מדידת תכולת פחמן במקרופאגים בדרכי הנשימה שנחשפו לחלקיקים המכילים פחמן

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול ניסויי מפורט למדידת תכולת הפחמן של מקרופאגים בדרכי הנשימה במטרה להעריך את מינון החשיפה הפנימית ברמת החשיפה לחלקיקים בודדים.

Abstract

מקרופאגים ריאתיים מציגים דפוס תלוי מינון בחלקיקי פאגוציטיזציה. לאחר הבליעה, מקרופאגים אלה מופרשים לאחר מכן באמצעות כיח, מה שהופך את המקרופאגים והחלקיקים לגלויים וניתנים לכימות תחת מיקרוסקופ אור. יש לציין כי פחמן יסודי בגוף היונקים מקורו אך ורק במזהמים חיצוניים. כתוצאה מכך, תכולת הפחמן במקרופאגים בדרכי הנשימה (CCAM) משמשת כסמן ביולוגי תקף לחשיפה, האומדת במדויק את החשיפה האישית לחומר חלקיקי המכיל פחמן (PM). מאמר זה מתאר פרוטוקול הכולל איסוף, שימור, עיבוד, הכנת שקופיות וצביעה, כמו גם רכישה וניתוח של תמונות מקרופאגים. לאחר הסרת גרעיני המקרופאגים, חושב החלק היחסי של שטח הציטופלסמה שנכבש על ידי חלקיקי פחמן (PCOC) כדי לכמת את תכולת הפחמן בכל מקרופאג. התוצאות מצביעות על עלייה ברמות CCAM לאחר חשיפה לחומר חלקיקי המכיל פחמן. לסיכום, שיטה לא פולשנית, מדויקת, אמינה ומתוקננת זו מאפשרת מדידה ישירה של חלקיקי פחמן בתוך תאי המטרה ומשמשת לכימות בקנה מידה גדול של CCAM בודד באמצעות כיח מושרה.

Introduction

זיהום אוויר סביבתי קשור למוות כתוצאה ממחלות נשימה וכלי דם, ומהווה איום רציני על בריאות האדם ^1,2. נתונים אפידמיולוגיים מצביעים על כך שחשיפה כרונית לחלקיקי סביבה בקוטר של פחות או שווה ל-2.5 מיקרומטר (PM2.5) אחראית למותם בטרם עת של בין 4 ל-9 מיליון בני אדם ברחבי העולם. PM2.5 דורג כגורם הסיכון החמישי בחשיבותו לתמותה עולמית במחקר נטל עולמי של מחלות, פציעות וגורמי סיכון (GBD) לשנת 2015 (GBD)3,4,5,6. מחקרים מצאו כי הקפדה על הנחיות זיהום האוויר של ארגון הבריאות העולמי יכולה למנוע 51,213 מקרי מוות בשנה כתוצאה מחשיפה ל-PM2.5³. נכון לעכשיו, רוב המחקרים חסרים הערכה של חשיפה תוך-אישית ומבוססים רק על הערכות גסות באתרי ניטור אזוריים גדולים יותר, אשר רחוקים מרמות חשיפה פרטניות. הסמנים הביולוגיים הזמינים של חשיפה פנימית, כגון PAHs בשתן ובנזו(א)פירן, אינם משקפים את הקשר בין חשיפה לחומר חלקיקי לבין השפעות בריאותיות ^7,8,9. זה מוביל לחוסר היכולת ליצור קשר מדויק עם השפעות בריאותיות. לכן, החיפוש אחר סמנים המשקפים את רמת החשיפה לחומר חלקיקי אצל אדם הוא אחד המפתחות להערכת חשיפה מדויקת עבור אנשים.

חלקיקים הנשאפים לתוך הסמפונות יכולים להיות מופרשים עם כיח באמצעות תנודות ריסניות בסימפונות. היעדר מערכת הולכת זרימה רירית בנאדיות פירושו שנתיב הפינוי העיקרי של חלקיקים הנכנסים לנאדיות הוא באמצעות פגוציטוזה וטרנסלוקציה על ידי מקרופאגים^10,11. בהתבסס על המבנה האנטומי של הריאה, פינוי החומר הזר החלקיקי הבלתי מסיס שלה איטי. זה מאפשר לחומר חלקיקי לתקשר עם תאי הריאה לפרקי זמן ממושכים וליזום השפעות ביולוגיות שונות, תוך גרימת נזק לרקמת הריאה ולאיברים אחרים ^12,13. גירוי על ידי חומר חלקיקי מוביל להפעלת מקרופאגים, ומעורר שרשרת של גורמים דלקתיים בריאות שיכולים לגרום לתגובה דלקתית מערכתית¹⁴. בהתחשב בתפקיד המכריע של ציטופגיית מקרופאגים ביצירת סערות ציטוקינים בריאות, קיימת תיאוריה כי חלקיקי פחמן ממקרופאגים של ריאות יכולים לשקף את המינון היעיל ביולוגית של חשיפה לחלקיקים גרעיני פחמן באוויר¹⁵. יתר על כן, מכיוון שאין צבירה של פחמן יסודי בתאי יונקים וניתן לצפות בחלקיקים המכילים פחמן כחומר חלקיקי שחור תחת מיקרוסקופ אור, איסוף המקרופאגים בנאדיות ובסימפונות ומדידת תכולת הפחמן בהם יכולים לשמש סמן להערכת חשיפה לחלקיקים¹⁶.

מחקר זה זיהה שיטה להערכה מדויקת של רמות החשיפה לחלקיקים בודדים, הידועה בשם תכולת הפחמן של מקרופאגים בדרכי הנשימה (CCAM). באופן ספציפי, דגימות כיח האוכלוסייה נאספו לאחר המשתתפים שאפו מלוחים היפרטוניים שנוצרו על ידי נבולייזר קולי. דגימות אלה נשמרו לאחר מכן באמצעות תמיסה מקבעת. המקרופאגים של דרכי הנשימה בודדו, הוכתמו וצולמו תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות מקרופאגים המכילים חלקיקים המכילים פחמן, ולאחר מכן כומתו. שיטה זו מספקת סמן ביולוגי להערכה מדויקת של רמות החשיפה לחלקיקים בודדים. הוא קובע בסיס מתודולוגי לחקר הקשר בין חשיפה לחומר חלקיקי לבין השפעות בריאותיות, ומשמש בסיס מחקרי לחקר הקשר בין חשיפה לחומר חלקיקי לבין תוצאי בריאות כגון מחלות ריאה.

Protocol

המחקר קיבל אישור מוועדת האתיקה הרפואית של המכון לבריאות תעסוקתית ובקרת רעלים, המרכז הסיני לבקרת מחלות ומניעתן (NIOHP201604), עם הסכמה מדעת בכתב שהתקבלה מכל הנבדקים לפני המחקר ואיסוף הדגימות הביולוגיות. למחקר זה נבחרו אורזי פחמן שחור שעבדו במפעל פחמן שחור במשך יותר משנה ונחשפו לאירוסולים שחורים פחמניים. עובדי מפעלי מים במפעל מים ללא חשיפה תעסוקתית משמעותית לגורמים מזיקים גויסו מהאזור המקומי כאוכלוסיית ביקורת לביסוס המחקר. קריטריוני ההכללה וההדרה הבאים נבחרו עבור אוכלוסיית המחקר: קריטריוני ההכללה של אורזי פחמן שחור כללו מגע ישיר עם פחמן שחור במהלך רוב המשמרות ומינימום של שנת עבודה באזור החשיפה לפחמן שחור. עובדי מפעלי מים נכללו אם לא הייתה להם חשיפה תעסוקתית לפחמן שחור או למזהמים אחרים בסביבת עבודתם. קריטריוני ההחרגה כללו עובדים עם מחלות כרוניות כגון סרטן, אנשים שעברו חשיפה לצילומי רנטגן בשלושת החודשים האחרונים, אנשים עם היסטוריה של שחפת ריאות, ניתוחי ריאות, דלקת שריר הלב הנגיפית, מחלת לב מולדת, חום או דלקת לאחרונה, ועובדים שנטלו אנטיביוטיקה לאחרונה. הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. שימור כיח

1. הכן את הפתרון המקבע לפי השלבים הבאים:
   1. יש להמיס 2% פוליאתילן גליקול (PEG1500) באמבט מים. קח 20 מ"ל של PEG1500 מומס בצינור צנטריפוגה. מוסיפים 20 מ"ל אתנול 50% לצינור הצנטריפוגה ומנערים את התערובת ביסודיות ליצירת ליקר האם.
   2. בהדרגה לשפוך 40 מ"ל של משקה האם לתוך 960 מ"ל של 50% אתנול. נערו היטב את התמיסה ליצירת תמיסת הקיבוע Saccomanno. אחסנו את התמיסה במקום קריר וחשוך.
2. הוסף 20-30 מ"ל של פתרון קיבוע מוכן צינור צנטריפוגה המכיל כ 2 מ"ל של כיח. מערבבים היטב את התכולה.
   הערה: ודא שהנפח הכולל אינו עולה על 40 מ"ל.
3. אטמו את צינור הצנטריפוגה בסרט איטום. אחסנו אותו במקום קריר וחשוך. להעביר את הצינור למעבדה לעיבוד נוסף כאשר הוא מוכן.
   הערה: יש להמיס תמיד PEG1500 באמבט מים ולהשתמש בהתאם למינון שנקבע.

2. הכנת השעיית תאים בכיח

1. הכן את פתרון העיכול על ידי המסת 0.1 גרם של dithiothreitol ב 100 מ"ל של מלוחים לפי המינון בפועל. אחסנו את התמיסה המוכנה ב-4°C למשך עד 48 שעות.
2. צנטריפוגה הצינור המכיל את הכיח ב 1,998 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
3. השליכו את הסופרנטנט. הוסף נפח שווה של עיכול כיח למשקע. מערבלים ומנערים היטב את התערובת.
   1. מניחים את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להנזלה מלאה (10-15 דקות).
      הערה: יש לנער ברציפות את הצינורית במהלך תהליך ההנזלה.
4. סנן את התערובת הנוזלית עם קרום מסנן 70 מיקרומטר.
5. צנטריפוגה את התמיסה המסוננת ב 500 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C.
6. השליכו את הסופרנטנט, תוך שמירה על שקע התא.
7. להשהות מחדש את שקע התא במאגר פוספט דושן. צנטריפוגה את התמיסה מחדש ב 500 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C כדי לקבל משקע תא טהור.

3. הכנת כתם תאים

1. הוסף 200-600 μL של חיץ פוספט למשקעי התא. מערבבים היטב את התכולה; התאם את נפח המאגר בהתבסס על תוצאות ספירת התאים (כוון ל>1.0 × 10⁵ תאים).
2. קח 20 μL של תרחיף התא וליצור כתם התא באמצעות שיטת המטוקריט¹⁷.
3. תנו למריחה להתייבש באוויר באופן טבעי (תוך 48 שעות). תקן את המריחה עם פתרון צביעה זמין מסחרית עבור 10 שניות.
4. לטבול את המריחה בתמיסת כתמים למשך 8 שניות. במהלך הכתמה, הרימו בעדינות את המגלשה מעלה ומטה, ושטפו את עודפי הכתם במים זורמים.
5. מכתימים את הכתם בתמיסת צביעה B למשך 8 שניות. הרימו את המגלשה במהלך הכתמים ושטפו את עודפי הכתם מתחת למים זורמים.
   הערה: פתרונות צביעה A ו-B זמינים בערכת הצביעה המסחרית.
6. טובלים את המגלשה באתנול נטול מים פעמיים, כל פעם למשך 2-3 שניות.
7. לאחר הייבוש, יש למרוח כמות מתאימה של מסטיק נייטרלי. אטמו את המגלשה בעזרת כיסויים.

4. ניתוח כמותי של CCAM

1. השתמש במיקרוסקופ אור עם מטרת עדשת שמן 100x. צלם תמונות של מקרופאגים שנבחרו באופן אקראי, מוכתמים היטב ושלמים מורפולוגית. צלמו 50 תמונות מקרופאגים באופן אקראי עבור כל דגימה.
2. בצע ניתוח תמונה בתוכנת Image J לפי השלבים הבאים:
   1. מדוד את קנה המידה וקבע את האורך בפועל ואת ההמרה מפיקסל לפיקסל (282 פיקסלים = 10 מיקרומטר). הגדר את קנה המידה בתמונה J (נתח > הגדר קנה מידה), מרחק קלט בפיקסלים, אורך בפועל, יחידת אורך (μm) וסמן כללי.
   2. השתמש בצורה לא סדירה כדי לתחום את התאים. הסר את הרקע (בחירות חופשיות, עריכה > נקה בחוץ). מדוד את השטח הכולל של התאים (ניתוח > מדידה).
   3. גזור את הגרעין (עריכה > גזירה). המירו את התמונה בגווני אפור לשחור-לבן (Image > Type > 8 bit).
   4. התאם את ערך גווני האפור הספציפי לכל צביעת תא לספירת חלקיקי פחמן מדויקת (תמונה > התאם סף > > החל, נתח >> מדידה).
   5. חשב את תכולת הפחמן של 50 מקרופאגים לדגימה בהתבסס על השטח הנמדד וניתוח התמונה בתוכנת Image J.

תוצאות

הכיח, שנשמר ועובד בתמיסה המקבעת, הציג מורפולוגיית מקרופאגים שלמה תחת מיקרוסקופ אופטי במהלך בדיקה מורפולוגית. המקרופאגים הציגו גרעיני תאים שקופים, עגולים או בצורת כליה, שניתן להכתים בקלות. לאחר הצביעה, גרעיני התא נראו כחלחלים-סגולים, בעוד הציטופלסמה הייתה ורודה בהירה או ...

Discussion

מחקר זה מציג פרוטוקול ניסויי מפורט לשימוש ב-CCAM המושרה שמקורו בכיח כסמן ביולוגי לחשיפה פנימית לחומר חלקיקי אטמוספרי. ניתן לזהות ולכמת CCAM באמצעות מיקרוסקופ אופטי, המשמש כסמן ביולוגי מדויק לחשיפה פנימית המשקף את הקשר עם השפעות בריאותיות. לכן, יש צורך להקים ולייעל שיטת שימו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL sterile straws	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	84202ES03
50 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific, USA	339652
Absolute ethyl alcohol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	64-17-5
Cedar oil	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD	C805296
Diff-quick staining solution	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	40748ES76
Dithiothreitol	Solebo Bio Co., LTD	D8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)	Thermo Fisher Scientific, USA	14190144
Microscope camera	Olympus Corporation of Japan	DP72
Neutral tree gum	Solebo Bio Co., LTD	G8590
Nylon filter membrane 70um	BD Falcon Bioscience, USA	211755
Optical microscope	Olympus Corporation of Japan	BX60
Polyethylene glycol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	25322-68-3
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	SL40R
Viscous slide	Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD	188105