炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

要約

この記事では、個々の粒子状物質曝露レベルでの内部被ばく線量を評価することを目的として、気道マクロファージの炭素含有量を測定するための詳細な実験プロトコルについて説明します。

要約

肺マクロファージは、食作用粒子において用量依存的なパターンを示します。飲み込んだ後、これらのマクロファージは喀痰とともに排泄され、マクロファージと粒子を光学顕微鏡で可視化し、定量化することができます。特に、哺乳類の体内の元素炭素は、もっぱら外部の汚染物質に由来します。その結果、気道マクロファージ(CCAM)の炭素含有量は、炭素含有粒子状物質(PM)への個々の曝露を正確に推定する有効な曝露バイオマーカーとして機能します。この記事では、喀痰の収集、保存、処理、スライド調製、染色、およびマクロファージの写真取得と分析を含むプロトコルについて説明します。マクロファージ核を抜去した後、炭素粒子が占める細胞質面積の割合(PCOC)を計算し、各マクロファージの炭素含有量を定量化しました。結果は、炭素含有PMへの曝露後のCCAMレベルの上昇を示しています。要約すると、この非侵襲的で、正確で、信頼性が高く、標準化された方法により、標的細胞内の炭素粒子の直接測定が可能になり、誘導された喀痰による個々のCCAMの大規模な定量に利用されます。

概要

周囲の大気汚染は、呼吸器疾患や心血管疾患による死亡と関連しており、人間の健康に深刻な脅威をもたらしています^1,2。疫学データによると、直径2.5μm以下の大気粒子状物質(PM2.5)への慢性的な曝露は、世界中で400万人から900万人の早期死亡の原因となっています。PM2.5は、2015年のGlobal Burden of Disease, Injuries, and Risk Factors Study(GBD)3,4,5,6において、世界の死亡の5番目に重要な危険因子としてランク付けされました。研究によると、WHOの大気汚染ガイドラインを順守することで、PM2.5曝露による年間51,213人の死亡を防ぐことができることがわかっています³。現在、ほとんどの研究は個人内被ばくの評価を欠いており、個々のばく露レベルから遠く離れた、より大きな地域のモニタリングサイトでの大まかな評価のみに基づいています。尿中PAHsやベンゾ(a)ピレンなど、内部被ばくの利用可能なバイオマーカーは、粒子状物質被ばくと健康影響との関連を反映していない^7,8,9。これにより、健康への影響と正確な関係を確立できなくなります。したがって、個人の粒子状物質曝露レベルを反映するマーカーの検索は、個人の正確な曝露評価の鍵の1つです。

気管支に吸入された粒子は、気管支の毛様体振動を通じて痰とともに排泄される可能性があります。肺胞に繊毛粘液流輸送系がないということは、肺胞に入る粒子の主要なクリアランス経路が、食作用とマクロファージによる転座であることを意味します^10,11。肺の解剖学的構造に基づいて、不溶性粒子異物の除去は遅いです。これにより、粒子状物質が長期間にわたって肺細胞と相互作用し、さまざまな生物学的影響を引き起こし、肺組織や他の臓器に損傷を与えることができます^12,13。粒子状物質による刺激はマクロファージの活性化につながり、肺内の炎症性因子のカスケードを引き起こし、全身性炎症反応を引き起こす可能性があります¹⁴。マクロファージのサイトカインストームの誘発におけるマクロファージの細胞性の重要な役割を考慮すると、肺マクロファージからの炭素粒子粒子は、空気中の炭素核粒子曝露の生物学的に有効な線量を反映している可能性があると理論化されている¹⁵。さらに、哺乳類の細胞には元素状の炭素の凝集がなく、炭素を含む粒子を光学顕微鏡で黒色粒子状物質として観察できることから、肺胞および気管支のマクロファージの収集およびそれらの中の炭素含有量の測定は、粒子状物質曝露を評価するためのマーカーとして役立つことができる¹⁶。

この研究では、気道マクロファージの炭素含有量(CCAM)として知られる、個々の粒子状物質曝露レベルを正確に評価する方法が特定されました。具体的には、参加者が超音波ネブライザーによって生成された高張生理食塩水を吸入した後、集団喀痰サンプルが収集されました。次に、これらのサンプルを固定液を使用して保存しました。気道マクロファージを単離、染色、光学顕微鏡で撮影して、炭素含有粒子を含むマクロファージを同定し、それを定量しました。この方法は、個々の粒子状物質の曝露レベルを正確に評価するための生物学的マーカーを提供します。これは、粒子状物質への曝露と健康への影響との関係を調査するための方法論的基盤を確立し、PM曝露と肺疾患などの健康転帰との関連を調査するための研究基盤として機能します。

プロトコル

この研究は、中国疾病管理予防センター(NIOHP201604)の労働衛生毒物管理研究所の医療倫理委員会から承認を受け、研究および生物学的サンプルの収集に先立って、すべての被験者から書面によるインフォームドコンセントを取得しました。この研究では、カーボンブラック工場で1年以上働いており、カーボンブラックエアロゾルにさらされたカーボンブラックパッカーが選択されました。有害な要因への重大な職業的曝露がない水道工場の水道労働者は、研究を確立するための対照集団として地元から募集されました。研究集団には、以下の包含基準と除外基準が選択されました:カーボンブラックパッカーの選択基準には、ほとんどのシフトでカーボンブラックと直接接触することと、カーボンブラック曝露エリアでの最低1年間の作業が含まれていました。水道労働者は、作業環境でカーボンブラックやその他の汚染物質に職業的にさらされていない場合に含まれていました。除外基準には、がんなどの慢性疾患を持つ労働者、過去3か月間にX線被曝を受けた人、肺結核、肺手術、ウイルス性心筋炎、先天性心疾患、最近の発熱、または炎症の病歴のある人、および最近抗生物質を服用した労働者が含まれていました。この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1.喀痰の保存

1. 以下の手順に従って、固定液を調製します。
   1. 2%ポリエチレングリコール(PEG1500)を水浴で溶かします。溶かしたPEG1500 20mLを遠心チューブに入れます。遠心分離管に50%エタノール20mLを加え、よく振とうして母液を作ります。
   2. 母液40mLを50%エタノール960mLに徐々に注ぎます。溶液をよく振って、サッコマンノ固定溶液を形成します。溶液は冷暗所に保管してください。
2. 調製した固定液20〜30mLを、約2mLの喀痰が入った遠心チューブに加えます。中身をよく混ぜます。
   注意: 総容量が40mLを超えないようにしてください。
3. 遠心分離管をシールフィルムで密封します。冷暗所に保管してください。準備ができたら、チューブを実験室に運び、さらに処理します。
   注意: 常にPEG1500を水浴で溶かし、処方された投与量に従って使用してください。

2. 喀痰中の細胞懸濁液の調製

1. 実際の投与量に従って、0.1 gのジチオスレイトールを生理食塩水100 mLに溶解して消化液を調製します。.調製した溶液を4°Cで最大48時間保存します。
2. 喀痰を含むチューブを1,998 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
3. 上清を捨てます。沈殿物に等量の喀痰消化物を加えます。渦巻き、混合物をよく振とうします。
   1. チューブを37°Cのウォーターバスに完全に液化するまで(10〜15分)置きます。
      注意: 液化プロセス中はチューブを連続的に振ってください。
4. 液化混合物を70μmのフィルターメンブレンでろ過します。
5. ろ過した溶液を500 x g で7分間、4°Cで遠心分離します。
6. 上清を捨て、細胞沈殿物を保持します。
7. 細胞沈殿物をデュシェンヌ型リン酸緩衝液に再懸濁します。再懸濁した溶液を500 x g で4°Cで7分間遠心分離し、純粋な細胞沈殿物を得ます。

3. 細胞塗抹標本の調製

1. 200〜600μLのリン酸緩衝液を細胞沈殿物に加えます。内容物を完全に混ぜます。細胞のカウント結果に基づいてバッファー量を調整します(>1.0×10⁵ 細胞を目指します)。
2. 細胞懸濁液20μLを採取し、ヘマトクリット法¹⁷を用いて細胞塗抹標本を作製する。
3. 塗抹標本を自然乾燥させます(48時間以内)。塗抹標本を市販の染色液で10秒間固定します。
4. 塗抹標本を染色液に8秒間浸します。染色中は、スライドをゆっくりと上下に持ち上げ、流水で余分な汚れを洗い流してください。
5. 塗抹標本をB染色液で8秒間染色します。染色中はスライドを持ち上げ、流水で余分な汚れを洗い流してください。
   注:染色液AおよびBは、市販の染色キットに含まれています。
6. スライドを無水エタノールに2回、毎回2〜3秒間浸します。
7. 乾いたら、適量の中性ガムを塗ります。スライドをカバースリップで密封します。

4. CCAMの定量分析

1. 100倍オイルレンズ対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用します。ランダムに選択され、よく染色され、形態学的に無傷のマクロファージの画像をキャプチャします。各サンプルについて50枚のマクロファージ写真をランダムに撮影します。
2. Image Jソフトウェアで以下の手順に従って画像解析を実行します。
   1. スケールを測定し、実際の長さとピクセル間変換 (282 ピクセル = 10 μm) を決定します。画像Jでスケールを設定し(分析>スケールの設定)、 距離 (ピクセル単位)、 実際の長さ、長さの単位(μm)、 およびティックグローバル。
   2. 不規則な形状を使用してセルの輪郭を描きます。背景を削除します(フリーハンド選択、編集、 >外側をクリア)。セルの総面積を測定します (分析>測定)。
   3. 原子核を切り取ります(編集>切り取り)。グレースケール画像を白黒に変換します(Image > Type > 8ビット)。
   4. 各細胞染色に固有のグレースケール値を調整して、炭素粒子を正確にカウントします(画像> >しきい値の調整 > 適用、分析、>>測定)。
   5. 測定面積とImage Jソフトウェアでの画像解析に基づいて、サンプルあたり50個のマクロファージの炭素含有量を計算します。

結果

固定液で保存および処理された喀痰は、形態学的検査中に光学顕微鏡下で無傷のマクロファージ形態を示しました。マクロファージは、透明、円形、または腎臓の形をした、染色しやすい細胞核を示しました。染色後、細胞核は青紫色に見え、細胞質は淡いピンク色または水色でした。顕微鏡的な磁場は最小限の不純物を示し、細胞の同定を容易にしました。細胞内...

ディスカッション

この研究では、誘導された喀痰由来のCCAMを大気中の粒子状物質への内部曝露の生物学的マーカーとして使用するための詳細な実験プロトコルを提示します。CCAMは光学顕微鏡で検出および定量化でき、健康への影響との関係を反映する正確な内部曝露バイオマーカーとして機能します。したがって、便利で信頼性が高く、効率的な誘導喀痰保存方法とCCAM定量法を確立...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL sterile straws	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	84202ES03
50 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific, USA	339652
Absolute ethyl alcohol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	64-17-5
Cedar oil	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD	C805296
Diff-quick staining solution	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	40748ES76
Dithiothreitol	Solebo Bio Co., LTD	D8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)	Thermo Fisher Scientific, USA	14190144
Microscope camera	Olympus Corporation of Japan	DP72
Neutral tree gum	Solebo Bio Co., LTD	G8590
Nylon filter membrane 70um	BD Falcon Bioscience, USA	211755
Optical microscope	Olympus Corporation of Japan	BX60
Polyethylene glycol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	25322-68-3
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	SL40R
Viscous slide	Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD	188105