Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف إعطاء الأدوية الموجهة بالماصة الدقيقة (MDA) كطريقة بديلة للتزقيم الفموي الذي يحفز البحث على تناول العلاجات بسهولة بأقل قدر من التوتر وعدم الراحة.

Abstract

يعد التزقيم الفموي (OG) باستخدام قنية متصلة بحقنة واحدة من أكثر الطرق شيوعا المستخدمة لتوصيل جرعات دقيقة من المركبات إلى معدة البحث. لسوء الحظ ، تأتي هذه الطريقة مع صعوبات لكل من المشغل البحث. أظهرت الدراسات أن OG قد يؤدي إلى مضاعفات ، بما في ذلك التهاب المريء ، وثقب المريء ، وإعطاء أدوية القصبة الهوائية عن غير قصد. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط OG بزيادة مستويات الكورتيكوستيرون في البلازما والبراز (بسبب الإجهاد) ، وتغير ضغط الدم ، وزيادة معدل ضربات القلب ، مما قد يؤثر سلبا على نتائج الدراسة أو تحيزها. تحفز طريقة بديلة تم تطويرها مسبقا تسمى إدارة الأدوية الموجهة بالماصات الدقيقة (MDA) على استهلاك العلاجات بسهولة بطريقة طفيفة التوغل. هنا ، نقدم أمثلة على استخدام تقنية MDA مع العلاجات المعاد تشكيلها في مركبات مختلفة ونظهر التوصيل الفعال للعلاجات المتنوعة لسلالات الفئران المختلفة المتعددة. نوضح أيضا أن MDA هي تقنية تقلل من توقيت وغزو إعطاء الدواء ولا تؤثر على تكوين ميكروبيوم الأمعاء كما تم تقييمه من خلال التحليل الكمي للأنواع الميكروبية الأساسية في الأمعاء. بشكل عام ، قد تقدم MDA بديلا أقل إرهاقا وفعالية ل OG.

Introduction

عادة ما يتم إعطاء الدواء لنماذج القوارض عن طريق التزقيم الفموي (OG) ، والذي يتكون من إعطاء مستحضر سائل مباشرة إلى المعدة باستخدام قنية متصلة بحقنة تحتوي على المحلول. ينتج عن هذه التقنية جرعة متسقة ودقيقة من العلاج للحيوان ، ولكنها تحمل أيضا عيوبا متعددة. تم فحص OG لعدم نمذجة التعرض الغذائي البشري بشكل كاف1،2. علاوة على ذلك ، يزيد OG من خطر الإصابات غير المقصودة للجهاز الهضمي العلوي (ثقب المريء والمعدة) ، وشفط العلاج المعطاه ، وآفات الجهاز التنفسي3. يرتبط OG أيضا بعدم الراحة4 ، وزيادة ضغط الدم ومعدل ضربات القلب5 ، وكذلك الإجهاد 6,7 ، وأحيانا الموت8 بسبب انخفاض تحمل للتزقيم. قد تتداخل هذه التغيرات الفسيولوجية مع النتائج التجريبية أو تربكها. وبالتالي ، تم استكشاف إجراءات جديدة لتجنب هذه الآثار الجانبية. استخدمت الدراسات إجراءات بديلة ل OG ، مثل استخدام الجيلاتين كوسيلة للمخدرات9 ، وشرائط إذابة عن طريق الفم (ODS) 10 ، وإبر التزقيم المغلفة بالسكروز11 ، وأنابيب التغذية المرنة ، وملفات تعريف الارتباط القمح12 ، والعسل13 ، وكريات زبدة الفولالسوداني 14. لسوء الحظ ، هناك قيود على هذه التعديلات على تقنية OG ، بما في ذلك عدم التوافق مع الأدوية غير القابلة للذوبان في الماء ، ووقت التحضير الأطول للعلاج15 ، واستساغة الدواء ، والاستقرار15 ، وتعريف بالطعام. علاوة على ذلك ، هناك احتمال لجرعات أقل دقة عندما تتغذى على الإعلان.

طور سكاربورو وآخرون سابقا طريقة بديلة للعلاج عن طريق الفم في الفئران ، والتي أطلقوا عليها اسم إدارة الأدوية الموجهة بالماصة الدقيقة (MDA). تعتمد طريقة الإعطاء هذه على محلول الحليب المكثف المحلى كوسيلة للمواد الدوائية ، مما يحفز الدراسة على استهلاك المركبة المحضرة و / أو المحاليل الدوائية بسهولة عن طريق توزيع المحلول بماصة أحادية القناة وطرف ماصة. لإدخال هذه التقنية ، تخضع القوارض لجلسة تدريب (يومين على الأقل) لتقصير أوقات المناولة والسماح لحيوان الدراسة بالتعرف على الشرب من طرف الماصة4. تشير دراسات التحقق الأولية التي أجراها سكاربورو وآخرون 7 وشالبتر وآخرون إلى أن إجراء MDA سهل التنفيذ وفعال من حيث التكلفة والحد الأدنى من التدخل الجراحي وأقل إرهاقا للحيوانات من طرق التزقيم الفموية التقليدية. سكاربورو وآخرون قدم استخدام تقنية MDA في نموذج فأر للتنشيط المناعي للأم (MIA) لاضطرابات النمو العصبي7. أظهرت هذه الدراسة أن ملامح الحرائك الدوائية للفئران التي عولجت بعقار الريسبيريدون المضاد للذهان باستخدام MDA كانت قابلة للمقارنة مع استخدام OG. علاوة على ذلك، لم يحفز MDA زيادة في مستويات الكورتيكوستيرون (هرمون الإجهاد) في الفئران، وأدى العلاج المزمن بالريسبيريدون باستخدام تقنية MDA إلى انخفاض يعتمد على الجرعة في عجز التفاعل الاجتماعي الناجم عن MIA وفرط الحساسية للأمفيتامين7. استكشفت دراسات إضافية فعالية MDA مقابل OG في كل من طرازي الفأر17 والجرذان18 . تمت مقارنة MDA أيضا بالحقن داخل الصفاق وثبت أنه فعال في توصيل أكسيد كلوزابين إلىالفئران 16. نظرا لنجاح MDA المبلغ عنه في الحد من الإجهاد الحيواني والفعالية العلاجية ، فإننا نهدف الآن إلى استكشاف تقنية MDA كطريقة فعالة لتوصيل الأدوية باستخدام نماذج إضافية من الفئران. هنا ، نصف تنفيذ طريقة MDA لعلاج سلالات الفئران المختلفة ، بما في ذلك سلالات FVB / NJ و C57BL / 6J المختصة بالمناعة وسلالة NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) التي تعاني من نقص المناعة مع علاجات فموية مختلفة ، بما في ذلك البكتيريا الحية والمركبات التجريبية التي يتم تسليمها في محاليل غير قابلة للذوبان في الماء (زيت الذرة) ، وضوابط المركبات. قمنا بتقييم نشاط ووجود العلاجات المختلفة في المصل والبراز ، وقمنا بتقييم التغيرات في ميكروبات الأمعاء الأساسية فيما يتعلق بطريقة MDA.

Protocol

تم إجراء جميع الدراسات التي أجريت على وفقا للإرشادات المؤسسية وبموجب البروتوكولات المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام المؤسسي بجامعة جونز هوبكنز (IACUC) M021M197 و M023M195. سلالات الفئران المستخدمة (ذكور الفئران ، 7 أسابيع) موصوفة في جدول المواد. كان استخدام ذكور الفئران بسبب استخدامها في الدراسات الجارية لسرطان البروستاتا. ثبت سابقا أن طريقة MDA فعالة في إناث الفئران أيضا7،17. تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى أقفاص / مجموعات العلاج الخاصة بها. عولجت الفئران في أقفاص وبدون ترتيب معين. تم تعمية المجرب الذي يدير العلاجات عن مجموعة العلاج. يشير الرقم المخصص للفأرة إلى هويتهم وليس الترتيب الذي عوملت به. تم جمع البيانات طوال الجدول الزمني للدراسة وتحليلها في النهاية لتجنب أي تحيز. تم تعمية المقايسات التجريبية لمجموعة العلاج حتى تم جمع جميع البيانات.

ملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من Scarborough et al.7.

1. تحضير العلاجات

  1. تحضير محلول من الحليب المكثف المحلى (المكونات: الحليب والسكر) والماء من درجة البيولوجيا الجزيئية باستخدام نسبة 3:10 من الحليب إلى الماء. قم بقياس الحليب المكثف المحلى باستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 مل بسبب لزوجة الحليب.
  2. باستخدام أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، امزج الماء من درجة البيولوجيا الجزيئية مع الحليب المكثف المحلى عن طريق خلط 5 مل من الماء ببطء في المرة الواحدة مع الحليب.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة في ظل ظروف معقمة باستخدام خزانة السلامة البيولوجية.
  3. قم بإعداد حصص من محلول الحليب (المخزنة على شكل 500 ميكرولتر من الحصص الصغيرة) وقم بتخزين الحصص عند 4 درجات مئوية حتى تتجانس مع المعالجة المعنية.
  4. قم بتعليق العلاجات في مركباتها بالتركيز الصحيح بناء على وزن جسم قبل دمجها مع محلول الحليب المكثف / الماء المحلى.

2. دورة تدريبية في نجمة داوود الحمراء

ملاحظة: يصف هذا القسم نماذج الماوس. ومع ذلك، يمكن توسيع نطاق تقنية MDA حسب الحاجة بأحجام أكبر/أطراف ماصة لنماذج القوارض الكبيرة.

  1. اختياري: كبح جماح الدراسة برفق عن طريق إمساك قفص الرقبة بيد واحدة.
  2. قدم لحيوان الدراسة 100 ميكرولتر من محلول الحليب المكثف/الماء المحلى فقط (بدون إضافة المعالجة التجريبية) باستخدام ماصة أحادية القناة وطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر يتم توجيهه إلى الفم.
  3. قم بتوزيع محلول الحليب / الماء ببطء لتجنب فقدان فم. تأكد من أن يستهلك محلول الحليب بسهولة بين 5-15 ثانية.
    ملاحظة: يحدث هذا التدريب لمدة يومين متتاليين على الأقل (جلسة تدريب واحدة في اليوم) ، مع عدم وجود تغييرات في الحجم الذي يتم إجراؤه. كانت هناك حاجة إلى ضبط النفس اللطيف من قبل القذر في الدورات التدريبية لنجمة داوود النجمة. يوصي سكاربورو وآخرون 7 بضبط النفس الكامل للحيوان في اليوم الأول من تدريب MDA ثم ضبط النفس من الذيل في اليوم الثاني. قد تختلف طريقة ضبط النفس باختلاف نماذج القوارض الكبيرة. في المقابل ، أمسك Vanhecke et al.17 الفئران قليلا فقط من الذيل أثناء التدريب.

3. علاجات الفئران باستخدام طريقة MDA

  1. اجمع بين معالجة الدراسة ومحلول الحليب المكثف المحلى / الماء (انظر أمثلة تجارب التحقق من الصحة [القسم 4 والقسم 5] أدناه).
  2. اختياري: كبح جماح الدراسة برفق عن طريق إمساك قفص الرقبة بيد واحدة.
    ملاحظة: أفاد سكاربورو وآخرون 7 أن الفئران لم تعد بحاجة إلى ضبط النفس بعد فترة التدريب وستشرب بسهولة من طرف الماصة. في المقابل ، أفاد Vanhecke et al.17 أنه بالنسبة لبعض العلاجات (على سبيل المثال ، تاموكسيفين) التي قد يكون لها نفور خفيف من الذوق ، من الأفضل إجراء MDA عن طريق تقييد الفئران بلطف عن طريق القفص أثناء جميع العلاجات. حددت هذه الدراسة أيضا أن وضع على ظهره باستخدام قفص لطيف يحسن وقت وفعالية استهلاك العلاج.
  3. قم بإدارة 100 ميكرولتر من المعالجة باستخدام ماصة أحادية القناة وطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر موجه إلى فم، كما تم إجراؤه أثناء الجلسات التدريبية.
  4. عالج واحدا في كل مرة.
  5. ضع كل مرة أخرى في قفصه بعد العلاج.
    ملاحظة: يمكن إعطاء العلاجات باستخدام طريقة MDA يوميا أو بطريقة متكررة7،17.

4. تجربة التحقق # 1 - التوصيل الفموي لبكتيريا الأمعاء إلى الفئران باستخدام MDA

ملاحظة: يصف هذا القسم استخدام طريقة MDA لتوصيل البكتيريا الحية عن طريق الفم لدراسات استعمار الأمعاء في الفئران. في هذه التجربة التجريبية التمثيلية ، يتم تسليم بكتيريا المطثية موجبة الجرام إلى الفئران C57BL / 6J. عولجت الفئران بالمضادات الحيوية (السيفوكسيتين) لمدة يومين متتاليين في مياه الشرب قبل التلقيح البكتيري ب MDA.

  1. الثقافة البكتيرية
    1. الثقافة C. scindens سلالة ATCC 35704 في مرق المطثية المقوى (RCB) باستخدام مخزون الجلسرين المجمد لتلقيح 500 ميكرولتر من البكتيريا في أنبوب RCB سعة 7 مل. تنمو اللاهوائية بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
    2. استخدم 500 ميكرولتر من مزرعة البكتيريا بين عشية وضحاها لتلقيح أنبوب RCB جديد واحتضانه لاهوائية لمدة 24 ساعة. قم بإزالة هذا الأنبوب من الغرفة اللاهوائية واستخدمه لتحضير العلاج البكتيري ل MDA. استخدم هذا الأنبوب نفسه لحساب وحدات تشكيل المستعمرة لكل مليلتر (CFU / mL).
  2. حساب C. scindens CFU / مل
    1. قم بإنشاء تخفيف 1: 3 لثقافة C. scindens باستخدام 3.5 مل من المزرعة الملقحة في 7 مل من وسائط RCB. استخدم عينة من هذا التخفيف لعمل مخزون جلسرين 20٪ 1 مل (1: 1) يتم تخزينه عند -80 درجة مئوية.
    2. صفيحة 100 ميكرولتر من التخفيف 1: 3 على ألواح أجار المطثية المقواة (RCA). استخدم التخفيف الأول لعمل تخفيفات تسلسلية لاحقة ولوحة لما مجموعه ثلاث مرات أخرى.
    3. بعد حضانة لوحات RCA ، عد المستعمرات واحسب CFU. استخدم المعادلة التالية لحساب تركيز الخلايا البكتيرية في العينات المخففة والأصلية:
      CFU في العينة المخففة (الخلايا / مل) = (عدد المستعمرات التي تم عدها على لوحة RCA) / (كمية العينة المخففة المضافة إلى لوحة RCA بالمل)
      CFU في العينة الأصلية (الخلايا / مل) = (CFU في العينة المخففة) / (تخفيف لوحة RCA)
  3. تحضير علاج C. scindens لمرض MDA
    1. امزج محلولا بحجم 50 ميكرولتر (1.265 × 106 CFU / مل في هذا المثال) من C. scindens + 50 ميكرولتر من محلول الحليب المكثف / الماء المحلى.
      ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى CFU معين ، فيمكن استخدام طريقة بديلة لقياس كمية الخلايا البكتيرية ، مثل إنشاء منحنى قياسي مع قياسات الكثافة البصرية (OD) عند 600 نانومتر.
  4. العلاج الفموي للفئران المصابة بالمطثية السيندينية باستخدام MDA
    1. في الأيام 1-3 ، قم بتعريف الفئران بمحلول الحليب كما هو موضح في القسم 2 (جلسة تدريب MDA).
    2. في اليوم 4 ، قم بإدارة 100 ميكرولتر من C. scindens + محلول الحليب أو PBS (التحكم) + محلول الحليب عبر MDA إلى الفئران C57BL / 6J. عالج الفئران مرة واحدة طوال مدة الدراسة.
  5. جمع عينات البراز
    1. امسك الماوس بواسطة قفص لطيف وانتظر حتى يقوم بتفريغ حبيبات البراز. اجمع الكريات البرازية مباشرة من المستقيم إلى أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. C. scindens PCR الكمي (qPCR)
    1. قم بإجراء استخراج الحمض النووي البرازي باستخدام بروتوكول منشور سابقا19،20.
    2. تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس فلور الحمض النووي للكشف عن الحساسية العالية. تطبيع عينات الحمض النووي إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. استخدم qPCR للتحقيق في وفرة ما يلي: (i ) C. scindens البكتيريا باستخدام بادئات محفوظة ضد جين desA ل C. scindens سلالة ATCC 35704 ، (ii) إجمالي البكتيريا باستخدام بادئات مصممة ضد منطقة V6 شديدة التغير لجين 16S rRNA البكتيري كما هو موضح سابقا20،21.
      ملاحظة: يتم سرد شروط qPCR والبادئات المستخدمة في الجدول 1. تم استخدام منحنى قياسي باستخدام C. scindens سلالة ATCC 35704 DNA لتقدير نسخ بكتيريا desA +.

5. تجربة التحقق # 2 - توصيل الأدوية التجريبية للفئران باستخدام MDA

ملاحظة: يصف هذا القسم استخدام طريقة MDA لتوصيل مركب تجريبي للفئران. في هذه التجربة التجريبية التمثيلية ، يتم تسليم مستقلب الصويا equol (S-equol) إلى فئران NSG و FVB / NJ.

  1. تحضير علاج S-equol
    ملاحظة: يتم نقل كل من S-equol و dimethyl sulfoxide (DMSO) وتخزينهما عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    1. أعد تكوين S-equol في DMSO جنبا إلى جنب مع زيت الذرة (90٪). اخلطي S-equol في زيت الذرة (220 ميكرولتر) مع 480 ميكرولتر من محلول الحليب المكثف / الماء المحلى. امزج هذا المحلول واخلطه في غرفة لتجنب انفصال الزيت عن الحليب.
      ملاحظة: إذا لوحظ انفصال المحلول ، امزج المحلول قبل العلاج. جرعة S-equol المعطاة هي 25 مجم / كجم / يوم. كانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة متشابهة في الوزن ، لذلك تلقت نفس الجرعة. قد تحتاج جرعة العلاج إلى تعديل وتحويلها إلى مستحضرات متعددة بناء على أوزان الدراسة.
    2. امزج مركبة DMSO مع زيت الذرة (90٪). اخلطي DMSO المقتبس في زيت الذرة (220 ميكرولتر) مع 480 ميكرولتر من محلول الحليب المكثف / الماء المحلى. امزج هذا المحلول واخلطه في غرفة لتجنب انفصال الزيت عن الحليب.
      ملاحظة: إذا لوحظ انفصال المحلول ، امزج المحلول قبل العلاج.
  2. العلاج الفموي للفئران المصابة ب S-equol باستخدام MDA
    1. في اليومين 1 و 2 ، قم بتعريف الفئران بمحلول الحليب كما هو موضح في القسم 2 (جلسة تدريب MDA).
      ملاحظة: بالنسبة لتجربة التحقق من الصحة # 1 ، تم اتباع وقت التدريب الموصوف في سكاربورو وآخرون ، مما يشير إلى وقت تأقلم مدته 3 أيام. في هذه التجربة ، تم اختبار وقت تدريب أقصر (2 أيام) ووجد أنه لم يغير إدارة العلاجات ذات الاهتمام.
    2. في الأيام 3-43 ، عالج الفئران ب (i) التحكم في PBS ، (ii) مركبة DMSO ، أو (iii) S-equol ، وكلها مدمجة مع محلول الحليب المكثف / الماء المحلى. اصنع مزيجا رئيسيا من الحل لتقديم حل متجانس للعلاجات لجميع الدراسة. قم بإدارة حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر لكل فأر مرة واحدة يوميا ، 5 أيام في الأسبوع ، لمدة 43 يوما إجمالا.
  3. جمع الدم
    1. جمع الدم بعد القتل الرحيم (جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون) عن طريق ثقب القلب. انقل الدم إلى أنبوب فاصل مصل ميكروتينر ، واخلطه ، واحفظه في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى مزيد من المعالجة.
    2. عينة دم بجهاز الطرد المركزي لإكمال الفصل عند 254 × جم لمدة 5 دقائق. يجمع المصل (الطبقة العليا من الفصل) ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. الكروماتوغرافيا السائلة S-equol مع مقايسة الطيف الكتلي الترادفي (LC / MS / MS)
    1. راجع ملف جدول المواد للمواد الكيميائية والكواشف المستخدمة في هذه التجربة.
    2. معايير المعايرة ومراقبة الجودة: تحضير محاليل مخزون S-equol والمعيار الداخلي (racemic equol-d4) في DMSO بتركيزات 1 مجم / مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    3. خفف المحاليل القياسية للمخزون بالأسيتونيتريل: الماء (50:50) لتحضير محلول عمل مختلط بتركيزات مختلفة. تحضير المعيار الداخلي في أسيتات الإيثيل كمحلول استخلاص بتركيز 100 نانوغرام / مل. قم بتخزين المخزون وحلول العمل في درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدمه يوميا أو مخففا أو مباشرا.
    4. استخراج العينة
      1. تحضير العينة باستخدام ترسيب البروتين بمحلول الاستخراج (أسيتات الإيثيل بالإضافة إلى المعيار الداخلي ، انظر القسم 5.4.3) ، متبوعا بالطرد المركزي وتبخر المادة الطافية تحت النيتروجين الجاف (50 درجة مئوية).
      2. أعد تكوين العينة في 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل بنسبة 50٪ ونقلها إلى قوارير أخذ العينات الأوتوماتيكية لتحليل LC / MS / MS.
    5. فصل العينة
      1. حقق الفصل باستخدام عمود C18 ، 2.1 × 50 مم ، 1.7 ميكرومتر. استخدم حمض الفورميك 0.1٪ كمرحلة متنقلة A و 0.1٪ حمض الفورميك في المرحلة المتنقلة الأسيتونيتريل B.
      2. استخدم تدرجا وحافظ على المرحلة المتنقلة B بنسبة 40٪ بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة لمدة 0.5 دقيقة. بعد ذلك ، قم بزيادة معدل التدفق إلى 100٪ خلال دقيقة واحدة ، واستمر هناك لمدة دقيقتين ، ثم ارجع إلى 40٪ B لمدة دقيقة واحدة.
      3. راقب النفايات السائلة للعمود باستخدام كاشف طيفي كتلي باستخدام تأين الرش الكهربائي ، والذي يعمل في الوضع السلبي. قم ببرمجة مقياس الطيف لمراقبة التحولات التالية لمراقبة التفاعل المتعدد (MRM): 241 → 119.1 ل S-equol و 245 → 123 للمعيار الداخلي ، equol-d4.
      4. احسب منحنى المعايرة ل S-equol باستخدام ذروة نسبة المساحة للتحليل إلى المعيار الداخلي باستخدام معادلة تربيعية بوظيفة ترجيح 1 / x2 باستخدام نطاقات المعايرة من 5-500 نانوغرام / مل.

6. قياس تأثير علاج MDA على ميكروبات الأمعاء الأساسية

ملاحظة: يصف هذا القسم استخدام qPCR لقياس مستويات ميكروبات الأمعاء الأساسية بعد علاج MDA.

  1. قم بجمع عينات البراز واستخراج الحمض النووي كما هو موضح في الخطوتين 4.5.1 و 4.6.1.
  2. تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس فلور الحمض النووي للكشف عن الحساسية العالية. تطبيع عينات الحمض النووي إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. استخدم qPCR للتحقيق في وفرة أعضاء ميكروبات الأمعاء: (أنا) Akkermansia muciniphila ، (ثانيا) Bifidobacterium spp. ، (iii) Streptococcus salivarius ، (iv) Lactobacillus spp. ، و (v) البكتيريا الكلية باستخدام بادئات مصممة ضد منطقة V6 مفرطة التغير لجين 16S rRNA البكتيري كما هو موضح سابقا20،21،22.
    ملاحظة: يتم سرد شروط qPCR والبادئات المستخدمة في الجدول 2.

النتائج

يمكن استخدام MDA في التوصيل الفموي للسلالات البكتيرية في نماذج الفئران. عولجت الفئران C57BL / 6J بالمضادات الحيوية (السيفوكسيتين في مياه الشرب) لمدة يومين لإزالة المجتمعات الميكروبية المتعايشة قبل بدء جلسة تدريب MDA. تم إعطاء محلول الحليب المكثف / الماء المحلى مرة واح...

Discussion

يمكن أن يكون OG مصدرا مهما للإجهاد في الأبحاث التي قد تخلق متغيرا مربكا كما تم تقييمه سابقا في دراسات متعددة7،9،11،12،13،14،15،23....

Disclosures

اي.

Acknowledgements

يسعدنا أن نعرب عن تقديرنا للدعم البحثي من جائزة برنامج أبحاث سرطان البروستاتا التابع لوزارة الدفاع W81XWH-20-1-0274 وجائزة تحدي مؤسسة سرطان البروستاتا 16CHAL13. نود أن نشكر ونعرب عن تقديرنا للدكتورة ميشيل روديك ، والدكتورة نوشين راستكاري ، والدكتورة نيكول أندرس ، وليبينج شو من المورد المشترك لعلم الأدوية التحليلي في جونز هوبكنز للمساعدة في equol LC / MS / MS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
200 µL pipette tipsMettler Toledo17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detectorSciexN/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-835D-5
Ammonium acetateSigma–Aldrich5.43834
C57BL/6J miceJackson LaboratoriesStrain# 000664
C. scindens strain 35704American Type Culture Collection35704
CefoxitinSagent NDC25021-109-10
Corn oilMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
ethanolFisher ScientificAC611050040
Formic acidSigma–Aldrich5.33002
FVB/NJ miceJackson LaboratoriesStrain# 001800
GlycerolSigma–AldrichG5516
HexaneFisher Scientific02-002-996
LC-MS grade waterFisher Scientific14-650-357
MethanolFisher Scientific02-003-340
Microtainer serum separator tubeBecton Dickinson02-675-185
Molecular biology grade waterCorning46-000-CI
NSG miceJackson LaboratoriesStrain# 005557
PBSCorning21-031-CV
Qubit DNA HS kitInvitrogenQ32851
Racemic equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
Reinforced Clostridial agarAnaerobe SystemsAS-6061
Reinforced Clostridial brothAnaerobe SystemsAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
S-equol reference standard for LC-MSCayman Chemical10010173
Single channel pipetteRainin17008652
Streptococcus salivarius genomic DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-1024D-5
Sweetened condensed milkCalifornia FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatiaSigma–AldrichG7017

References

  1. Vandenberg, L. N., Welshons, W. V., Vom Saal, F. S., Toutain, P. -. L., Myers, J. P. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors. Environ Health. 13 (1), 46 (2014).
  2. Craig, M. A., Elliott, J. F. Mice fed radiolabeled protein by gavage show sporadic passage of large quantities of intact material into the blood, an artifact not associated with voluntary feeding. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (5), 18-23 (1999).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Gulin, J. E. N., Bisio, M., García-Bournissen, F. Refining drug administration in a murine model of acute infection with Trypanosoma cruzi. Lab Anim Res. 36, 37 (2020).
  5. Bonnichsen, M., Dragsted, N., Hansen, A. K. The welfare impact of gavaging laboratory rats. Anim Welf. 14 (3), 223-227 (2005).
  6. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemp Top Lab Anim Sci. 39 (1), 17-21 (2000).
  7. Scarborough, J., et al. Preclinical validation of the micropipette-guided drug administration (MDA) method in the maternal immune activation model of neurodevelopmental disorders. Brain Behav Immun. 88, 461-470 (2020).
  8. Germann, P. G., Ockert, D. Granulomatous inflammation of the oropharyngeal cavity as a possible cause for unexpected high mortality in a Fischer 344 rat carcinogenicity study. Lab Anim Sci. 44 (4), 338-343 (1994).
  9. Martins, T., et al. Comparison of gelatin flavors for oral dosing of C57BL/6J and FVB/N mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (1), 89-95 (2022).
  10. Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an orally dissolving strip for pharmacological and toxicological studies: A simple and humane alternative to oral gavage for animals. J Vis Exp. (109), e53770 (2016).
  11. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49 (3), 329-334 (2010).
  12. Neto, T., Faustino-Rocha, A. I., Gilda Costa, R. M., Medeiros, R., Oliveira, P. A. A quick and low-intensity method for oral administration to large numbers of mice: A possible alternative to oral gavage. Lab Anim. 56 (2), 185-190 (2022).
  13. Küster, T., et al. Voluntary ingestion of antiparasitic drugs emulsified in honey represents an alternative to gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (2), 219-223 (2012).
  14. Gonzales, C., et al. Alternative method of oral administration by peanut butter pellet formulation results in target engagement of BACE1 and attenuation of gavage-induced stress responses in mice. Pharmacol Biochem Behav. 126, 28-35 (2014).
  15. Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Lab Anim. 55 (1), 76-80 (2021).
  16. Schalbetter, S. M., et al. Oral application of clozapine-N-oxide using the micropipette-guided drug administration (MDA) method in mouse DREADD systems. Lab Anim (NY). 50 (3), 69-75 (2021).
  17. Vanhecke, D., Bugada, V., Buch, T. Refined tamoxifen administration in mice by encouraging voluntary consumption of palatable formulations). bioRxiv. , (2023).
  18. Heraudeau, M., et al. Micropipette-guided drug administration (MDA) as a non-invasive chronic oral administration method in male rats. J Neurosci Methods. 398, 109951 (2023).
  19. Sfanos, K. S., et al. Compositional differences in gastrointestinal microbiota in prostate cancer patients treated with androgen axis-targeted therapies. Prostate Cancer Prostatic Dis. 21 (4), 539-548 (2018).
  20. Shrestha, E., et al. Profiling the urinary microbiome in men with positive versus negative biopsies for prostate cancer. J Urol. 199 (1), 161-171 (2018).
  21. Peiffer, L. B., et al. Composition of gastrointestinal microbiota in association with treatment response in individuals with metastatic castrate resistant prostate cancer progressing on enzalutamide and initiating treatment with anti-PD-1 (pembrolizumab). Neoplasia. 32, 100822 (2022).
  22. Jones, C. B., Peiffer, L. B., Davis, C. M., Sfanos, K. S. Examining the effects of 4He exposure on the gut-brain axis. Radiat Res. 197 (3), 242-252 (2022).
  23. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  24. Miguelena Chamorro, B., Swaminathan, G., Mundt, E., Paul, S. Towards more translatable research: Exploring alternatives to gavage as the oral administration route of vaccines in rodents for improved animal welfare and human relevance. Lab Anim (NY). 52 (9), 195-197 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved