scellez la diapositive à l’aide de lamelles.

4. Analyse quantitative de la CCAM

1. Utilisez un microscope optique avec un objectif à lentille d’huile 100x. Capturez des images de macrophages sélectionnés au hasard, bien colorés et morphologiquement intacts. Prenez 50 photos de macrophages au hasard pour chaque échantillon.
2. Effectuez l’analyse d’image dans le logiciel Image J en suivant les étapes ci-dessous :
   1. Mesurez l’échelle et déterminez la longueur réelle et la conversion pixel par pixel (282 pixels = 10 μm). Définissez l’échelle dans l’image J (Analyser > Définir l’échelle), saisissez Distance en pixels, Longueur réelle, Unité de longueur (μm) et cochez Global.
   2. Utilisez une forme irrégulière pour délimiter les cellules. Supprimez l’arrière-plan (sélections à main levée, Modifier > Effacer l’extérieur). Mesurez la surface totale des cellules (Analyser > Mesurer).
   3. Découpez le noyau (Modifier > Couper). Convertissez l’image en niveaux de gris en noir et blanc (type > image > 8 bits).
   4. Ajustez la valeur en niveaux de gris spécifique à chaque coloration cellulaire pour un comptage précis des particules de carbone (Image > Ajuster > seuil > Appliquer, Analyser >> Mesurer).
   5. Calculez la teneur en carbone de 50 macrophages par échantillon sur la base de la surface mesurée et de l’analyse d’images dans le logiciel Image J.

Résultats

Les expectorations, conservées et traitées avec la solution fixatrice, ont montré la morphologie intacte des macrophages au microscope optique lors de l’examen morphologique. Les macrophages présentaient des noyaux cellulaires clairs, ronds ou en forme de rein, facilement colorables. Après la coloration, les noyaux cellulaires sont apparus bleu-violet, tandis que le cytoplasme était rose clair ou bleu clair. Le champ microscopique a montré des impuretés minimales, ce qui a faci...

Discussion

Cette étude présente un protocole expérimental détaillé pour l’utilisation du CCAM dérivé des expectorations induites comme marqueur biologique de l’exposition interne aux particules atmosphériques. La CCAM peut être détectée et quantifiée par microscopie optique, servant de biomarqueur d’exposition interne précis reflétant la relation avec les effets sur la santé. Par conséquent, il est nécessaire d’établir et d’optimiser une méthode pratique, fiable et effi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL sterile straws	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	84202ES03
50 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific, USA	339652
Absolute ethyl alcohol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	64-17-5
Cedar oil	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD	C805296
Diff-quick staining solution	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	40748ES76
Dithiothreitol	Solebo Bio Co., LTD	D8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)	Thermo Fisher Scientific, USA	14190144
Microscope camera	Olympus Corporation of Japan	DP72
Neutral tree gum	Solebo Bio Co., LTD	G8590
Nylon filter membrane 70um	BD Falcon Bioscience, USA	211755
Optical microscope	Olympus Corporation of Japan	BX60
Polyethylene glycol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	25322-68-3
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	SL40R
Viscous slide	Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD	188105