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요약

이 논문은 개별 미립자 물질 노출 수준에서 내부 노출 선량을 평가하기 위해 기도 대식세포의 탄소 함량을 측정하기 위한 자세한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

폐 대식세포(pulmonary macrophage)는 식세포화(phagocytizing) 입자에서 용량 의존적 패턴을 보입니다. 삼킨 후, 이 대식세포는 이후 가래로 배설되어 대식세포와 입자를 볼 수 있고 광학 현미경으로 정량화할 수 있습니다. 특히 포유류 몸 내의 원소 탄소는 전적으로 외부 오염 물질에서 비롯됩니다. 결과적으로, 기도 대식세포(CCAM)의 탄소 함량은 유효한 노출 바이오마커 역할을 하여 탄소 함유 미립자 물질(PM)에 대한 개별 노출을 정확하게 추정합니다. 이 기사에서는 객담 채취, 보존, 처리, 슬라이드 준비 및 염색, 대식세포 사진 획득 및 분석과 관련된 프로토콜에 대해 설명합니다. 대식세포핵을 제거한 후 탄소입자(PCOC)가 차지하는 세포질 영역의 비율을 계산하여 각 대식세포의 탄소 함량을 정량화했습니다. 결과는 탄소 함유 PM에 노출된 후 CCAM 수치가 상승했음을 나타냅니다. 요약하면, 이 비침습적이고 정밀하며 신뢰할 수 있고 표준화된 방법은 표적 세포 내 탄소 입자를 직접 측정할 수 있으며 유도 가래를 통한 개별 CCAM의 대규모 정량화에 활용됩니다.

서문

주변 대기 오염은 호흡기 및 심혈관 질환으로 인한 사망과 관련이 있으며, 인간의 건강에 심각한 위협이 됩니다 1,2. 역학 데이터에 따르면 직경 2.5μm(PM2.5) 이하의 주변 미립자 물질에 대한 만성 노출이 전 세계적으로 400만 명에서 900만 명의 조기 사망의 원인입니다. PM2.5는 2015년 글로벌 질병, 부상 및 위험 요인 부담 연구(GBD)에서 전 세계 사망률의 다섯 번째로 중요한 위험 요인으로 선정되었습니다3,4,5,6. 연구에 따르면 WHO 대기 오염 지침을 준수하면 PM2.5 노출로 인한 연간 51,213명의 사망을 예방할 수 있습니다3. 현재 대부분의 연구는 개인 내 노출에 대한 평가가 부족하고 개별 노출 수준과는 거리가 먼 더 큰 지역 모니터링 사이트의 조잡한 평가에만 기반하고 있습니다. 요로 PAH 및 벤조피렌(benzo(a)pyrene)과 같은 내부 노출의 이용 가능한 바이오마커는 미세먼지 노출과 건강 영향 사이의 연관성을 반영하지 않습니다 7,8,9. 이로 인해 건강에 미치는 영향과 정확한 관계를 설정할 수 없습니다. 따라서 개인의 미립자 물질 노출 수준을 반영하는 마커를 찾는 것은 개인에 대한 정확한 노출 평가의 핵심 중 하나입니다.

기관지로 흡입된 입자는 기관지의 섬모 진동을 통해 가래와 함께 배설될 수 있습니다. 폐포에 섬모 점액 흐름 수송 시스템이 없다는 것은 폐포로 유입되는 입자의 주요 제거 경로가 대식 세포작용과 대식 세포에 의한 전좌를 통한다는 것을 의미합니다10,11. 폐의 해부학적 구조에 따라 불용성 미립자 이물질의 제거가 느립니다. 이를 통해 미립자 물질이 장기간 폐 세포와 상호 작용하고 다양한 생물학적 효과를 시작하여 폐 조직 및 기타 장기에 손상을 일으킬 수 있습니다12,13. 미세먼지에 의한 자극은 대식세포 활성화로 이어져 폐에 전신 염증 반응을 유발할 수 있는 일련의 염증 인자를 유발합니다14. 폐에서 사이토카인 폭풍을 유발하는 대식세포 세포형성(macrophage cytophagy)의 결정적인 역할을 고려할 때, 폐 대식세포의 탄소 입자가 공기 중 탄소 핵 미립자 노출의 생물학적으로 효과적인 용량을 반영할 수 있다는 이론이 제시되었습니다15. 더욱이, 포유류 세포에는 원소 탄소의 응집이 없고 탄소 함유 입자가 광학 현미경으로 검은색 입자상 물질로 관찰될 수 있기 때문에 폐포 및 기관지 대식세포의 수집과 그 안의 탄소 함량 측정은 미립자 물질 노출을 평가하기 위한 지표 역할을 할 수 있습니다16.

이 연구는 CCAM(Carbon Content of Airway Macrophages)으로 알려진 개별 미립자 물질 노출 수준을 정확하게 평가하는 방법을 확인했습니다. 구체적으로, 참가자들이 초음파 분무기에서 생성된 긴장성 식염수를 흡입한 후 집단 가래 샘플을 수집했습니다. 그런 다음 이러한 샘플을 고정 용액을 사용하여 보존했습니다. 기도 대식세포를 분리하고, 염색하고, 광학 현미경으로 사진을 찍어 탄소 함유 입자를 포함하는 대식세포를 식별한 다음 정량화했습니다. 이 방법은 개별 미립자 물질 노출 수준을 정확하게 평가하기 위한 생물학적 마커를 제공합니다. 미립자 물질 노출과 건강 영향 사이의 관계를 조사하기 위한 방법론적 기반을 구축하여 PM 노출과 폐 질환과 같은 건강 결과 사이의 연관성을 탐구하기 위한 연구 기반 역할을 합니다.

프로토콜

이 연구는 중국 질병통제예방센터(NIOHP201604)의 산업보건 및 독극물 통제 연구소 의료 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 연구 및 생물학적 샘플 수집 전에 모든 피험자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 본 연구를 위해 카본블랙 공장에서 1년 이상 근무하며 카본블랙 에어로졸에 노출된 카본블랙 패커를 선정하였다. 연구를 확립하기 위해 유해한 요인에 대한 직업적 노출이 크지 않은 상수도 공장의 상수도 근로자를 지역에서 대조군으로 모집했습니다. 연구 모집단에 대해 다음과 같은 포함 및 제외 기준이 선택되었습니다: 카본 블랙 패커에 대한 포함 기준에는 대부분의 교대 근무 중 카본 블랙과의 직접 접촉과 카본 블랙 노출 영역에서의 최소 1년의 작업이 포함되었습니다. 상수도 근로자는 작업 환경에서 카본 블랙 또는 기타 오염 물질에 직업적으로 노출되지 않은 경우 포함되었습니다. 제외 기준은 암 등 만성질환을 앓고 있는 근로자, 지난 3개월 이내에 X-ray에 노출된 근로자, 폐결핵, 폐 수술, 바이러스성 심근염, 선천성 심장 질환, 최근 발열 또는 염증 병력이 있는 근로자, 최근에 항생제를 복용한 근로자를 포함했습니다. 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 가래 보존

  1. 아래 단계에 따라 고정 용액을 준비합니다.
    1. 2% 폴리에틸렌 글리콜(PEG1500)을 수조에 녹입니다. 원심분리기 튜브에 녹은 PEG1500 20mL를 섭취합니다. 원심분리기 튜브에 50% 에탄올 20mL를 넣고 혼합물을 완전히 흔들어 모액을 만듭니다.
    2. 40mL의 모액을 960mL의 50% 에탄올에 서서히 붓습니다. 용액을 잘 흔들어 Saccomanno 고정 용액을 형성합니다. 용액을 서늘하고 어두운 곳에 보관하십시오.
  2. 준비된 정착액 20-30mL를 약 2mL의 가래가 들어 있는 원심분리 튜브에 추가합니다. 내용물을 잘 섞습니다.
    알림: 총 부피가 40mL를 초과하지 않는지 확인하십시오.
  3. 원심분리기 튜브를 밀봉 필름으로 밀봉합니다. 서늘하고 어두운 곳에 보관하십시오. 준비가 되면 추가 처리를 위해 튜브를 실험실로 운반합니다.
    알림: 항상 수조에서 PEG1500 녹이고 규정된 복용량에 따라 사용하십시오.

2. 가래에서 세포 현탁액의 제조

  1. 실제 복용량에 따라 식염수 100mL에 디티오트레이톨 0.1g을 용해하여 소화액을 준비합니다. 준비된 용액을 4°C에서 최대 48시간 동안 보관하십시오.
  2. 가래가 들어 있는 튜브를 1,998 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
  3. 상등액을 버리십시오. 침전물에 동일한 양의 가래 소화물을 첨가하십시오. 혼합물을 소용돌이치고 철저히 흔듭니다.
    1. 완전한 액화(10-15분)가 될 때까지 튜브를 37°C 수조에 넣습니다.
      알림: 액화 과정에서 튜브를 지속적으로 흔듭니다.
  4. 액화 혼합물을 70μm 필터 멤브레인으로 여과합니다.
  5. 여과된 용액을 500 x g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리합니다.
  6. 상등액을 버리고 세포 침전물을 유지합니다.
  7. 세포 침전물을 Duchenne 인산염 완충액에 재현탁시킵니다. 재현탁액을 500 x g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리하여 순수한 세포 침전물을 얻습니다.

3. 세포 도말의 준비

  1. 세포 침전물에 200-600 μL의 인산염 완충액을 추가합니다. 내용물을 철저히 섞으십시오. 세포 계수 결과에 따라 버퍼 부피를 조정합니다(>1.0 × 105 개 세포 목표).
  2. 세포 현탁액 20μL를 취하고 헤마토크릿 방법17을 사용하여 세포 도말을 생성합니다.
  3. 얼룩을 자연 건조시키십시오 (48 시간 이내). 시중에서 판매되는 염색 용액으로 10초 동안 얼룩을 고정합니다.
  4. 얼룩을 A 염색 용액에 8초 동안 담그십시오. 염색하는 동안 슬라이드를 위아래로 부드럽게 들어 올리고 흐르는 물로 과도한 얼룩을 헹굽니다.
  5. B 염색 용액으로 번짐을 8초 동안 염색합니다. 염색하는 동안 슬라이드를 들어 올리고 흐르는 물에 과도한 얼룩을 헹굽니다.
    참고: 염색 용액 A 및 B는 시중에서 판매되는 염색 키트에서 사용할 수 있습니다.
  6. 슬라이드를 무수 에탄올에 두 번, 매번 2-3초 동안 담그십시오.
  7. 건조되면 적당량의 중성 껌을 바르십시오. 커버 슬립으로 슬라이드를 밀봉하십시오.

4. CCAM의 정량 분석

  1. 100x 오일 렌즈 대물렌즈가 있는 광학 현미경을 사용하십시오. 무작위로 선택되고, 염색이 잘 되고, 형태학적으로 손상되지 않은 대식세포의 이미지를 캡처합니다. 각 샘플에 대해 무작위로 50개의 대식세포 사진을 촬영합니다.
  2. 아래 단계에 따라 Image J 소프트웨어에서 이미지 분석을 수행합니다.
    1. 스케일을 측정하고 실제 길이와 픽셀 간 변환(282픽셀 = 10μm)을 결정합니다. 이미지 J(분석 > 스케일 설정)에서 스케일을 설정하고, 픽셀( 픽셀) 거리 , 실제 길이, 길이 단위(μm)를 입력하고, 글로벌 틱을 선택합니다.
    2. 불규칙한 모양을 사용하여 셀의 윤곽을 그립니다. 배경을 제거합니다(자유형 선택, 편집 > 바깥쪽 지우기). 셀의 전체 면적을 측정합니다(Analyze > Measurement).
    3. 핵을 잘라냅니다(Edit > Cut). 회색 음영 이미지를 흑백으로 변환합니다(이미지 > 유형 > 8비트).
    4. 정확한 탄소 입자 계수를 위해 각 세포 염색에 특정한 그레이스케일 값을 조정합니다(이미지 > Apply > Threshold > Apply, Analyze >> Measurement를 조정합니다).
    5. Image J 소프트웨어에서 측정된 면적과 이미지 분석을 기반으로 샘플당 50개 대식세포의 탄소 함량을 계산합니다.

결과

고정액으로 보존 및 처리된 가래는 형태학적 검사 중에 광학 현미경 하에서 온전한 대식세포 형태를 보여주었습니다. 대식세포는 투명하고 둥글거나 신장 모양이며 쉽게 염색할 수 있는 세포핵을 나타냈습니다. 염색 후 세포핵은 청자색으로 보였고 세포질은 연한 분홍색 또는 연한 파란색이었습니다. 현미경 필드는 최소한의 불순물을 보여 주어 세포 식별이 용이했습니...

토론

이 연구는 유도 가래 유래 CCAM을 대기 중 미립자 물질에 대한 내부 노출에 대한 생물학적 마커로 사용하기 위한 상세한 실험 프로토콜을 제시합니다. CCAM은 광학 현미경을 통해 검출하고 정량화할 수 있으며, 건강에 미치는 영향과의 관계를 반영하는 정밀한 내부 노출 바이오마커 역할을 합니다. 따라서 방법론적 절차를 표준화하기 위해 편리하고 신뢰할 수 있으며 효율?...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 중국국가자연과학재단(82273669, 82241086, 42207488), 산둥성 타이산장학생 프로그램(No. tsqn202211121), 산둥성 고등교육 우수 청년 학자를 위한 혁신 및 기술 프로그램(2022KJ295)의 재정 지원을 받았다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
3 mL sterile strawsShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD84202ES03
50 mL centrifuge tubeThermo Fisher Scientific, USA339652
Absolute ethyl alcoholSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD64-17-5
Cedar oilShanghai McLean Biochemical Technology Co., LTDC805296
Diff-quick staining solutionShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD40748ES76
DithiothreitolSolebo Bio Co., LTDD8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)Thermo Fisher Scientific, USA14190144
Microscope cameraOlympus Corporation of JapanDP72
Neutral tree gumSolebo Bio Co., LTDG8590
Nylon filter membrane 70umBD Falcon Bioscience, USA211755
Optical microscopeOlympus Corporation of JapanBX60
Polyethylene glycolSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD25322-68-3
UltracentrifugeThermo Fisher Scientific, USASL40R
Viscous slideJiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD188105

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