JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, bireysel partikül madde maruziyeti düzeyinde iç maruziyet dozunu değerlendirmek amacıyla hava yolu makrofajlarının karbon içeriğini ölçmek için ayrıntılı bir deneysel protokolü açıklamaktadır.

Özet

Pulmoner makrofajlar, fagositize edici partiküllerde doza bağlı bir patern sergiler. Yutulduktan sonra, bu makrofajlar daha sonra balgamla atılır, makrofajları ve parçacıkları ışık mikroskobu altında görünür ve ölçülebilir hale getirir. Özellikle, memeli vücudundaki elementel karbon, yalnızca dış kirleticilerden kaynaklanır. Sonuç olarak, hava yolu makrofajlarındaki (CCAM) karbon içeriği, karbon içeren partikül maddeye (PM) bireysel maruziyeti doğru bir şekilde tahmin eden geçerli bir maruziyet biyobelirteç görevi görür. Bu makale, balgam toplama, koruma, işleme, slayt hazırlama ve boyamanın yanı sıra makrofaj fotoğraf toplama ve analizini içeren bir protokolü tanımlamaktadır. Makrofaj çekirdekleri çıkarıldıktan sonra, her makrofajdaki karbon içeriğini ölçmek için karbon parçacıklarının (PCOC) kapladığı sitoplazma alanının oranı hesaplandı. Sonuçlar, karbon içeren PM'ye maruz kaldıktan sonra CCAM seviyelerinde bir yükselme olduğunu göstermektedir. Özetle, bu non-invaziv, hassas, güvenilir ve standartlaştırılmış yöntem, hedef hücrelerdeki karbon partiküllerinin doğrudan ölçülmesini sağlar ve indüklenmiş balgam yoluyla bireysel CCAM'ın büyük ölçekli miktar tayini için kullanılır.

Giriş

Ortam hava kirliliği, solunum ve kardiyovasküler hastalıklara bağlı ölümlerle ilişkili olup, insan sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır 1,2. Epidemiyolojik veriler, çapı 2,5 μm veya daha küçük (PM2.5) olan ortamdaki partikül maddeye kronik maruziyetin dünya çapında 4 ila 9 milyon insanın erken ölümlerinden sorumlu olduğunu göstermektedir. PM2.5, 2015 Küresel Hastalık, Yaralanmalar ve Risk Faktörleri Yükü Çalışması'nda (GBD) küresel mortalite için beşinci en önemli risk faktörü olarak sıralanmıştır3,4,5,6. Çalışmalar, DSÖ hava kirliliği yönergelerine uymanın PM2.5 maruziyetinden yılda 51.213 ölümü önleyebileceğini bulmuştur3. Şu anda, çoğu çalışma birey içi maruziyetin değerlendirilmesinden yoksundur ve yalnızca bireysel maruziyet seviyelerinden uzak olan daha büyük bölgesel izleme alanlarındaki kaba değerlendirmelere dayanmaktadır. İdrar PAH'ları ve benzo(a)piren gibi dahili maruziyetin mevcut biyobelirteçleri, partikül madde maruziyetleri ile sağlık etkileriarasındaki ilişkileri yansıtmamaktadır 7,8,9. Bu da sağlık etkileri ile doğru bir ilişki kurulamamasına yol açmaktadır. Bu nedenle, bir bireyde partikül maddeye maruz kalma seviyesini yansıtan belirteçlerin araştırılması, bireyler için doğru maruziyet değerlendirmesinin anahtarlarından biridir.

Bronşlara solunan partiküller, bronşlardaki siliyer salınımlar yoluyla balgam ile atılabilir. Alveollerde kirpikli bir mukoza akış taşıma sisteminin olmaması, alveollere giren partiküller için birincil temizleme yolunun fagositoz ve makrofajlar tarafından translokasyon yoluyla olduğu anlamına gelir10,11. Akciğerin anatomik yapısına bağlı olarak, çözünmeyen partikül yabancı maddelerin temizlenmesi yavaştır. Bu, partikül maddenin akciğer hücreleri ile uzun süre etkileşime girmesine ve çeşitli biyolojik etkiler başlatmasına izin vererek akciğer dokusuna ve diğer organlara zarar verir12,13. Partikül madde tarafından stimülasyon, makrofaj aktivasyonuna yol açar ve akciğerlerde sistemik bir inflamatuar yanıta neden olabilecek bir dizi inflamatuar faktörü tetikler14. Makrofaj sitofajisinin akciğerlerde sitokin fırtınalarını ortaya çıkarmadaki kritik rolü göz önüne alındığında, akciğer makrofajlarından gelen karbon partiküllerinin, havadaki karbon çekirdekli partikül maruziyetinin biyolojik olarak etkili dozunu yansıtabileceği teorize edilmiştir15. Ayrıca, memeli hücrelerinde elementel karbon agregasyonu olmadığından ve karbon içeren parçacıklar ışık mikroskobu altında siyah partikül madde olarak gözlemlenebildiğinden, alveolar ve bronşiyal makrofajların toplanması ve bunlardaki karbon içeriğinin ölçülmesi, partikül madde maruziyetinin değerlendirilmesi için bir belirteç görevi görebilir16.

Bu çalışma, Havayolu Makrofajlarının Karbon İçeriği (CCAM) olarak bilinen bireysel partikül madde maruziyet seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem tanımlamıştır. Spesifik olarak, popülasyon balgam örnekleri, katılımcılar ultrasonik bir nebülizör tarafından üretilen hipertonik salini soluduktan sonra toplandı. Bu örnekler daha sonra fiksatif bir çözelti kullanılarak korundu. Hava yolu makrofajları izole edildi, boyandı ve karbon içeren parçacıklar içeren makrofajları tanımlamak için ışık mikroskobu altında fotoğraflandı ve bunlar daha sonra niceliklendirildi. Bu yöntem, bireysel partikül madde maruziyet seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için biyolojik bir belirteç sağlar. Partikül madde maruziyeti ile sağlık etkileri arasındaki ilişkiyi araştırmak için metodolojik bir temel oluşturur ve PM maruziyeti ile akciğer hastalıkları gibi sağlık sonuçları arasındaki ilişkileri araştırmak için bir araştırma temeli görevi görür.

Protokol

Çalışma, Çin Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (NIOHP201604) İş Sağlığı ve Zehir Kontrol Enstitüsü Tıbbi Etik Komitesi'nden, çalışma ve biyolojik örnek toplama öncesinde tüm deneklerden yazılı bilgilendirilmiş onam alınarak onay aldı. Bu çalışma için, 1 yıldan fazla bir süredir karbon siyahı fabrikasında çalışan ve karbon siyahı aerosollerine maruz kalan karbon siyahı paketleyicileri seçildi. Zararlı faktörlere önemli bir mesleki maruziyeti olmayan bir su işleri fabrikasındaki su işleri işçileri, çalışmayı kurmak için yerel bölgeden kontrol popülasyonu olarak işe alındı. Çalışma popülasyonu için aşağıdaki dahil etme ve dışlama kriterleri seçilmiştir: Karbon siyahı paketleyicileri için dahil etme kriterleri, çoğu vardiya sırasında karbon siyahı ile doğrudan teması ve karbon siyahına maruz kalma alanında en az bir yıllık çalışmayı içeriyordu. Su işleri çalışanları, çalışma ortamlarında karbon siyahı veya diğer kirleticilere mesleki olarak maruz kalmamışlarsa dahil edildi. Dışlama kriterleri, kanser gibi kronik hastalıkları olan çalışanları, son üç ay içinde X-ışınına maruz kalmış olanları, akciğer tüberkülozu, akciğer cerrahisi, viral miyokardit, konjenital kalp hastalığı, yakın zamanda ateş veya iltihaplanma öyküsü olan bireyleri ve yakın zamanda antibiyotik almış işçileri kapsıyordu. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Balgam koruma

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek sabitleyici çözeltiyi hazırlayın:
    1. Bir su banyosunda% 2 polietilen glikolü (PEG1500) eritin. Bir santrifüj tüpünde 20 mL erimiş PEG1500 alın. Santrifüj tüpüne 20 mL %50 etanol ekleyin ve ana likörü oluşturmak için karışımı iyice çalkalayın.
    2. Yavaş yavaş 40 mL ana likörü 960 mL% 50 etanole dökün. Saccomanno fiksasyon solüsyonunu oluşturmak için solüsyonu iyice çalkalayın. Solüsyonu serin ve karanlık bir yerde saklayın.
  2. Hazırlanan fiksatif solüsyondan 20-30 mL ilave edilerek yaklaşık 2 mL balgam içeren bir santrifüj tüpüne ilave edilir. İçeriği iyice karıştırın.
    NOT: Toplam hacmin 40 mL'yi geçmediğinden emin olun.
  3. Santrifüj tüpünü bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Serin ve karanlık bir yerde saklayın. Hazır olduğunda daha fazla işlem için tüpü laboratuvara taşıyın.
    NOT: Her zaman bir su banyosunda PEG1500 eritin ve belirtilen doza göre kullanın.

2. Balgamda hücre süspansiyonunun hazırlanması

  1. Gerçek doza göre 0.1 g ditiyotreitol'ü 100 mL salin içinde çözerek sindirim çözeltisini hazırlayın. Hazırlanan çözeltiyi 4 ° C'de 48 saate kadar saklayın.
  2. Balgam içeren tüpü 1.998 x g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı atın. Çökeltiye eşit miktarda balgam sindirimi ekleyin. Karışımı girdap haline getirin ve iyice çalkalayın.
    1. Tüpü tamamen sıvılaşana kadar (10-15 dakika) 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
      NOT: Sıvılaştırma işlemi sırasında tüpü sürekli olarak sallayın.
  4. Sıvılaştırılmış karışımı 70 μm'lik bir filtre membranı ile filtreleyin.
  5. Filtrelenmiş çözeltiyi 500 x g'da 4 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin.
  6. Hücre çökeltisini koruyarak süpernatanı atın.
  7. Hücre çökeltisini Duchenne fosfat tamponunda yeniden süspanse edin. Saf bir hücre çökeltisi elde etmek için yeniden süspanse edilmiş çözeltiyi 500 x g'da 4 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin.

3. Hücre yaymasının hazırlanması

  1. Hücre tortusuna 200-600 μL fosfat tamponu ekleyin. İçeriği iyice karıştırın; Arabellek hacmini hücre sayımı sonuçlarına göre ayarlayın (105 hücre × >1.0 hedefleyin).
  2. 20 μL hücre süspansiyonu alın ve hematokrit yöntemini17 kullanarak bir hücre yayması oluşturun.
  3. Smear'ın doğal olarak kurumasını bekleyin (48 saat içinde). Smear'ı 10 saniye boyunca piyasada bulunan bir boyama solüsyonu ile sabitleyin.
  4. Smear'ı 8 saniye boyunca bir boyama solüsyonuna daldırın. Boyama sırasında, sürgüyü yavaşça yukarı ve aşağı kaldırın ve fazla lekeyi akan su ile durulayın.
  5. Smear lekesini B boyama solüsyonunda 8 saniye boyunca boyayın. Boyama sırasında slaytı kaldırın ve fazla lekeyi akan su altında durulayın.
    NOT: Boyama solüsyonları A ve B, piyasada bulunan boyama kitinde mevcuttur.
  6. Slaytı susuz etanole iki kez, her seferinde 2-3 saniye batırın.
  7. Kuruduktan sonra uygun miktarda nötr sakız uygulayın. Slaytı lamel ile kapatın.

4. CCAM'ın kantitatif analizi

  1. 100x yağ merceği objektifine sahip bir ışık mikroskobu kullanın. Rastgele seçilmiş, iyi boyanmış ve morfolojik olarak bozulmamış makrofajların görüntülerini yakalayın. Her örnek için rastgele 50 makrofaj resmi çekin.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek Image J yazılımında görüntü analizi gerçekleştirin:
    1. Ölçeği ölçün ve gerçek uzunluğu ve pikselden piksele dönüşümü belirleyin (282 piksel = 10 μm). Görüntü J'de ölçeği ayarlayın (Analiz > Ölçeği ayarlayın), piksel cinsinden Mesafeyi , gerçek uzunluğu, uzunluk birimini (μm) girin ve Global'i işaretleyin.
    2. Hücrelerin ana hatlarını çizmek için düzensiz bir şekil kullanın. Arka planı kaldırın (serbest seçimler, Düzenle > Dışını temizle). Hücrelerin toplam alanını ölçün (Analiz > Ölçüm).
    3. Çekirdeği kesin (Düzenle > Kes). Gri tonlamalı görüntüyü siyah beyaza dönüştürün (Görüntü > Türü > 8 bit).
    4. Doğru karbon partikül sayımı için her hücre boyamaya özgü gri tonlama değerini ayarlayın (Resim > Uygula, Analiz Et >> Ölçümü > > Eşiğini Ayarlayın).
    5. Ölçülen alana ve Image J yazılımındaki görüntü analizine dayalı olarak numune başına 50 makrofajın karbon içeriğini hesaplayın.

Sonuçlar

Fiksatif solüsyon ile korunan ve işlenen balgam, morfolojik inceleme sırasında optik mikroskop altında sağlam makrofaj morfolojisi gösterdi. Makrofajlar berrak, yuvarlak veya böbrek şeklinde, kolayca boyanabilir hücre çekirdekleri sergiledi. Boyamayı takiben, hücre çekirdeği mavimsi-mor görünürken, sitoplazma açık pembe veya açık mavi idi. Mikroskobik alan, kolay hücre tanımlamasını kolaylaştıran minimal safsızlıklar gösterdi. Hücrelerin içinde, siyah kar...

Tartışmalar

Bu çalışma, atmosferik partikül maddeye dahili maruziyet için biyolojik bir belirteç olarak indüklenmiş balgamdan türetilmiş CCAM'ın kullanılması için ayrıntılı bir deneysel protokol sunmaktadır. CCAM, optik mikroskopi ile tespit edilebilir ve ölçülebilir, bu da sağlık etkileri ile ilişkiyi yansıtan hassas bir dahili maruziyet biyobelirteç görevi görür. Bu nedenle, metodolojik prosedürleri standartlaştırmak için uygun, güvenilir ve verimli bir indüklenm...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82273669, 82241086, 42207488), Shandong Eyaleti Taishan Bursiyerleri Programı (No. tsqn202211121) ve Shandong Eyaleti Yüksek Öğretimin Mükemmel Genç Akademisyenleri için İnovasyon ve Teknoloji Programı (2022KJ295) tarafından mali olarak desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3 mL sterile strawsShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD84202ES03
50 mL centrifuge tubeThermo Fisher Scientific, USA339652
Absolute ethyl alcoholSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD64-17-5
Cedar oilShanghai McLean Biochemical Technology Co., LTDC805296
Diff-quick staining solutionShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD40748ES76
DithiothreitolSolebo Bio Co., LTDD8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)Thermo Fisher Scientific, USA14190144
Microscope cameraOlympus Corporation of JapanDP72
Neutral tree gumSolebo Bio Co., LTDG8590
Nylon filter membrane 70umBD Falcon Bioscience, USA211755
Optical microscopeOlympus Corporation of JapanBX60
Polyethylene glycolSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD25322-68-3
UltracentrifugeThermo Fisher Scientific, USASL40R
Viscous slideJiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD188105

Referanslar

  1. Münzel, T., et al. Environmental stressors and cardio-metabolic disease: part I-epidemiologic evidence supporting a role for noise and air pollution and effects of mitigation strategies. Eur Heart J. 38 (8), 550-556 (2017).
  2. Guarnieri, M., et al. Lung function in rural Guatemalan women before and after a chimney stove intervention to reduce wood smoke exposure: results from the randomized exposure study of pollution indoors and respiratory effects and chronic respiratory effects of early childhood exposure to respirable particulate matter study. Chest. 148 (5), 1184-1192 (2015).
  3. Khomenko, S., et al. Premature mortality due to air pollution in European cities: a health impact assessment. Lancet Planet Health. 5 (3), e121-e134 (2021).
  4. Kulkarni, N., Pierse, N., Rushton, L., Grigg, J. Carbon in airway macrophages and lung function in children. N Engl J Med. 355 (1), 21-30 (2006).
  5. Krzyzanowski, M. WHO air quality guidelines for Europe. J Toxicol Environ Health A. 71 (1), 47-50 (2008).
  6. Cohen, A. J., et al. Estimates and 25-year trends of the global burden of disease attributable to ambient air pollution: An analysis of data from the Global Burden of Diseases Study 2015. Lancet. 389 (10082), 1907-1918 (2017).
  7. Hajat, A., et al. The association between long-term air pollution and urinary catecholamines: Evidence from the multi-ethnic study of atherosclerosis. Environ Health Perspect. 127 (5), 57007 (2019).
  8. . Traffic-related air pollution: A critical review of the literature on emissions, exposure, and health effects Available from: https://www.healtheffects.org/publication/traffic-related-air-pollution-critical-review-literature-emissions-exposure-and-health (2010)
  9. Uccelli, R., et al. Female lung cancer mortality and long-term exposure to particulate matter in Italy. Eur J Public Healt.h. 27 (1), 178-183 (2017).
  10. Zhang, L., et al. Indoor particulate matter in urban households: sources, pathways, characteristics, health effects, and exposure mitigation. Int J Environ Res Public Health. 18 (21), 11055 (2021).
  11. Wang, K., Zeng, R. Cough and expectoration. Handbook of Clinical Diagnostics. , 27-29 (2020).
  12. Qi, Y., et al. Passage of exogeneous fine particles from the lung into the brain in humans and animals. PNAS. 119 (26), e2117083119 (2022).
  13. Comunian, S., Dongo, D., Milani, C., Palestini, P. Air pollution and COVID-19: The role of particulate matter in the spread and increase of COVID-19's morbidity and mortality. Int J Environ Res Public Health. 17 (12), 4487 (2020).
  14. Sharma, J., et al. Emerging role of mitochondria in airborne particulate matter-induced immunotoxicity. Environ Pollut. 270, 116242 (2021).
  15. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066 (2020).
  16. Kupiainen, K., Klimont, Z. Primary emissions of fine carbonaceous particles in Europe. Atmos Environ. 41 (10), 2156-2170 (2007).
  17. Tueller, C., et al. Value of smear and PCR in bronchoalveolar lavage fluid in culture positive pulmonary tuberculosis. Eur Respir J. 26 (5), 767-772 (2005).
  18. Takiguchi, H., et al. Macrophages with reduced expressions of classical M1 and M2 surface markers in human bronchoalveolar lavage fluid exhibit pro-inflammatory gene signatures. Sci Rep. 11 (1), 8282 (2021).
  19. Andelid, K., et al. Lung macrophages drive mucus production and steroid-resistant inflammation in chronic bronchitis. Resp Res. 22 (1), 172 (2021).
  20. Weiszhar, Z., Horvath, I. Induced sputum analysis: Step by step. Eur Respiratory Soc. 9, 300-306 (2013).
  21. Popov, T., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis. Eur Respir J. 8 (4), 559-565 (1995).
  22. Sumner, H., et al. Predictors of objective cough frequency in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 187 (9), 943-949 (2013).
  23. Brugha, R. E., et al. Carbon in airway macrophages from children with asthma. Thorax. 69 (7), 654-659 (2014).
  24. Simpson, J. L., Timmins, N. L., Fakes, K., Talbot, P. I., Gibson, P. G. Effect of saliva contamination on induced sputum cell counts, IL-8 and eosinophil cationic protein levels. Eur Respir J. 23 (5), 759-762 (2004).
  25. Risse, E. K., Van't Hof, M. A., Laurini, R. N., Vooijs, P. G. Sputum cytology by the Saccomanno method in diagnosing lung malignancy. Diagn Cytopathol. 1 (4), 286-291 (1985).
  26. Eells, T. P., Pratt, D. S., Coppolo, D. P., Alpern, H. D., May, J. J. An improved method of cell recovery following bronchial brushing. Chest. 93 (4), 727-729 (1988).
  27. Bai, Y., et al. Mitochondrial DNA content in blood and carbon load in airway macrophages. A panel study in elderly subjects. Environ Int. 119, 47-53 (2018).
  28. Jary, H., Rylance, J., Patel, L., Gordon, S. B., Mortimer, K. Comparison of methods for the analysis of airway macrophage particulate load from induced sputum, a potential biomarker of air pollution exposure. BMC Pulm Med. 15, 1-9 (2015).
  29. Gilbert, D. F., Meinhof, T., Pepperkok, R., Runz, H. DetecTiff: A novel image analysis routine for high-content screening microscopy. J Biomol Screen. 14 (8), 944-955 (2009).
  30. Dai, Y., et al. Effects of occupational exposure to carbon black on peripheral white blood cell counts and lymphocyte subsets. Environ Mol Mutagen. 57 (8), 615-622 (2016).
  31. Cheng, W., et al. Carbon content in airway macrophages and genomic instability in Chinese carbon black packers. Arch Toxicol. 94 (3), 761-771 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Karbon eri iHavayolu MakrofajlarPartik l MaddeMaruziyet BiyobelirteBalgam ToplamaMakrofaj AnaliziElementel KarbonKarbon Partik lleriKantitatif l mFagositize Edici Partik llerNon invaziv Y ntemI k MikroskobuSitoplazma AlanAra t rma Protokol

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır