Medição do teor de carbono em macrófagos das vias aéreas expostos a partículas contendo carbono

Resumo

Este artigo descreve um protocolo experimental detalhado para medir o teor de carbono de macrófagos das vias aéreas com o objetivo de avaliar a dose de exposição interna ao nível de exposição individual ao material particulado.

Resumo

Os macrófagos pulmonares exibem um padrão dose-dependente em partículas fagocitantes. Após o engolfamento, esses macrófagos são subsequentemente excretados com o escarro, tornando os macrófagos e partículas visíveis e quantificáveis à microscopia de luz. Notavelmente, o carbono elementar dentro do corpo dos mamíferos se origina exclusivamente de contaminantes externos. Consequentemente, o conteúdo de carbono nos macrófagos das vias aéreas (CCAM) serve como um biomarcador de exposição válido, estimando com precisão a exposição individual ao material particulado (PM) contendo carbono. Este artigo delineia um protocolo envolvendo coleta, preservação, processamento, preparação e coloração de escarro, bem como aquisição e análise de fotos de macrófagos. Após a remoção dos núcleos dos macrófagos, a proporção da área do citoplasma ocupada por partículas de carbono (PCOC) foi calculada para quantificar o teor de carbono em cada macrófago. Os resultados indicam uma elevação nos níveis de CCAM após a exposição ao MP contendo carbono. Em resumo, este método não invasivo, preciso, confiável e padronizado permite a medição direta de partículas de carbono dentro das células-alvo e é utilizado para quantificação em larga escala de CCAM individual por meio de escarro induzido.

Introdução

A poluição do ar ambiente está associada a mortes por doenças respiratórias e cardiovasculares, representando uma séria ameaça à saúde humana ^1,2. Dados epidemiológicos indicam que a exposição crônica a material particulado ambiente menor ou igual a 2,5 μm de diâmetro (PM2,5) é responsável pela morte prematura de 4 a 9 milhões de pessoas em todo o mundo. O PM2.5 foi classificado como o quinto fator de risco mais importante para mortalidade global no Estudo Global de Carga de Doenças, Lesões e Fatores de Risco (GBD^{) de} 20153,4,5,6. Estudos descobriram que a adesão às diretrizes de poluição do ar da OMS poderia evitar 51.213 mortes por ano por exposição ao PM2.5³. Atualmente, a maioria dos estudos carece da avaliação da exposição intraindividual e se baseia apenas em avaliações brutas em locais de monitoramento regionais maiores, que estão longe dos níveis de exposição individual. Os biomarcadores disponíveis de exposição interna, como HAPs urinários e benzo(a)pireno, não refletem as associações entre exposições a partículas e efeitos na saúde ^7,8,9. Isso leva à incapacidade de estabelecer uma relação precisa com os efeitos na saúde. Portanto, a busca por marcadores que reflitam o nível de exposição ao material particulado em um indivíduo é uma das chaves para uma avaliação precisa da exposição dos indivíduos.

As partículas inaladas nos brônquios podem ser excretadas com o escarro através de oscilações ciliares nos brônquios. A falta de um sistema de transporte de fluxo mucoso ciliado nos alvéolos significa que a principal via de depuração das partículas que entram nos alvéolos é por meio da fagocitose e translocação por macrófagos^10,11. Com base na estrutura anatômica do pulmão, sua depuração de matéria estranha particulada insolúvel é lenta. Isso permite que o material particulado interaja com as células pulmonares por longos períodos e inicie vários efeitos biológicos, causando danos ao tecido pulmonar e outros órgãos^12,13. A estimulação por material particulado leva à ativação de macrófagos, desencadeando uma cascata de fatores inflamatórios nos pulmões que podem causar uma resposta inflamatória sistêmica¹⁴. Considerando o papel crucial da citofagia de macrófagos na indução de tempestades de citocinas nos pulmões, teoriza-se que as partículas de carbono dos macrófagos pulmonares podem refletir a dose biologicamente eficaz de exposição a partículas nucleadas por carbono no ar¹⁵. Além disso, como não há agregação de carbono elementar em células de mamíferos e partículas contendo carbono podem ser observadas como material particulado preto sob um microscópio óptico, a coleta de macrófagos alveolares e brônquicos e a medição do conteúdo de carbono neles podem servir como um marcador para avaliar a exposição ao material particulado¹⁶.

Este estudo identificou um método para avaliar com precisão os níveis individuais de exposição ao material particulado, conhecido como Conteúdo de Carbono dos Macrófagos das Vias Aéreas (CCAM). Especificamente, amostras de escarro da população foram coletadas depois que os participantes inalaram solução salina hipertônica gerada por um nebulizador ultrassônico. Essas amostras foram então preservadas usando uma solução fixadora. Os macrófagos das vias aéreas foram isolados, corados e fotografados ao microscópio óptico para identificar macrófagos contendo partículas contendo carbono, que foram então quantificadas. Este método fornece um marcador biológico para avaliar com precisão os níveis individuais de exposição ao material particulado. Ele estabelece uma base metodológica para investigar a relação entre a exposição ao material particulado e os efeitos na saúde, servindo como base de pesquisa para explorar associações entre a exposição ao PM e resultados de saúde, como doenças pulmonares.

Protocolo

O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética Médica do Instituto de Saúde Ocupacional e Controle de Intoxicações do Centro Chinês de Controle e Prevenção de Doenças (NIOHP201604), com consentimento informado por escrito obtido de todos os indivíduos antes do estudo e coleta de amostras biológicas. Para este estudo, foram selecionados embaladores de negro de fumo que trabalhavam em uma fábrica de negro de fumo há mais de 1 ano e foram expostos a aerossóis de negro de fumo. Trabalhadores de uma fábrica de água sem exposição ocupacional significativa a fatores prejudiciais foram recrutados na área local como população de controle para estabelecer o estudo. Os seguintes critérios de inclusão e exclusão foram selecionados para a população do estudo: Os critérios de inclusão para packers de negro de fumo incluíram contato direto com negro de fumo durante a maioria dos turnos e um mínimo de um ano de trabalho na área de exposição ao negro de fumo. Os trabalhadores do sistema de abastecimento de água foram incluídos se não tivessem exposição ocupacional ao negro de fumo ou outros poluentes em seu ambiente de trabalho. Os critérios de exclusão abrangeram trabalhadores com doenças crônicas, como câncer, aqueles que foram submetidos à exposição a raios-X nos últimos três meses, indivíduos com histórico de tuberculose pulmonar, cirurgia pulmonar, miocardite viral, cardiopatia congênita, febre recente ou inflamação e trabalhadores que tomaram antibióticos recentemente. Os reagentes e os equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preservação do escarro

1. Prepare a solução fixadora seguindo os passos abaixo:
   1. Derreta 2% de polietilenoglicol (PEG1500) em banho-maria. Tome 20 mL de PEG1500 derretido em um tubo de centrífuga. Adicione 20 mL de etanol a 50% ao tubo da centrífuga e agite bem a mistura para criar o licor-mãe.
   2. Despeje gradualmente 40 mL do licor-mãe em 960 mL de etanol a 50%. Agite bem a solução para formar a solução de fixação de Saccomanno. Armazene a solução em local fresco e escuro.
2. Adicione 20-30 mL da solução fixadora preparada a um tubo de centrífuga contendo aproximadamente 2 mL de escarro. Misture bem o conteúdo.
   NOTA: Certifique-se de que o volume total não exceda 40 mL.
3. Sele o tubo da centrífuga com uma película de vedação. Guarde-o em local fresco e escuro. Transporte o tubo para o laboratório para processamento posterior quando estiver pronto.
   NOTA: Sempre derreta PEG1500 em banho-maria e use conforme a dosagem prescrita.

2. Preparação da suspensão celular no escarro

1. Prepare a solução digestiva dissolvendo 0,1 g de ditiotreitol em 100 mL de solução salina de acordo com a dosagem real. Conservar a solução preparada a 4 °C durante um período máximo de 48 h.
2. Centrifugar o tubo que contém a expetoração a 1,998 x g durante 30 min a 4 °C.
3. Descarte o sobrenadante. Adicione um volume igual de digestão de escarro ao precipitado. Vortex e agite bem a mistura.
   1. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C até a liquefação completa (10-15 min).
      NOTA: Agite continuamente o tubo durante o processo de liquefação.
4. Filtrar a mistura liquefeita com uma membrana filtrante de 70 μm.
5. Centrifugar a solução filtrada a 500 x g durante 7 min a 4 °C.
6. Descarte o sobrenadante, retendo o precipitado celular.
7. Ressuspenda o precipitado celular em tampão fosfato de Duchenne. Centrifugar a solução ressuspensa a 500 x g durante 7 min a 4 °C para obter um precipitado de células puras.

3. Preparação do esfregaço celular

1. Adicione 200-600 μL de tampão fosfato ao sedimento celular. Misture bem o conteúdo; ajuste o volume do buffer com base nos resultados da contagem de células (apontar para >1,0 × 10⁵ células).
2. Pegue 20 μL da suspensão celular e crie um esfregaço celular usando o método do hematócrito¹⁷.
3. Deixe o esfregaço secar naturalmente (dentro de 48 h). Fixe o esfregaço com uma solução de coloração disponível comercialmente por 10 s.
4. Mergulhe o esfregaço em uma solução de coloração por 8 s. Durante a coloração, levante suavemente a corrediça para cima e para baixo e enxágue o excesso de mancha com água corrente.
5. Manchar o esfregaço em solução de coloração B por 8 s. Levante a lâmina durante a coloração e enxágue o excesso de mancha em água corrente.
   NOTA: As soluções de coloração A e B estão disponíveis no kit de coloração disponível comercialmente.
6. Mergulhe a lâmina em etanol anidro duas vezes, cada vez por 2-3 s.
7. Depois de seco, aplique uma quantidade adequada de goma neutra. Sele a lâmina com lamínulas.

4. Análise quantitativa do CCAM

1. Use um microscópio de luz com uma objetiva de lente a óleo de 100x. Capture imagens de macrófagos selecionados aleatoriamente, bem corados e morfologicamente intactos. Tire 50 fotos de macrófagos aleatoriamente para cada amostra.
2. Realize a análise de imagem no software Image J seguindo os passos abaixo:
   1. Meça a escala e determine o comprimento real e a conversão pixel a pixel (282 pixels = 10 μm). Defina a escala na Imagem J (Analisar > Definir escala), insira Distância em pixels, comprimento real, unidade de comprimento (μm) e marque Global.
   2. Use uma forma irregular para delinear as células. Remova o plano de fundo (seleções à mão livre, Editar > Limpar fora). Meça a área total das células (Analisar > Medição).
   3. Recorte o núcleo (Editar > Recortar). Converta a imagem em tons de cinza para preto e branco (Tipo de > de imagem > 8 bits).
   4. Ajuste o valor da escala de cinza específico para cada coloração de célula para uma contagem precisa de partículas de carbono (Imagem > Ajustar > limite > Aplicar, Analisar >> Medição).
   5. Calcule o teor de carbono de 50 macrófagos por amostra com base na área medida e na análise de imagem no software Image J.

Resultados

O escarro, preservado e processado com a solução fixadora, exibiu morfologia de macrófagos intactos em microscópio óptico durante o exame morfológico. Os macrófagos exibiram núcleos celulares claros, redondos ou em forma de rim, facilmente coráveis. Após a coloração, os núcleos das células pareciam roxo-azulados, enquanto o citoplasma era rosa claro ou azul claro. O campo microscópico mostrou impurezas mínimas, o que facilitou a fácil identificação celular. Dentro das ...

Discussão

Este estudo apresenta um protocolo experimental detalhado para o uso de CCAM derivado de escarro induzido como um marcador biológico para exposição interna a material particulado atmosférico. O CCAM pode ser detectado e quantificado por meio de microscopia óptica, servindo como um biomarcador de exposição interna preciso que reflete a relação com os efeitos na saúde. Portanto, há a necessidade de estabelecer e otimizar um método de preservação de escarro induzido convenient...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL sterile straws	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	84202ES03
50 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific, USA	339652
Absolute ethyl alcohol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	64-17-5
Cedar oil	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD	C805296
Diff-quick staining solution	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	40748ES76
Dithiothreitol	Solebo Bio Co., LTD	D8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)	Thermo Fisher Scientific, USA	14190144
Microscope camera	Olympus Corporation of Japan	DP72
Neutral tree gum	Solebo Bio Co., LTD	G8590
Nylon filter membrane 70um	BD Falcon Bioscience, USA	211755
Optical microscope	Olympus Corporation of Japan	BX60
Polyethylene glycol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	25322-68-3
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	SL40R
Viscous slide	Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD	188105