Medición del contenido de carbono en macrófagos de las vías respiratorias expuestos a partículas que contienen carbono

Resumen

Este artículo describe un protocolo experimental detallado para medir el contenido de carbono de los macrófagos de las vías respiratorias con el objetivo de evaluar la dosis de exposición interna a nivel de exposición individual a partículas.

Resumen

Los macrófagos pulmonares exhiben un patrón dependiente de la dosis en las partículas fagocitizantes. Después de la inmersión, estos macrófagos se excretan posteriormente con esputo, lo que hace que los macrófagos y las partículas sean visibles y cuantificables bajo microscopía óptica. En particular, el carbono elemental dentro del cuerpo de los mamíferos se origina exclusivamente a partir de contaminantes externos. En consecuencia, el contenido de carbono en los macrófagos de las vías respiratorias (CCAM) sirve como un biomarcador de exposición válido, estimando con precisión la exposición individual a las partículas (PM) que contienen carbono. Este artículo describe un protocolo que involucra la recolección, preservación, procesamiento, preparación de portaobjetos y tinción, así como la adquisición y análisis de fotos de macrófagos. Después de eliminar los núcleos de los macrófagos, se calculó la proporción de área del citoplasma ocupada por partículas de carbono (PCOC) para cuantificar el contenido de carbono en cada macrófago. Los resultados indican una elevación en los niveles de CCAM después de la exposición a PM que contiene carbono. En resumen, este método no invasivo, preciso, confiable y estandarizado permite la medición directa de partículas de carbono dentro de las células objetivo y se utiliza para la cuantificación a gran escala de CCAM individuales a través de esputo inducido.

Introducción

La contaminación del aire ambiente está asociada a muertes por enfermedades respiratorias y cardiovasculares, lo que supone una grave amenaza para la salud humana ^1,2. Los datos epidemiológicos indican que la exposición crónica a partículas ambientales de menos de 2,5 μm de diámetro (PM2,5) es responsable de la muerte prematura de entre 4 y 9 millones de personas en todo el mundo. Las PM2.5 fueron clasificadas como el quinto factor de riesgo más importante para la mortalidad mundial en el Estudio de la Carga Global de Enfermedades, Lesiones y Factores de Riesgo (GBD) de 20153,4,5,6. Los estudios han revelado que el cumplimiento de las directrices de la OMS sobre contaminación atmosférica podría evitar 51.213 muertes al año por exposición a PM2,5³. En la actualidad, la mayoría de los estudios carecen de la evaluación de la exposición intraindividual y sólo se basan en evaluaciones crudas en centros de vigilancia regionales más amplios, que están lejos de los niveles de exposición individual. Los biomarcadores disponibles de exposición interna, como los HAP urinarios y el benzo(a)pireno, no reflejan las asociaciones entre la exposición a material particulado y los efectos sobre la salud ^7,8,9. Esto conduce a la incapacidad de establecer una relación precisa con los efectos sobre la salud. Por lo tanto, la búsqueda de marcadores que reflejen el nivel de exposición a partículas en un individuo es una de las claves para una evaluación precisa de la exposición de los individuos.

Las partículas inhaladas en los bronquios pueden excretarse con el esputo a través de oscilaciones ciliares en los bronquios. La ausencia de un sistema de transporte de flujo mucoso ciliado en los alvéolos significa que la principal ruta de eliminación de las partículas que ingresan a los alvéolos es a través de la fagocitosis y la translocación por los macrófagos^10,11. Según la estructura anatómica del pulmón, su eliminación de partículas extrañas insolubles es lenta. Esto permite que el material particulado interactúe con las células pulmonares durante períodos prolongados e inicie diversos efectos biológicos, causando daño al tejido pulmonar y otros órganos^12,13. La estimulación por material particulado conduce a la activación de los macrófagos, desencadenando una cascada de factores inflamatorios en los pulmones que pueden causar una respuesta inflamatoria sistémica¹⁴. Teniendo en cuenta el papel crucial de la citofagia de macrófagos en la provocación de tormentas de citoquinas en los pulmones, se teoriza que las partículas de carbono de los macrófagos pulmonares podrían reflejar la dosis biológicamente efectiva^{de exposición a} partículas nucleadas de carbono en el aire. Además, dado que no hay agregación de carbono elemental en las células de los mamíferos y las partículas que contienen carbono pueden observarse como partículas negras bajo un microscopio óptico, la recolección de macrófagos alveolares y bronquiales y la medición del contenido de carbono en ellos puede servir como marcador para evaluar la exposición a la materia^{particulada 16}.

Este estudio identificó un método para evaluar con precisión los niveles individuales de exposición a partículas, conocido como el contenido de carbono de los macrófagos de las vías respiratorias (CCAM). En concreto, se recogieron muestras de esputo de la población después de que los participantes inhalaran solución salina hipertónica generada por un nebulizador ultrasónico. A continuación, estas muestras se conservaron utilizando una solución fijadora. Los macrófagos de las vías respiratorias se aislaron, se tiñeron y se fotografiaron bajo un microscopio óptico para identificar los macrófagos que contenían partículas que contenían carbono, que luego se cuantificaron. Este método proporciona un marcador biológico para evaluar con precisión los niveles individuales de exposición a partículas. Establece una base metodológica para investigar la relación entre la exposición a partículas y los efectos en la salud, sirviendo como base de investigación para explorar las asociaciones entre la exposición a PM y los resultados de salud, como las enfermedades pulmonares.

Protocolo

El estudio recibió la aprobación del Comité de Ética Médica del Instituto de Salud Ocupacional y Control de Envenenamientos, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (NIOHP201604), con el consentimiento informado por escrito obtenido de todos los sujetos antes del estudio y la recolección de muestras biológicas. Para este estudio, se seleccionaron empacadores de negro de humo que habían estado trabajando en una fábrica de negro de humo durante más de 1 año y estuvieron expuestos a aerosoles de negro de humo. Para llevar a cabo el estudio, se reclutó a trabajadores de una fábrica de agua hidráulica sin exposición ocupacional significativa a factores nocivos de la zona como población de control. Se seleccionaron los siguientes criterios de inclusión y exclusión para la población de estudio: Los criterios de inclusión para los empacadores de negro de humo incluyeron el contacto directo con el negro de humo durante la mayoría de los turnos y un mínimo de un año de trabajo en el área de exposición al negro de humo. Se incluyó a los trabajadores de obras hidráulicas que no habían tenido exposición ocupacional al negro de humo u otros contaminantes en su entorno de trabajo. Los criterios de exclusión abarcaron a los trabajadores con enfermedades crónicas como el cáncer, aquellos que habían estado expuestos a rayos X en los últimos tres meses, individuos con antecedentes de tuberculosis pulmonar, cirugía pulmonar, miocarditis viral, cardiopatía congénita, fiebre o inflamación reciente y trabajadores que habían tomado antibióticos recientemente. Los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Conservación del esputo

1. Prepare la solución fijadora siguiendo los pasos que se indican a continuación:
   1. Derretir un 2% de polietilenglicol (PEG1500) en un baño de agua. Tome 20 ml de PEG1500 derretida en un tubo de centrífuga. Agregue 20 ml de etanol al 50% al tubo de centrífuga y agite bien la mezcla para crear el licor madre.
   2. Vierta gradualmente 40 mL del licor madre en 960 mL de etanol al 50%. Agite bien la solución para formar la solución de fijación Saccomanno. Guarde la solución en un lugar fresco y oscuro.
2. Agregue 20-30 mL de la solución fijadora preparada a un tubo de centrífuga que contenga aproximadamente 2 mL de esputo. Mezcle bien el contenido.
   NOTA: Asegúrese de que el volumen total no exceda los 40 ml.
3. Selle el tubo de centrífuga con una película de sellado. Guárdelo en un lugar fresco y oscuro. Transporta el tubo al laboratorio para su posterior procesamiento cuando esté listo.
   NOTA: Siempre derrita PEG1500 en un baño de agua y úselo según la dosis prescrita.

2. Preparación de la suspensión celular en el esputo

1. Prepare la solución digestiva disolviendo 0,1 g de ditiotreitol en 100 ml de solución salina según la dosis real. Almacene la solución preparada a 4 °C durante un máximo de 48 h.
2. Centrifugar el tubo que contiene el esputo a 1.998 x g durante 30 min a 4 °C.
3. Deseche el sobrenadante. Agregue un volumen igual de digestión de esputo al precipitado. Agite bien la mezcla.
   1. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C hasta que se complete la licuefacción (10-15 min).
      NOTA: Agite continuamente el tubo durante el proceso de licuefacción.
4. Filtre la mezcla licuada con una membrana filtrante de 70 μm.
5. Centrifugar la solución filtrada a 500 x g durante 7 min a 4 °C.
6. Desechar el sobrenadante, reteniendo el precipitado celular.
7. Vuelva a suspender el precipitado celular en el tampón de fosfato de Duchenne. Centrifugar la solución resuspendida a 500 x g durante 7 min a 4 °C para obtener un precipitado de célula pura.

3. Preparación del frotis celular

1. Añadir 200-600 μL de tampón de fosfato al sedimento celular. Mezcle bien el contenido; Ajuste el volumen del búfer en función de los resultados del recuento de células (apunte a >1,0 × 10⁵ celdas).
2. Tome 20 μL de la suspensión celular y cree un frotis celular utilizando el método del hematocrito¹⁷.
3. Deje que la mancha se seque al aire de forma natural (dentro de las 48 h). Fije el frotis con una solución de tinción disponible en el mercado durante 10 s.
4. Sumerja el frotis en una solución de tinción A durante 8 s. Durante la tinción, levante suavemente el portaobjetos hacia arriba y hacia abajo y enjuague el exceso de mancha con agua corriente.
5. Teñir el frotis en solución de tinción B durante 8 s. Levante el portaobjetos durante la tinción y enjuague el exceso de mancha con agua corriente.
   NOTA: Las soluciones de tinción A y B están disponibles en el kit de tinción disponible comercialmente.
6. Sumerja el portaobjetos en etanol anhidro dos veces, cada vez durante 2-3 s.
7. Una vez seco, aplicar una cantidad adecuada de goma neutra. Selle la corredera con cubreobjetos.

4. Análisis cuantitativo de CCAM

1. Utilice un microscopio óptico con un objetivo de lente de aceite de 100x. Capture imágenes de macrófagos seleccionados al azar, bien teñidos y morfológicamente intactos. Tome 50 imágenes de macrófagos al azar para cada muestra.
2. Realice el análisis de imágenes en el software Image J siguiendo los pasos que se indican a continuación:
   1. Mida la escala y determine la longitud real y la conversión de píxel a píxel (282 píxeles = 10 μm). Establezca la escala en Imagen J (Analizar > Establecer escala), ingrese Distancia en píxeles, longitud real, unidad de longitud (μm) y marque Global.
   2. Usa una forma irregular para delinear las celdas. Elimine el fondo (selecciones a mano alzada, Editar > Borrar exterior). Mida el área total de las celdas (Analizar > medición).
   3. Recorta el núcleo (Editar > Cortar). Convierta la imagen en escala de grises a blanco y negro (Tipo de imagen > > 8 bits).
   4. Ajuste el valor de la escala de grises específico de cada tinción celular para un recuento preciso de partículas de carbono (imagen > Ajustar > umbral > aplicar, analizar >> medición).
   5. Calcule el contenido de carbono de 50 macrófagos por muestra en función del área medida y el análisis de imágenes en el software Image J.

Resultados

El esputo, conservado y procesado con la solución fijadora, mostró una morfología de macrófago intacta bajo un microscopio óptico durante el examen morfológico. Los macrófagos exhibían núcleos celulares claros, redondos o en forma de riñón, fácilmente teñibles. Después de la tinción, los núcleos celulares aparecieron de color púrpura azulado, mientras que el citoplasma era de color rosa claro o azul claro. El campo microscópico mostró impurezas mínimas, lo que facilit...

Discusión

Este estudio presenta un protocolo experimental detallado para el uso de CCAM derivado del esputo inducido como marcador biológico para la exposición interna a material particulado atmosférico. La CCAM puede detectarse y cuantificarse mediante microscopía óptica, sirviendo como un biomarcador de exposición interna preciso que refleja la relación con los efectos sobre la salud. Por lo tanto, existe la necesidad de establecer y optimizar un método de preservación de esputo inducid...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL sterile straws	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	84202ES03
50 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific, USA	339652
Absolute ethyl alcohol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	64-17-5
Cedar oil	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD	C805296
Diff-quick staining solution	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	40748ES76
Dithiothreitol	Solebo Bio Co., LTD	D8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)	Thermo Fisher Scientific, USA	14190144
Microscope camera	Olympus Corporation of Japan	DP72
Neutral tree gum	Solebo Bio Co., LTD	G8590
Nylon filter membrane 70um	BD Falcon Bioscience, USA	211755
Optical microscope	Olympus Corporation of Japan	BX60
Polyethylene glycol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	25322-68-3
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	SL40R
Viscous slide	Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD	188105