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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui, descrevemos a administração de medicamentos guiada por micropipeta (MDA) como um método alternativo à gavagem oral que incentiva o animal de pesquisa a ingerir tratamentos prontamente com o mínimo de estresse e desconforto.

Resumo

A gavagem oral (GO) com o uso de uma cânula acoplada a uma seringa é um dos métodos mais comuns usados para administrar a dosagem precisa de compostos no estômago de animais de pesquisa. Infelizmente, esse método traz dificuldades tanto para o operador quanto para o animal de pesquisa. Estudos mostraram que a OG pode levar a complicações, incluindo esofagite, perfuração do esôfago e administração inadvertida de medicamentos traqueais. Além disso, o GO está associado ao aumento dos níveis plasmáticos e fecais de corticosterona (devido ao estresse), pressão arterial alterada e aumento da frequência cardíaca, o que pode influenciar negativamente ou influenciar os resultados do estudo. Um método alternativo desenvolvido anteriormente, denominado administração de medicamentos guiada por micropipeta (MDA), incentiva o animal a consumir tratamentos prontamente de maneira minimamente invasiva. Aqui, apresentamos exemplos do uso da técnica MDA com tratamentos reconstituídos em diferentes veículos e demonstramos a entrega eficaz dos tratamentos variados a várias cepas de camundongos diferentes. Demonstramos ainda que o MDA é uma técnica que diminui o tempo e a invasividade da administração do medicamento e não afeta a composição do microbioma intestinal, conforme avaliado pela análise quantitativa das principais espécies microbianas intestinais. No geral, o MDA pode oferecer uma alternativa menos estressante e eficaz ao OG.

Introdução

A administração de medicamentos a modelos de roedores é comumente obtida por meio de gavagem oral (GO), que consiste em administrar uma preparação líquida diretamente no estômago usando uma cânula conectada a uma seringa contendo a solução. Essa técnica resulta em uma dosagem consistente e precisa do tratamento para o animal, mas também traz várias desvantagens. OG foi examinado por não modelar adequadamente as exposições dietéticas humanas 1,2. Além disso, o GO aumenta o risco de lesões não intencionais no sistema digestivo superior (perfuração do esôfago e estômago), aspiração do tratamento administrado e lesões do trato respiratório3. O GO também está associado a desconforto4, aumento da pressão arterial e da frequência cardíaca5, bem como estresse 6,7 e, às vezes, morte8 devido à diminuição da tolerância à gavagem pelo animal. Essas alterações fisiológicas podem interferir ou confundir os resultados experimentais; Assim, novos procedimentos têm sido explorados para evitar esses efeitos colaterais. Estudos têm utilizado procedimentos alternativos à GO, como o uso de gelatina como veículo de fármaco9, tiras de dissolução oral (ODS)10, agulhas de gavagem revestidas comsacarose 11, tubos de alimentação flexíveis, biscoitos de trigo12, mel13 e pellets de manteiga de amendoim14. Infelizmente, existem limitações com essas modificações na técnica OG, incluindo incompatibilidade com drogas insolúveis em água, maior tempo de preparação para o tratamento15, palatabilidade e estabilidade da droga15 e familiarização do animal com o alimento. Além disso, há potencial para uma dosagem menos precisa quando os animais se alimentam de forma improvisada.

Scarborough et al.7 desenvolveram anteriormente um método alternativo de tratamento oral em camundongos, que eles denominaram administração de drogas guiada por micropipeta (MDA). Este método de administração é baseado em uma solução de leite condensado adoçado como veículo para substâncias farmacológicas, motivando os animais do estudo a consumir o veículo preparado e/ou soluções medicamentosas prontamente por meio da dispensação da solução com uma pipeta de canal único e ponta de pipeta. Para introduzir esta técnica, os roedores passam por uma sessão de treinamento (mínimo de 2 dias) para encurtar os tempos de manuseio e permitir que o animal do estudo se familiarize com a ingestão da ponta da pipeta4. Estudos iniciais de validação de Scarborough et al.7 e Schalbetter et al.16 sugerem que o procedimento de MDA é fácil de implementar, custo-efetivo, minimamente invasivo e menos estressante para os animais do que os métodos convencionais de gavagem oral. Scarborough et al. introduziram o uso da técnica MDA em um modelo de camundongo de ativação imune materna (MIA) de distúrbios do neurodesenvolvimento7. Este estudo demonstrou que os perfis farmacocinéticos de camundongos tratados com o medicamento antipsicótico risperidona usando MDA foram comparáveis ao uso de OG. Além disso, o MDA não induziu um aumento nos níveis de corticosterona (um hormônio do estresse) nos camundongos, e o tratamento crônico com risperidona usando a técnica de MDA levou a uma diminuição dependente da dose nos déficits de interação social induzidos por MIA e hipersensibilidade às anfetaminas7. Estudos adicionais exploraram a eficácia do MDA versus OG em modelos de camundongo17 e rato18 . O MDA também foi comparado à injeção intraperitoneal e demonstrou ser igualmente eficaz na administração de N-óxido de clozapina a camundongos16. Devido ao sucesso relatado do MDA na redução do estresse animal e da eficácia terapêutica, agora pretendemos explorar ainda mais a técnica de MDA como um método eficaz de administração de medicamentos usando modelos murinos adicionais. Aqui, descrevemos a implementação do método MDA para tratar diferentes cepas de camundongos, incluindo as cepas FVB / NJ e C57BL / 6J imunocompetentes e a cepa imunocomprometida NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) com diferentes tratamentos orais, incluindo bactérias vivas, compostos experimentais entregues em soluções insolúveis em água (óleo de milho) e controles de veículos. Avaliamos a atividade e a presença dos diferentes tratamentos no soro e nas fezes, e avaliamos as alterações na microbiota intestinal central em relação ao método MDA.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram realizados seguindo as diretrizes institucionais e sob os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins (IACUC) M021M197 e M023M195. As linhagens de camundongos usadas (camundongos machos, 7 semanas de idade) são descritas na Tabela de Materiais. O uso de camundongos machos foi devido ao seu uso nos estudos em andamento sobre câncer de próstata. O método MDA já demonstrou ser eficaz em camundongos fêmeas 7,17. Os camundongos foram randomizados para suas respectivas gaiolas/grupos de tratamento. Os ratos foram tratados em gaiolas e sem ordem específica. O experimentador que administrou os tratamentos foi cego para o grupo de tratamento. O número atribuído a um rato referia-se à sua identificação e não à ordem em que foram tratados. Os dados foram coletados ao longo da linha do tempo do estudo e analisados ao final para evitar qualquer viés. Os ensaios experimentais foram cegos para o grupo de tratamento até que todos os dados fossem coletados.

NOTA: Este protocolo foi modificado de Scarborough et al.7.

1. Preparação dos tratamentos

  1. Prepare uma solução de leite condensado adoçado (ingredientes: leite e açúcar) e água de grau de biologia molecular usando uma proporção de 3:10 de leite para água. Meça o leite condensado usando um tubo cônico de 15 mL devido à viscosidade do leite.
  2. Usando um tubo cônico de 50 mL, misture água de grau de biologia molecular com o leite condensado adoçado, misturando lentamente 5 mL de água de cada vez com o leite.
    NOTA: Esta etapa é realizada em condições estéreis usando um gabinete de biossegurança.
  3. Preparar alíquotas da solução láctea (conservadas em alíquotas de 500 μl) e conservá-las a 4 °C até à sua combinação com o tratamento de interesse.
  4. Ressuspenda os tratamentos em seus respectivos veículos na concentração correta com base no peso corporal do animal antes de combiná-los com a solução de leite condensado/água.

2. Sessão de treinamento MDA

NOTA: Esta seção descreve os modelos de mouse; no entanto, a técnica de MDA pode ser ampliada conforme necessário com volumes maiores/ponteiras de pipeta para modelos de roedores maiores.

  1. OPCIONAL: Contenha suavemente o animal de estudo segurando a nuca com uma mão.
  2. Ofereça ao animal do estudo apenas 100 μL de solução condensada de leite/água (sem adição do tratamento experimental) usando uma pipeta de canal único e uma ponta de pipeta de 200 μL que é guiada até a boca.
  3. Distribua a solução de leite/água lentamente para evitar perder a boca do animal. Certifique-se de que o animal consuma prontamente a solução de leite entre 5-15 s.
    NOTA: Este treino ocorre durante um mínimo de 2 dias consecutivos (uma sessão de treino por dia), sem alterações ao volume administrado. Uma contenção suave por nuca foi necessária para as sessões de treinamento do MDA. Scarborough et al.7 recomendam a contenção total do animal no primeiro dia de treinamento do MDA e, em seguida, a contenção pela cauda no segundo dia. O método de contenção pode diferir para modelos de roedores maiores. Em contraste, Vanhecke et al.17 apenas seguraram os camundongos levemente pela cauda durante o treinamento.

3. Tratamentos em camundongos usando o método MDA

  1. Combine o tratamento do estudo com a solução de leite condensado/água (ver exemplos com experiências de validação [secção 4 e secção 5] abaixo).
  2. OPCIONAL: Contenha suavemente o animal de estudo segurando a nuca com uma mão.
    NOTA: Scarborough et al.7 relatam que os camundongos não precisam mais de contenção além do período de treinamento e beberão prontamente da ponta da pipeta. Em contraste, Vanhecke et al.17 relatam que, para alguns tratamentos (por exemplo, tamoxifeno) que podem ter aversão leve ao sabor, o MDA é melhor realizado restringindo suavemente os camundongos por meio de nuca durante todos os tratamentos. Este estudo também determinou que posicionar o animal de costas com uma nuca suave melhora o tempo e a eficácia do consumo do tratamento.
  3. Administrar 100 μL de tratamento usando uma pipeta monocanal e uma ponta de pipeta de 200 μL guiada até a boca do animal, conforme realizado durante as sessões de treinamento.
  4. Trate um único animal de cada vez.
  5. Coloque cada animal de volta em sua respectiva gaiola após o tratamento.
    NOTA: Os tratamentos pelo método MDA podem ser administrados diariamente ou de forma repetida 7,17.

4. Experiência de validação #1 - entrega oral de bactérias intestinais a ratinhos usando MDA

NOTA: Esta seção descreve o uso do método MDA para fornecer bactérias vivas por via oral para estudos de colonização intestinal em camundongos. Neste experimento piloto representativo, a bactéria gram-positiva Clostridium scindens é entregue a camundongos C57BL / 6J. Os camundongos foram tratados com antibióticos (cefoxitina) por dois dias consecutivos na água potável antes da inoculação bacteriana com MDA.

  1. Cultura bacteriana
    1. Cultura de C. scindens cepa ATCC 35704 em caldo clostridial reforçado (RCB) usando um estoque de glicerol congelado para inocular 500 μL de bactérias em um tubo RCB de 7 mL. Crescer anaerobicamente durante a noite a 37 °C.
    2. Use 500 μL da cultura de bactérias durante a noite para inocular um novo tubo RCB e incubar anaerobicamente por 24 h. Remova este tubo da câmara anaeróbica e use-o para preparar o tratamento bacteriano para MDA. Use este mesmo tubo para calcular as unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL).
  2. Cálculo de UFC / mL de C. scindens
    1. Crie uma diluição de 1:3 da cultura de C. scindens usando 3,5 mL da cultura inoculada em 7 mL de meio RCB. Use uma amostra desta diluição para fazer um estoque de glicerol de 20% 1 mL (1: 1) que é armazenado a -80 ° C.
    2. Placa de 100 μL da diluição 1:3 em placas de ágar clostridial reforçado (RCA). Use a primeira diluição para fazer diluições seriadas subsequentes e coloque em placas por um total de mais três vezes.
    3. Após a incubação das placas RCA, contar as colônias e calcular a UFC. Utilizar a seguinte equação para calcular a concentração de células bacterianas nas amostras diluídas e originais:
      UFC na amostra diluída (células/mL) = (número de colônias contadas na placa RCA)/(quantidade de amostra diluída adicionada à placa RCA em mL)
      UFC na amostra original (células/mL) = (UFC na amostra diluída)/(diluição da placa RCA)
  3. Preparando o tratamento de C. scindens para MDA
    1. Combine uma solução de 50 μL (1,265 x 106 UFC/mL neste exemplo) de C. scindens + 50 μL da solução condensada de leite/água adoçada.
      NOTA: Se for necessária uma UFC específica, pode ser utilizado um método alternativo de quantificação de células bacterianas, como a criação de uma curva padrão com medições de densidade óptica (OD) a 600 nm.
  4. Tratamento oral de camundongos com C. scindens usando MDA
    1. Nos dias 1-3, familiarize os camundongos com a solução láctea conforme descrito na seção 2 (sessão de treinamento de MDA).
    2. No dia 4, administrar 100 μL da solução de C. scindens + leite ou PBS (controle) + solução de leite via MDA a camundongos C57BL / 6J. Trate os ratos uma vez durante o estudo.
  5. Coleta de amostras fecais
    1. Segure o mouse com uma nuca suave e espere que ele descarregue uma pelota fecal. Colete pellets fecais diretamente do reto em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL. Armazenar as amostras a -80 °C até à utilização.
  6. PCR quantitativo de C. scindens (qPCR)
    1. Realizar extração de DNA fecal usando um protocolo publicado anteriormente 19,20.
    2. Determine a concentração de DNA usando um fluorômetro de DNA para detecção de alta sensibilidade. Normalizar as amostras de ADN para 10 ng/μL e conservar a -20 °C até à utilização.
    3. Use qPCR para investigar a abundância de: (i) bactérias C. scindens usando primers conservados contra o gene desA da cepa C. scindens ATCC 35704, (ii) bactérias totais usando primers projetados contra a região hipervariável V6 do gene bacteriano 16S rRNA conforme descrito anteriormente20,21.
      NOTA: As condições de qPCR e os primers usados estão listados na Tabela 1. Uma curva padrão usando o DNA ATCC 35704 da cepa de C. scindens foi usada para estimar as cópias da bactéria desA+.

5. Experimento de validação #2 - entrega experimental de drogas a camundongos usando MDA

NOTA: Esta seção descreve o uso do método MDA para fornecer um composto experimental a camundongos. Neste experimento piloto representativo, o metabólito da soja equol (S-equol) é entregue a camundongos NSG e FVB/NJ.

  1. Preparação do tratamento com S-equol
    NOTA: Tanto o S-equol quanto o dimetilsulfóxido (DMSO) são aliquotados e armazenados a -20 ° C até o uso.
    1. Reconstituir S-equol em DMSO combinado com óleo de milho (90%). Misture o S-equol aliquotado em óleo de milho (220 μL) com 480 μL da solução de leite condensado / água. Combine e misture esta solução no biotério para evitar a separação do óleo do leite.
      NOTA: Se for observada separação da solução, misture a solução antes do tratamento. A dose de S-equol administrada é de 25 mg/kg/dia. Os camundongos usados neste estudo eram todos semelhantes em peso, então receberam a mesma dose. A dose do tratamento pode precisar ser ajustada e transformada em várias preparações com base no peso dos animais do estudo.
    2. Combine o veículo DMSO com óleo de milho (90%). Misture DMSO aliquotado em óleo de milho (220 μL) com 480 μL da solução de leite condensado / água. Combine e misture esta solução no biotério para evitar a separação do óleo do leite.
      NOTA: Se for observada separação da solução, misture a solução antes do tratamento.
  2. Tratamento oral de camundongos com S-equol usando MDA
    1. Nos dias 1 e 2, familiarize os camundongos com a solução láctea, conforme descrito na seção 2 (sessão de treinamento de MDA).
      NOTA: Para o experimento de validação #1, foi seguido o tempo de treinamento descrito em Scarborough et al., que sugeriu um tempo de aclimatação de 3 dias. Neste experimento, um menor tempo de treinamento (2 dias) foi testado e constatou-se que não alterou a administração dos tratamentos de interesse.
    2. Nos dias 3-43, trate os camundongos com (i) controle PBS, (ii) veículo DMSO ou (iii) S-equol, todos combinados com a solução de leite condensado / água adoçada. Faça uma mistura principal da solução para fornecer uma solução homogênea dos tratamentos a todos os animais do estudo. Administrar um volume total de 100 μL a cada rato uma vez por dia, 5 dias por semana, durante um total de 43 dias.
  3. Coleta de sangue
    1. Colete sangue após a eutanásia (overdose de dióxido de carbono) por punção cardíaca. Transfira o sangue para um tubo separador de soro microtainer, misture e armazene em temperatura ambiente (RT) até o processamento posterior.
    2. Centrifugue a amostra de sangue para completar a separação a 254 x g por 5 min. Recolha o soro (camada superior de separação) e conserve a -20 °C até à utilização.
  4. Cromatografia líquida S-equol com ensaio de espectrometria de massa em tandem (LC/MS/MS)
    1. Consulte o arquivo Tabela de Materiais para os produtos químicos e reagentes usados para este experimento.
    2. Padrões de calibração e controle de qualidade: Preparar soluções-mãe de S-equol e padrão interno (equol racêmico-d4) em DMSO em concentrações de 1 mg/mL e armazenar a -20 °C.
    3. Diluir as soluções-padrão de reserva com acetonitrilo:água (50:50) para preparar uma solução de trabalho mista com diferentes concentrações. Preparar o padrão interno em acetato de etilo como solução de extracção a uma concentração de 100 ng/ml. Armazene o estoque e as soluções de trabalho a 4 °C e use diariamente, diluído ou diretamente.
    4. Extração de amostras
      1. Preparar a amostra utilizando precipitação de proteínas por solução de extracção (acetato de etilo mais padrão interno, ver ponto 5.4.3), seguida de centrifugação e evaporação do sobrenadante em azoto seco (50 °C).
      2. Reconstituir a amostra em 100 μL de acetonitrila a 50% e transferir para frascos de amostrador automático para análise LC/MS/MS.
    5. Separação de amostras
      1. Obtenha a separação com uma coluna C18, 2.1x50 mm, 1.7 μm. Use ácido fórmico a 0.1% como fase móvel A e ácido fórmico a 0.1% na fase móvel B de acetonitrila.
      2. Use um gradiente e mantenha a fase móvel B a 40% com uma taxa de fluxo de 0,3 mL / min por 0,5 min. Em seguida, aumente a taxa de fluxo para 100% em 1 min, segure por 2 min e retorne a 40% B por 1 min.
      3. Monitore o efluente da coluna usando um detector de espectrometria de massa usando ionização por eletrospray, que está operando em modo negativo. Programe o espectrômetro para monitorar as seguintes transições de monitoramento de reação múltipla (MRM): 241 → 119.1 para S-equol e 245 → 123 para o padrão interno, equol-d4.
      4. Calcule a curva de calibração para S-equol usando o pico da razão de área da análise para o padrão interno usando uma equação quadrática com uma função de ponderação 1/x2 usando as faixas de calibração de 5-500 ng/mL.

6. Medindo o efeito do tratamento com MDA na microbiota intestinal central

NOTA: Esta seção descreve o uso de qPCR para medir os níveis de microbiota intestinal central após o tratamento com MDA.

  1. Realize a coleta de amostras fecais e a extração de DNA conforme descrito nas etapas 4.5.1 e 4.6.1.
  2. Determine a concentração de DNA usando um fluorômetro de DNA para detecção de alta sensibilidade. Normalizar as amostras de ADN para 10 ng/μL e conservar a -20 °C até à utilização.
  3. Use qPCR para investigar a abundância de membros da microbiota intestinal: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. e (v) bactérias totais usando primers projetados contra a região hipervariável V6 do gene bacteriano 16S rRNA, conforme descrito anteriormente 20,21,22.
    NOTA: As condições de qPCR e os primers usados estão listados na Tabela 2.

Resultados

O MDA pode ser usado na administração oral de cepas bacterianas em modelos de camundongos. Camundongos C57BL / 6J foram tratados com antibióticos (cefoxitina na água potável) por 2 dias para limpar as comunidades microbianas comensais antes de iniciar a sessão de treinamento de MDA. A solução de leite condensado/água foi administrada uma vez ao dia consecutivamente por 3 dias antes da administração do tratamento. Os camundongos foram brevemente contidos por um...

Discussão

O GO pode ser uma fonte significativa de estresse em animais de pesquisa que pode criar uma variável de confusão, conforme avaliado anteriormente em vários estudos 7,9,11,12,13,14,15,23. Devido à invasividade da GO, té...

Divulgações

Nenhum.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer o apoio à pesquisa do Prêmio W81XWH-20-1-0274 do Programa de Pesquisa do Câncer de Próstata do Departamento de Defesa e do Prêmio 16CHAL13 do Desafio da Fundação do Câncer de Próstata. Gostaríamos de agradecer e agradecer à Dra. Michelle Rudek, ao Dr. Noushin Rastkari, à Dra. Nicole Anders e a Linping Xu do Recurso Compartilhado de Farmacologia Analítica da Johns Hopkins pela assistência com o equol LC/MS/MS.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
200 µL pipette tipsMettler Toledo17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detectorSciexN/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-835D-5
Ammonium acetateSigma–Aldrich5.43834
C57BL/6J miceJackson LaboratoriesStrain# 000664
C. scindens strain 35704American Type Culture Collection35704
CefoxitinSagent NDC25021-109-10
Corn oilMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
ethanolFisher ScientificAC611050040
Formic acidSigma–Aldrich5.33002
FVB/NJ miceJackson LaboratoriesStrain# 001800
GlycerolSigma–AldrichG5516
HexaneFisher Scientific02-002-996
LC-MS grade waterFisher Scientific14-650-357
MethanolFisher Scientific02-003-340
Microtainer serum separator tubeBecton Dickinson02-675-185
Molecular biology grade waterCorning46-000-CI
NSG miceJackson LaboratoriesStrain# 005557
PBSCorning21-031-CV
Qubit DNA HS kitInvitrogenQ32851
Racemic equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
Reinforced Clostridial agarAnaerobe SystemsAS-6061
Reinforced Clostridial brothAnaerobe SystemsAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
S-equol reference standard for LC-MSCayman Chemical10010173
Single channel pipetteRainin17008652
Streptococcus salivarius genomic DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-1024D-5
Sweetened condensed milkCalifornia FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatiaSigma–AldrichG7017

Referências

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