测量暴露于含碳颗粒物的气道巨噬细胞中的碳含量

摘要

本文介绍了一种详细的实验方案，用于测量气道巨噬细胞的碳含量，目的是评估单个颗粒物暴露水平的内部暴露剂量。

摘要

肺巨噬细胞在吞噬颗粒中表现出剂量依赖性模式。吞噬后，这些巨噬细胞随后随痰液排泄，使巨噬细胞和颗粒在光学显微镜下可见且可量化。值得注意的是，哺乳动物体内的元素碳完全来自外部污染物。因此，气道巨噬细胞 （CCAM） 中的碳含量可作为有效的暴露生物标志物，准确估计个体暴露于含碳颗粒物 （PM）。本文描述了一个涉及痰液收集、保存、处理、载玻片制备和染色以及巨噬细胞照片采集和分析的方案。去除巨噬细胞核后，计算碳颗粒占据的细胞质面积比例 （PCOC） 以量化每个巨噬细胞中的碳含量。结果表明，暴露于含碳 PM 后 CCAM 水平升高。总之，这种非侵入性、精确、可靠和标准化的方法能够直接测量靶细胞内的碳颗粒，并用于通过诱导痰液对单个 CCAM 进行大规模定量。

引言

环境空气污染与呼吸系统和心血管疾病导致的死亡有关，对人类健康构成严重威胁 ^1,2。流行病学数据表明，长期暴露于直径小于或等于 2.5 微米的环境颗粒物 （PM2.5） 是导致全球 4 至 900 万人过早死亡的原因。在 2015 年全球疾病、伤害和风险因素负担研究 （GBD） 中，PM2.5 被列为全球死亡的第五大最重要风险因素3,4,5,6。研究发现，遵守 WHO 空气污染指南每年可以防止 51,213 人因暴露 PM2.5 而死亡³。目前，大多数研究缺乏对个体内暴露的评估，仅基于对较大区域监测点的粗略评估，这些监测点与个体暴露水平相去甚远。可用的内部暴露生物标志物，如尿 PAH 和苯并 （a） 芘，并不反映颗粒物暴露与健康影响之间的关联 ^7,8,9。这导致无法与健康影响建立准确的关系。因此，寻找反映个体颗粒物暴露水平的标志物是准确评估个体暴露的关键之一。

吸入支气管的颗粒可通过支气管中的纤毛振荡随痰液排泄。肺泡中缺乏纤毛粘液流转运系统意味着颗粒进入肺泡的主要清除途径是通过巨噬细胞的吞噬作用和易位^10,11。根据肺的解剖结构，它清除不溶性颗粒异物的速度很慢。这使得颗粒物能够与肺细胞长时间相互作用并引发各种生物效应，从而对肺组织和其他器官造成损害^12,13。颗粒物的刺激导致巨噬细胞活化，触发肺部炎症因子的级联反应，从而引起全身炎症反应¹⁴。考虑到巨噬细胞噬细胞在引发肺部细胞因子风暴中的关键作用，理论上，来自肺巨噬细胞的碳颗粒可以反映空气中碳核颗粒暴露的生物有效剂量¹⁵。此外，由于哺乳动物细胞中没有元素碳的聚集，并且在光学显微镜下可以观察到含碳颗粒物为黑色颗粒物，因此肺泡和支气管巨噬细胞的收集以及其中碳含量的测量可以作为评估颗粒物暴露的标志物¹⁶。

这项研究确定了一种准确评估单个颗粒物暴露水平的方法，称为气道巨噬细胞的碳含量 （CCAM）。具体来说，在参与者吸入超声波雾化器产生的高渗盐水后收集群体痰液样本。然后使用固定液保存这些样品。分离气道巨噬细胞，染色，并在光学显微镜下拍照，以鉴定含有含碳颗粒的巨噬细胞，然后对其进行定量。该方法为准确评估单个颗粒物暴露水平提供了生物标志物。它为研究颗粒物暴露与健康影响之间的关系建立了方法基础，作为探索颗粒物暴露与肺部疾病等健康结果之间关联的研究基础。

研究方案

该研究获得了中国疾病预防控制中心 （NIOHP201604） 职业健康与毒物控制研究所医学伦理委员会的批准，并在研究和生物样本采集之前获得了所有受试者的书面知情同意书。在这项研究中，选择了在炭黑工厂工作超过 1 年并接触炭黑气溶胶的炭黑封隔工。从当地招募了一家自来水厂的自来水工人作为对照人群，他们没有明显的职业暴露于有害因素中，以建立这项研究。为研究人群选择了以下纳入和排除标准:炭黑封隔器的纳入标准包括在大多数班次中直接接触炭黑以及在炭黑暴露区域至少工作一年。如果自来水工人在工作环境中没有职业接触炭黑或其他污染物，则他们被包括在内。排除标准包括患有癌症等慢性病的工人，过去三个月内接受过 X 射线暴露的工人，有肺结核、肺部手术、病毒性心肌炎、先天性心脏病、近期发热或炎症病史的个体，以及最近服用抗生素的工人。研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 保存痰液

1. 按照以下步骤制备固定液:
   1. 在水浴中熔化 2% 聚乙二醇 （PEG1500）。在离心管中取 20 mL 融化的 PEG1500。向离心管中加入 20 mL 50% 乙醇，并彻底摇动混合物以产生母液。
   2. 逐渐将 40 mL 母液倒入 960 mL 50% 乙醇中。充分摇动溶液以形成 Saccomanno 固定溶液。将溶液存放在阴凉、避光的地方。
2. 将 20-30 mL 制备的固定液添加到含有约 2 mL 痰液的离心管中。彻底混合内容物。
   注:确保总体积不超过 40 mL。
3. 用密封膜密封离心管。将其存放在阴凉、避光的地方。准备好后，将试管运送到实验室进行进一步处理。
   注意:始终PEG1500水浴中融化，并按照规定的剂量使用。

2. 痰液中细胞悬液的制备

1. 按实际剂量将 0.1 g 二硫苏糖醇溶解在 100 mL 生理盐水中制备消化液。将制备的溶液在 4 °C 下储存长达 48 小时。
2. 将含有痰液的试管在 4 °C 下以 1,998 x g 离心 30 分钟。
3. 丢弃上清液。向沉淀物中加入等体积的痰液消化物。涡旋并彻底摇晃混合物。
   1. 将试管置于 37 °C 水浴中直至完全液化（10-15 分钟）。
      注意:在液化过程中不断摇动试管。
4. 用 70 μm 滤膜过滤液化混合物。
5. 将过滤后的溶液在 4 °C 下以 500 x g 离心 7 分钟。
6. 弃去上清液，保留细胞沉淀物。
7. 在 Duchenne 磷酸盐缓冲液中重悬细胞沉淀物。将重悬溶液在 4 °C 下以 500 x g 离心 7 分钟，以获得纯细胞沉淀。

3. 细胞涂片的制备

1. 向细胞沉淀物中加入 200-600 μL 磷酸盐缓冲液。将内容物充分混合;根据细胞计数结果调整缓冲液体积（目标是 >1.0 × 10⁵ 个细胞）。
2. 取 20 μL 细胞悬液，使用血细胞比容法¹⁷ 制作细胞涂片。
3. 让涂片自然风干（48 小时内）。用市售染色溶液固定涂片 10 秒。
4. 将涂片浸入 A 染色溶液中 8 秒。染色过程中，轻轻上下提起载玻片，然后用流水冲洗掉多余的污渍。
5. 在 B 染色溶液中对涂片染色 8 秒。染色过程中提起玻片，并在流水下冲洗掉多余的污渍。
   注:染色液 A 和 B 可在市售染色试剂盒中找到。
6. 将载玻片浸入无水乙醇中两次，每次 2-3 秒。
7. 干燥后，涂抹适量的中性胶。用盖玻片密封载玻片。

4. CCAM 的定量分析

1. 使用带有 100 倍油镜物镜的光学显微镜。捕获随机选择、染色良好且形态完整的巨噬细胞的图像。每个样品随机拍摄 50 张巨噬细胞图片。
2. 按照以下步骤在 Image J 软件中执行图像分析:
   1. 测量比例并确定实际长度和像素到像素的转换 （282 像素 = 10 μm）。在图像 J 中设置比例（分析>设置比例），输入 以像素为单位的距离 、 实际长度、长度单位 （μm） 和刻度 全局。
   2. 使用不规则形状勾勒出单元格的轮廓。删除背景（手绘选区、 编辑>清除外部）。测量细胞的总面积（分析>测量）。
   3. 切出细胞核 （Edit > Cut）。将灰度图像转换为黑白图像（图像>类型 > 8 位）。
   4. 调整特定于每个细胞染色的灰度值，以实现准确的碳颗粒计数（图像>调整阈值>>应用、分析>>测量）。
   5. 根据 Image J 软件中的测量面积和图像分析计算每个样品 50 个巨噬细胞的碳含量。

结果

在形态学检查期间，用固定液保存和处理的痰液在光学显微镜下显示完整的巨噬细胞形态。巨噬细胞表现出透明、圆形或肾形、易染色的细胞核。染色后，细胞核呈蓝紫色，而细胞质呈浅粉色或浅蓝色。显微镜区域显示杂质极少，便于细胞识别。在细胞内，黑碳颗粒在小聚集体中清晰可见，从而能够对碳颗粒进行定量分析。

痰巨噬细胞的代表性图像?...

讨论

本研究提出了一种详细的实验方案，用于使用诱导痰衍生的 CCAM 作为内部暴露于大气颗粒物的生物标志物。CCAM 可以通过光学显微镜进行检测和量化，作为反映与健康影响关系的精确内部暴露生物标志物。因此，需要建立和优化一种方便、可靠、高效的诱导痰保存方法和 CCAM 定量方法，以标准化方法学程序。

肺巨噬细胞碳含量的测定涉及几个步骤，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL sterile straws	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	84202ES03
50 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific, USA	339652
Absolute ethyl alcohol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	64-17-5
Cedar oil	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD	C805296
Diff-quick staining solution	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	40748ES76
Dithiothreitol	Solebo Bio Co., LTD	D8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)	Thermo Fisher Scientific, USA	14190144
Microscope camera	Olympus Corporation of Japan	DP72
Neutral tree gum	Solebo Bio Co., LTD	G8590
Nylon filter membrane 70um	BD Falcon Bioscience, USA	211755
Optical microscope	Olympus Corporation of Japan	BX60
Polyethylene glycol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	25322-68-3
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	SL40R
Viscous slide	Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD	188105