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摘要

在这里，我们将微量移液器引导的给药 （MDA） 描述为口服强饲法的替代方法，它激励研究动物以最小的压力和不适轻松摄入治疗。

摘要

使用连接到注射器的套管进行口服灌胃 （OG） 是将化合物精确剂量输送到研究动物胃中的最常见方法之一。不幸的是，这种方法对作员和研究动物都有困难。研究表明，OG 可能导致并发症，包括食管炎、食管穿孔和无意中使用气管药物。此外，OG 与血浆和粪便皮质酮水平升高（由于压力）、血压改变和心率加快有关，这可能会对研究结果产生负面影响或产生偏倚。以前开发的一种称为微量移液器引导给药 （MDA） 的替代方法可激励动物以微创方式轻松接受治疗。在此，我们提出了使用 MDA 技术的示例，其中处理在不同载体中重组，并展示了将不同处理有效递送到多种不同的小鼠品系。我们进一步证明 MDA 是一种降低给药时间和侵入性的技术，并且不会影响通过对核心肠道微生物种类进行定量分析评估的肠道微生物组组成。总体而言，MDA 可能提供一种压力较小且有效的 OG 替代方案。

引言

对啮齿动物模型进行药物给药通常通过口服强饲法 （OG） 实现，其中包括使用连接到含有溶液的注射器的套管将液体制剂直接注入胃中。这种技术导致对动物的治疗剂量一致且精确，但也具有多种缺点。OG 因没有充分模拟人类饮食暴露而受到审查 1,2。此外，OG 会增加上消化系统意外损伤（食道和胃穿孔）、接受治疗的误吸和呼吸道病变的风险3。OG还与不适4（discomfort）、血压和心率升高5（blood pressure and heart rate）以及压力6,7有关，有时由于动物对强饲的耐受性降低而死亡8（death）。这些生理变化可能会干扰或混淆实验结果;因此，已经探索了新的程序来避免这些副作用。研究使用了 OG 的替代程序，例如使用明胶作为药物载体9、口服溶解条 （ODS）10、蔗糖涂层管饲针11、柔性饲管、小麦饼干12、蜂蜜13 和花生酱颗粒14。不幸的是，对 OG 技术的这些修改存在局限性，包括与水不溶性药物不相容、治疗准备时间更长15、药物适口性和稳定性15，以及动物对食物的熟悉程度。此外，当动物随意进食时，剂量可能会不太精确。

Scarborough 等人7 之前 在小鼠中开发了一种替代口服治疗方法，他们称之为微量移液器引导给药 （MDA）。这种给药方法基于甜炼乳溶液作为药理学物质的载体，通过使用单通道移液器和移液器吸头分配溶液，激励研究动物轻松消耗准备好的载体和/或药物溶液。为了引入这种技术，啮齿动物接受了一次训练（至少 2 天），以缩短处理时间并让研究动物熟悉从移液器吸头4 中饮水。Scarborough 等人 7 和 Schalbetter 等人 16 的初步验证研究表明，与传统的口服强饲法相比，MDA 程序易于实施、成本效益高、微创且对动物的压力较小。Scarborough 等人介绍了 MDA 技术在神经发育障碍的母体免疫激活 （MIA） 小鼠模型中的使用7。这项研究表明，使用 MDA 的抗精神病药物利培酮治疗的小鼠的药代动力学特征与使用 OG 相当。此外，MDA 不会诱导小鼠皮质酮（一种压力激素）水平的增加，使用 MDA 技术用利培酮长期治疗导致 MIA 诱导的社交互动缺陷和苯丙胺超敏反应的剂量依赖性降低7。其他研究探讨了 MDA 与 OG 在小鼠17 和大鼠18 模型中的疗效。MDA 也与腹膜内注射进行了比较，并被证明在向小鼠输送氯氮平-N-氧化物方面同样有效16。据报道，由于 MDA 在减轻动物应激和治疗效果方面取得了成功，我们现在的目标是进一步探索 MDA 技术作为使用其他小鼠模型进行药物递送的有效方法。在这里，我们描述了 MDA 方法治疗不同小鼠菌株的实施，包括免疫功能正常的 FVB/NJ 和 C57BL/6J 菌株以及免疫功能低下的 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ （NSG） 菌株与不同的口服处理，包括活细菌、在水不溶性溶液（玉米油）中递送的实验化合物和载体对照。我们评估了血清和粪便中不同处理的活性和存在，并评估了与 MDA 方法相关的核心肠道微生物群的改变。

研究方案

所有动物研究均按照机构指南和约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的方案进行M021M197和M023M195。使用的小鼠品系（雄性小鼠，7 周龄）在材料表中描述。使用雄性小鼠是由于它们在正在进行的前列腺癌研究中的应用。MDA 方法先前已被证明对雌性小鼠也有效 7,17。将小鼠随机分配到各自的笼子/治疗组。小鼠在笼子里治疗，没有特别的顺序。施用治疗的实验者对治疗组不知情。分配给老鼠的数字是指它们的 ID，而不是它们被处理的顺序。数据在整个研究时间范围内收集，并在最后进行分析以避免任何偏倚。实验检测对治疗组不知情，直到收集到所有数据。

注意:该协议已从 Scarborough 等人 7 修改而来。

1. 治疗的准备

  1. 以 3:10 的牛奶与水的比例制备甜炼乳（成分:牛奶和糖）和分子生物学级水的溶液。由于牛奶的粘度，使用 15 mL 锥形管测量甜炼乳。
  2. 使用 50 mL 锥形管，将分子生物学级水与甜炼乳混合，一次将 5 mL 水与牛奶缓慢混合。
    注:此步骤在无菌条件下使用生物安全柜进行。
  3. 准备等分试样的牛奶溶液（储存为 500 μL 等分试样），并将等分试样储存在 4 °C 直至与感兴趣的处理混合。
  4. 在将它们与甜炼乳/水溶液混合之前，根据动物的体重以正确的浓度将处理剂重悬在各自的载体中。

2. MDA 培训课程

注意:本节介绍小鼠模型;然而，MDA 技术可以根据需要扩大规模，对于较大的啮齿动物模型，使用更大的体积/移液器吸头。

  1. 可选:用一只手握住脖子的骷髅，轻轻地束缚研究动物。
  2. 使用单通道移液器和 200 μL 移液器吸头（引导至口腔），仅向研究动物提供 100 μL 甜炼乳/水溶液（不添加实验处理）。
  3. 缓慢分配牛奶/水溶液，以免错过动物的嘴巴。确保动物在 5-15 秒之间轻松食用牛奶溶液。
    注意:此培训至少连续 2 天（每天一次），管理量没有变化。MDA 培训课程需要 scruff 的温柔约束。Scarborough 等人 7 建议在 MDA 训练的第一天对动物进行完全约束，然后在第二天用尾巴约束。对于大型啮齿动物模型，约束方法可能有所不同。相比之下，Vanhecke 等人 17 在训练期间仅略微握住小鼠的尾巴。

3. 使用 MDA 方法的小鼠治疗

  1. 将研究处理剂与甜炼乳/水溶液相结合（参见下面的验证实验示例 [第 4 节和第 5 节]）。
  2. 可选:用一只手握住脖子的骷髅，轻轻地束缚研究动物。
    注意:Scarborough 等人 7 报告说，小鼠在训练期之后不再需要约束，并且很容易从移液器吸头喝水。相比之下，Vanhecke 等人17 报告说，对于一些可能有轻度味觉厌恶的治疗（例如他莫昔芬），最好在所有治疗期间通过划痕轻轻地束缚小鼠来进行 MDA。这项研究还确定，将动物仰卧并轻轻抚摸可改善治疗消耗的时间和效果。
  3. 使用单通道移液器和 200 μL 移液器吸头引导至动物口腔进行 100 μL 处理，如训练期间所进行的那样。
  4. 一次治疗一只动物。
  5. 处理后将每只动物放回各自的笼子中。
    注意:使用 MDA 方法的治疗可以每天或重复进行 7,17。

4. 验证实验 #1 - 使用 MDA 将肠道细菌口服给药给小鼠

注:本节描述了使用 MDA 方法口服活细菌用于小鼠肠道定植研究。在这个具有代表性的试点实验中，革兰氏阳性菌 Clostridium scindens 被递送给 C57BL/6J 小鼠。小鼠在细菌接种 MDA 之前，在饮用水中连续两天用抗生素 （头孢西丁） 处理。

  1. 细菌培养
    1. 在增强型梭菌肉汤 （RCB） 中培养 C. scindens 菌株 ATCC 35704，使用冷冻甘油原液将 500 μL 细菌接种到 7 mL RCB 管中。在 37 °C 下厌氧生长过夜。
    2. 使用 500 μL 过夜细菌培养物接种新的 RCB 管并厌氧孵育 24 小时。从厌氧室中取出这根管子，用它来准备 MDA 的细菌处理。使用同一根试管计算每毫升的菌落形成单位 （CFU/mL）。
  2. 计算 C. scindens CFU/mL
    1. 使用 3.5 mL 接种到 7 mL RCB 培养基中的培养物，制备 1:3 稀释的 C. scindens 培养物。使用该稀释液的样品制备 20% 1 mL 甘油原液 （1:1），储存在 -80 °C 下。
    2. 将 100 μL 的 1:3 稀释液接种到增强型梭菌琼脂 （RCA） 板上。使用第一次稀释，然后进行后续的连续稀释，再铺板总共 3 次。
    3. 孵育 RCA 板后，计数菌落并计算 CFU。使用以下公式计算稀释样品和原始样品中细菌细胞的浓度:
      稀释样品中的 CFU（细胞/mL）=（RCA 板上计数的菌落数）/（添加到 RCA 板中的稀释样品量，单位为 mL）
      原始样品中的 CFU（细胞/mL）=（稀释样品中的 CFU）/（RCA 板的稀释度）
  3. 准备 C. scindens 治疗 MDA
    1. 混合 50 μL（本例中为 1.265 x 106 CFU/mL）的 C. scindens 溶液 + 50 μL 甜炼乳/水溶液。
      注:如果需要特定的 CFU，可以使用细菌细胞定量的替代方法，例如在 600 nm 处创建光密度 （OD） 测量的标准曲线。
  4. 使用 MDA 口服 C. scindens 小鼠
    1. 在第 1-3 天，如第 2 节（MDA 培训课程）中所述，让小鼠熟悉牛奶溶液。
    2. 第 4 天，通过 MDA 向 C57BL/6J 小鼠施用 100 μL C. scindens + 牛奶溶液或 PBS（对照）+ 牛奶溶液。在研究期间治疗小鼠一次。
  5. 粪便样本采集
    1. 轻轻地握住鼠标，等待它们排出粪便颗粒。将粪便沉淀直接从直肠收集到无菌的 1.5 mL 微量离心管中。将样品储存在 -80 °C 直至使用。
  6. C. scindens 定量 PCR （qPCR）
    1. 使用先前发布的方案进行粪便 DNA 提取19,20。
    2. 使用 DNA 荧光计测定 DNA 浓度，进行高灵敏度检测。将 DNA 样品标准化至 10 ng/μL，并储存在 -20 °C 直至使用。
    3. 使用 qPCR 研究以下物质的丰度:（i） C. scindens 细菌使用针对 C. scindens 菌株 ATCC 35704 的 desA 基因的保守引物，（ii） 使用针对细菌 16S rRNA 基因的 V6 高变区设计的引物的总细菌，如前所述20,21。
      注:使用的 qPCR 条件和引物列于 表 1 中。使用 C. scindens 菌株 ATCC 35704 DNA 的标准曲线来估计 desA+ 细菌的拷贝数。

5. 验证实验 #2 - 使用 MDA 向小鼠递送实验药物

注:本节描述了使用 MDA 方法将实验化合物递送给小鼠。在这个具有代表性的试点实验中，大豆代谢物 equol （S-equol） 被递送给 NSG 和 FVB/NJ 小鼠。

  1. S-equol 治疗的准备
    注意:S-雌马酚和二甲基亚砜 （DMSO） 均等分并储存在 -20 °C 直至使用。
    1. 在 DMSO 中与玉米油 （90%） 混合重构 S-equol。将等分的 S-雌马酚溶于玉米油 （220 μL） 中与 480 μL 甜炼乳/水溶液混合。在动物房中混合此溶液，以避免油与牛奶分离。
      注:如果观察到溶液分离，请在处理前混合溶液。S-equol 的给药剂量为 25 mg/kg/天。本研究中使用的小鼠体重都相似，因此它们接受的剂量相同。治疗剂量可能需要调整并根据研究动物的体重制成多种制剂。
    2. 将 DMSO 载体与玉米油 （90%） 结合使用。将等分的 DMSO 玉米油 （220 μL） 与 480 μL 甜炼乳/水溶液混合。在动物房中混合此溶液，以避免油与牛奶分离。
      注:如果观察到溶液分离，请在处理前混合溶液。
  2. 使用 MDA 口服 S-equol 小鼠
    1. 在第 1 天和第 2 天，如第 2 节（MDA 训练课程）中所述，让小鼠熟悉牛奶溶液。
      注意:对于验证实验 #1，遵循 Scarborough 等人描述的训练时间，这表明驯化时间为 3 天。在这个实验中，测试了较短的训练时间（2 天），发现它不会改变感兴趣治疗的给药。
    2. 在第 3-43 天，用 （i） PBS 对照、（ii） DMSO 载体或 （iii） S-equol 处理小鼠，所有这些都与甜炼乳/水溶液混合。制备溶液的预混液，以向所有研究动物提供治疗的均匀溶液。每周 5 天，每天一次，向每只小鼠施用总体积 100 μL，共 43 天。
  3. 采血
    1. 安乐死（二氧化碳过量）后通过心脏穿刺采集血液。将血液转移到 Microtainer 血清分离管中，混合并储存在室温 （RT） 下，直至进一步处理。
    2. 将血液样品以 254 x g 的离心速度离心 5 分钟以完成分离。收集血清（分离顶层）并储存在 -20 °C 直至使用。
  4. S-雌马酚液相色谱-串联质谱法 （LC/MS/MS） 测定
    1. 有关用于此实验的化学品和试剂，请参阅 材料表 文件。
    2. 校准标准品和质量控制:在 DMSO 中制备浓度为 1 mg/mL 的 S-雌马酚和内标（外消旋马醇-d4）储备液，并在 -20 °C 下储存。
    3. 用乙腈:水 （50:50） 稀释标准储备液，制备不同浓度的混合工作溶液。在乙酸乙酯中制备浓度为 100 ng/mL 的内标作为提取溶液。将储备液和工作溶液储存在 4 °C 下，每天稀释或直接使用。
    4. 样品提取
      1. 通过提取溶液（乙酸乙酯加内标，参见第 5.4.3 节）使用蛋白质沉淀制备样品，然后在干燥氮气 （50 °C） 下离心并蒸发上清液。
      2. 在 100 μL 50% 乙腈中复溶样品，然后转移至自动进样器样品瓶中进行 LC/MS/MS 分析。
    5. 样品分离
      1. 使用 C18 色谱柱 （2.1x50 mm， 1.7 μm） 实现分离。使用 0.1% 甲酸作为流动相 A，使用 0.1% 甲酸作为乙腈流动相 B。
      2. 使用梯度，将流动相 B 保持在 40%，流速为 0.3 mL/min，持续 0.5 min。然后，在 1 分钟内将流速增加到 100%，保持 2 分钟，然后返回至 40% B 1 分钟。
      3. 使用使用电喷雾电离的质谱检测器监测色谱柱流出物，该检测器在负离子模式下运行。对光谱仪进行编程以监测以下多反应监测 （MRM） 通道:S-equol 为 241 → 119.1，内标 equol-d4 为 245 → 123。
      4. 使用具有 1/x2 加权函数的二次方程，校准范围为 5-500 ng/mL，使用分析与内标的峰面积比峰计算 S-equol 的校准曲线。

6. 测量 MDA 治疗对核心肠道微生物群的影响

注意:本节介绍使用 qPCR 测量 MDA 处理后核心肠道微生物群的水平。

  1. 按照步骤 4.5.1 和 4.6.1 中的说明进行粪便样本采集和 DNA 提取。
  2. 使用 DNA 荧光计测定 DNA 浓度，进行高灵敏度检测。将 DNA 样品标准化至 10 ng/μL，并储存在 -20 °C 直至使用。
  3. 使用 qPCR 研究肠道微生物群成员的丰度:（i） 嗜粘蛋白阿克曼菌，（ii） 双歧杆菌属，（iii） 唾液链球菌，（iv） 乳酸杆菌属，以及 （v） 使用针对细菌 16S rRNA 基因的 V6 高变区设计的引物的总细菌，如前所述 20,21,22。
    注:使用的 qPCR 条件和引物列于 表 2 中。

结果

MDA 可用于小鼠模型中细菌菌株的口服递送。 C57BL/6J 小鼠在开始 MDA 训练前用抗生素 （饮用水中的头孢西丁） 处理 2 天以清除共生微生物群落。甜炼乳/水溶液在治疗给药前每天连续给药一次，持续 3 天。在 MDA 治疗给药期间，小鼠被轻柔的 scruff 短暂束缚。第 4 天，小鼠用 PBS（阴性对照，n = 4）或先重悬于甜炼乳/水溶液中的辛 氏梭菌 （desA+ 细菌，n = 4...

讨论

OG 可能是研究动物的重要压力来源，这可能会产生混杂变量，正如之前在多项研究中评估的那样7、9、11、12、13、14、15、23。由于 OG 的侵入性，已采用替代技术来最大限?...

披露声明

没有。

致谢

我们要感谢国防部前列腺癌研究计划奖 W81XWH-20-1-0274 和前列腺癌基金会挑战奖 16CHAL13 的研究支持。我们要感谢并感谢约翰霍普金斯大学分析药理学共享资源的 Michelle Rudek 博士、Noushin Rastkari 博士、Nicole Anders 博士和 Linping Xu 在马其醇 LC/MS/MS 方面提供的帮助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
200 µL pipette tipsMettler Toledo17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detectorSciexN/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-835D-5
Ammonium acetateSigma–Aldrich5.43834
C57BL/6J miceJackson LaboratoriesStrain# 000664
C. scindens strain 35704American Type Culture Collection35704
CefoxitinSagent NDC25021-109-10
Corn oilMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
ethanolFisher ScientificAC611050040
Formic acidSigma–Aldrich5.33002
FVB/NJ miceJackson LaboratoriesStrain# 001800
GlycerolSigma–AldrichG5516
HexaneFisher Scientific02-002-996
LC-MS grade waterFisher Scientific14-650-357
MethanolFisher Scientific02-003-340
Microtainer serum separator tubeBecton Dickinson02-675-185
Molecular biology grade waterCorning46-000-CI
NSG miceJackson LaboratoriesStrain# 005557
PBSCorning21-031-CV
Qubit DNA HS kitInvitrogenQ32851
Racemic equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
Reinforced Clostridial agarAnaerobe SystemsAS-6061
Reinforced Clostridial brothAnaerobe SystemsAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
S-equol reference standard for LC-MSCayman Chemical10010173
Single channel pipetteRainin17008652
Streptococcus salivarius genomic DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-1024D-5
Sweetened condensed milkCalifornia FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatiaSigma–AldrichG7017

参考文献

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