Utilisation de l’administration de médicaments guidée par micropipette comme méthode alternative au gavage oral chez les rongeurs

Résumé

Ici, nous décrivons l’administration de médicaments guidée par micropipette (MDA) comme une méthode alternative au gavage oral qui incite l’animal de recherche à ingérer facilement les traitements avec un minimum de stress et d’inconfort.

Résumé

Le gavage oral (OG) à l’aide d’une canule attachée à une seringue est l’une des méthodes les plus couramment utilisées pour administrer un dosage précis de composés à l’estomac des animaux de recherche. Malheureusement, cette méthode présente des difficultés tant pour l’opérateur que pour l’animal de recherche. Des études ont montré que l’OG peut entraîner des complications, notamment l’œsophagite, la perforation de l’œsophage et l’administration accidentelle de médicaments trachéaux. De plus, l’OG est associé à une augmentation des taux plasmatiques et fécaux de corticostérone (en raison du stress), à une altération de la pression artérielle et à une augmentation de la fréquence cardiaque, ce qui pourrait influencer négativement ou biaiser les résultats de l’étude. Une méthode alternative précédemment développée, appelée administration de médicaments guidée par micropipette (MDA), incite l’animal à consommer facilement des traitements de manière peu invasive. Ici, nous présentons des exemples de l’utilisation de la technique MDA avec des traitements reconstitués dans différents véhicules et démontrons l’efficacité de l’administration des traitements variés à plusieurs souches de souris différentes. Nous démontrons en outre que la MDA est une technique qui diminue le moment et le caractère invasif de l’administration des médicaments et n’affecte pas la composition du microbiome intestinal telle qu’évaluée par l’analyse quantitative des espèces microbiennes intestinales de base. Dans l’ensemble, la MDA peut offrir une alternative moins stressante et efficace à la GO.

Introduction

L’administration de médicaments aux modèles de rongeurs se fait généralement par gavage oral (OG), qui consiste à administrer une préparation liquide directement dans l’estomac à l’aide d’une canule attachée à une seringue contenant la solution. Cette technique permet d’obtenir un dosage constant et précis du traitement à l’animal, mais comporte également de multiples inconvénients. L’OG a fait l’objet d’un examen minutieux pour ne pas avoir modélisé de manière adéquate les expositions alimentaires humaines ^1,2. De plus, l’OG augmente le risque de lésions involontaires du système digestif supérieur (perforation de l’œsophage et de l’estomac), d’aspiration du traitement administré et de lésions des voies respiratoires³. L’OG est également associée à l’inconfort⁴, à l’augmentation de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque⁵, ainsi qu’au stress ^6,7 et parfois à la mort⁸ en raison d’une diminution de la tolérance au gavage par l’animal. Ces changements physiologiques peuvent interférer avec ou fausser les résultats expérimentaux ; Ainsi, de nouvelles procédures ont été explorées pour éviter ces effets secondaires. Des études ont utilisé des procédures alternatives à l’OG, telles que l’utilisation de gélatine comme véhicule médicamenteux⁹, des bandelettes dissolvantes par voie orale (SACO)¹⁰, des aiguilles de gavage enrobées de saccharose¹¹, des sondes d’alimentation flexibles, des biscuits de blé¹², du miel¹³ et des granulés de beurre d’arachide¹⁴. Malheureusement, ces modifications de la technique OG présentent des limites, notamment l’incompatibilité avec les médicaments insolubles dans l’eau, le temps de préparation plus long pour le traitement¹⁵, l’appétence et la stabilité du médicament¹⁵, et la familiarisation de l’animal avec la nourriture. De plus, il est possible que le dosage soit moins précis lorsque les animaux se nourrissent à volonté.

Scarborough et ^al.7 ont précédemment mis au point une méthode alternative de traitement oral chez la souris, qu’ils ont appelée administration de médicaments guidée par micropipette (MDA). Cette méthode d’administration est basée sur une solution de lait concentré sucré comme véhicule pour les substances pharmacologiques, ce qui motive les animaux de l’étude à consommer facilement le véhicule préparé et/ou les solutions médicamenteuses en distribuant la solution à l’aide d’une pipette monocanal et d’une pointe de pipette. Pour introduire cette technique, les rongeurs suivent une séance d’entraînement (minimum 2 jours) afin de raccourcir les temps de manipulation et de permettre à l’animal d’étude de se familiariser avec l’abreuvement de la pointe⁴ de la pipette. Les premières études de validation menées par Scarborough et ^coll.7 et Schalbetter et ^coll.16 suggèrent que la procédure d’AMM est facile à mettre en œuvre, rentable, peu invasive et moins stressante pour les animaux que les méthodes conventionnelles de gavage oral. Scarborough et al. ont introduit l’utilisation de la technique MDA dans un modèle murin d’activation immunitaire maternelle (MIA) des troubles neurodéveloppementaux⁷. Cette étude a démontré que les profils pharmacocinétiques des souris traitées avec l’antipsychotique rispéridone à l’aide de la MDA étaient comparables à l’utilisation de l’OG. De plus, la MDA n’a pas induit d’augmentation des niveaux de corticostérone (une hormone du stress) chez les souris, et le traitement chronique par rispéridone utilisant la technique MDA a conduit à une diminution dose-dépendante des déficits d’interaction sociale induits par la MIA et de l’hypersensibilité aux amphétamines⁷. D’autres études ont exploré l’efficacité de la MDA par rapport à l’OG dans des modèles de souris¹⁷ et de rat¹⁸ . La MDA a également été comparée à l’injection intrapéritonéale et s’est avérée aussi efficace pour administrer du N-oxyde de clozapine aux souris¹⁶. En raison du succès rapporté de la MDA dans la réduction du stress animal et de l’efficacité thérapeutique, nous visons maintenant à explorer davantage la technique MDA en tant que méthode efficace d’administration de médicaments en utilisant des modèles murins supplémentaires. Ici, nous décrivons la mise en œuvre de la méthode MDA pour traiter différentes souches de souris, y compris les souches FVB/NJ et C57BL/6J immunocompétentes et la souche immunodéprimée NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) avec différents traitements oraux, y compris des bactéries vivantes, des composés expérimentaux administrés dans des solutions insolubles dans l’eau (huile de maïs) et des contrôles de véhicules. Nous avons évalué l’activité et la présence des différents traitements dans le sérum et les matières fécales, et nous avons évalué les altérations du microbiote intestinal central en relation avec la méthode MDA.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives de l’établissement et aux protocoles approuvés par l’IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) de l’Université Johns Hopkins M021M197 et M023M195. Les souches de souris utilisées (souris mâles, âgées de 7 semaines) sont décrites dans la table des matières. L’utilisation de souris mâles était due à leur utilisation dans les études en cours sur le cancer de la prostate. La méthode MDA s’est déjà avérée efficace chez les souris femelles ^7,17. Les souris ont été randomisées dans leurs cages/groupes de traitement respectifs. Les souris ont été traitées dans des cages et sans ordre particulier. L’expérimentateur qui administrait les traitements était aveugle au groupe de traitement. Le numéro attribué à une souris faisait référence à son identifiant et non à l’ordre dans lequel elle a été traitée. Les données ont été collectées tout au long de la chronologie de l’étude et analysées à la fin pour éviter tout biais. Les tests expérimentaux ont été mis à l’insu du groupe de traitement jusqu’à ce que toutes les données soient recueillies.

REMARQUE : Ce protocole a été modifié à partir de Scarborough et ^al.7.

1. Préparation des traitements

1. Préparez une solution de lait concentré sucré (ingrédients : lait et sucre) et d’eau de biologie moléculaire en utilisant un rapport lait/eau de 3:10. Mesurer le lait concentré sucré à l’aide d’un tube conique de 15 mL en raison de la viscosité du lait.
2. À l’aide d’un tube conique de 50 ml, mélangez de l’eau de biologie moléculaire avec le lait concentré sucré en mélangeant lentement 5 ml d’eau à la fois avec le lait.
   REMARQUE : Cette étape est effectuée dans des conditions stériles à l’aide d’une enceinte de biosécurité.
3. Préparez les aliquotes de la solution de lait (stockées sous forme d’aliquotes de 500 μL) et stockez-les à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient associées au traitement d’intérêt.
4. Remettre les traitements en suspension dans leurs véhicules respectifs à la bonne concentration en fonction du poids corporel de l’animal avant de les combiner avec la solution condensée sucrée de lait et d’eau.

2. Séance de formation MDA

REMARQUE : Cette section décrit les modèles de souris ; cependant, la technique MDA pourrait être étendue au besoin avec des volumes/pointes de pipette plus importants pour les modèles de rongeurs plus grands.

1. FACULTATIF : Retenez doucement l’animal d’étude en tenant la peau du cou d’une main.
2. Offrez à l’animal d’étude 100 μL de solution de lait concentré sucré/eau uniquement (sans l’ajout du traitement expérimental) à l’aide d’une pipette monocanal et d’une pointe de pipette de 200 μL qui est guidée vers la bouche.
3. Distribuez lentement la solution lait/eau pour éviter de manquer la bouche de l’animal. Assurez-vous que l’animal consomme facilement la solution de lait entre 5 et 15 secondes.
   REMARQUE : Cette formation se déroule pendant au moins 2 jours consécutifs (une séance d’entraînement par jour), sans modification du volume administré. Une légère retenue de la part de Scruff a été nécessaire pour les séances d’entraînement de MDA. Scarborough et ^al.7 recommandent la contention complète de l’animal le premier jour de la formation MDA, puis la contention par la queue le deuxième jour. La méthode de contention peut différer pour les modèles de rongeurs plus grands. En revanche, Vanhecke et ^al.17 n’ont tenu les souris que légèrement par la queue pendant l’entraînement.

3. Traitements chez la souris à l’aide de la méthode MDA

1. Combinez le traitement à l’étude avec la solution de lait concentré sucré/eau (voir ci-dessous des exemples avec des expériences de validation [section 4 et section 5]).
2. FACULTATIF : Retenez doucement l’animal d’étude en tenant la peau du cou d’une main.
   REMARQUE : Scarborough et ^coll.7 rapportent que les souris n’ont plus besoin d’être contraintes au-delà de la période d’entraînement et qu’elles boivent facilement à l’extrémité de la pipette. En revanche, Vanhecke et ^coll.17 rapportent que pour certains traitements (p. ex., le tamoxifène) qui pourraient présenter une légère aversion au goût, la meilleure façon de réaliser l’AMM est de retenir doucement les souris à l’aide d’une peau pendant tous les traitements. Cette étude a également déterminé que le fait de positionner l’animal sur le dos avec une peau douce améliore le temps et l’efficacité de la consommation du traitement.
3. Administrer 100 μL de traitement à l’aide d’une pipette monocanal et d’une pointe de pipette de 200 μL guidée vers la bouche de l’animal, comme cela a été fait lors des séances de formation.
4. Traitez un seul animal à la fois.
5. Remettez chaque animal dans sa cage respective après le traitement.
   REMARQUE : Les traitements utilisant la méthode MDA peuvent être administrés quotidiennement ou de manière répétée ^7,17.

4. Expérience de validation #1 - administration orale de bactéries intestinales à des souris à l’aide de la MDA

REMARQUE : Cette section décrit l’utilisation de la méthode MDA pour administrer par voie orale des bactéries vivantes pour les études de colonisation intestinale chez la souris. Dans cette expérience pilote représentative, la bactérie à Gram positif Clostridium scindens est administrée à des souris C57BL/6J. Les souris ont été traitées avec des antibiotiques (céfoxitine) pendant deux jours consécutifs dans l’eau de boisson avant l’inoculation bactérienne avec MDA.

1. Culture bactérienne
   1. Cultiver la souche ATCC 35704 de C. scindens dans un bouillon clostridien renforcé (RCB) à l’aide d’un stock de glycérol congelé pour inoculer 500 μL de bactéries dans un tube de 7 mL de RCB. Cultiver en anaérobie pendant la nuit à 37 °C.
   2. Utilisez 500 μL de la culture bactérienne de nuit pour inoculer un nouveau tube RCB et incuber en anaérobie pendant 24 h. Retirez ce tube de la chambre anaérobie et utilisez-le pour préparer le traitement bactérien pour l’AMM. Utilisez ce même tube pour calculer les unités formant colonies par millilitre (UFC/mL).
2. Calcul de l’UFC/mL de C. scindens
   1. Créer une dilution de 1:3 de la culture de C. scindens en utilisant 3,5 mL de la culture inoculée dans 7 mL de milieu RCB. À l’aide d’un échantillon de cette dilution, on obtient un stock de glycérol de 1 mL à 20 % (1:1) qui est stocké à -80 °C.
   2. Plaque 100 μL de la dilution 1:3 sur des plaques de gélose clostridiale renforcée (RCA). Utilisez la première dilution pour effectuer les diluations en série suivantes et la plaque pour un total de trois fois de plus.
   3. Après l’incubation des plaques RCA, comptez les colonies et calculez l’UFC. Utilisez l’équation suivante pour calculer la concentration de cellules bactériennes dans les échantillons dilués et originaux :
      UFC dans l’échantillon dilué (cellules/mL) = (nombre de colonies comptées sur la plaque d’ACR)/(quantité d’échantillon dilué ajoutée à la plaque d’ACR en mL)
      UFC dans l’échantillon d’origine (cellules/mL) = (UFC dans l’échantillon dilué)/(dilution de la plaque d’ACR)
3. Préparation du traitement à C. scindens pour l’AMM
   1. Combinez une solution de 50 μL (1,265 x 10⁶ UFC/mL dans cet exemple) de C. scindens + 50 μL de la solution condensée sucrée de lait et d’eau.
      REMARQUE : Si une UFC spécifique est nécessaire, une autre méthode de quantification des cellules bactériennes peut être utilisée, telle que la création d’une courbe standard avec des mesures de densité optique (DO) à 600 nm.
4. Traitement oral de souris par C. scindens à l’aide de MDA
   1. Les jours 1 à 3, familiarisez les souris avec la solution de lait comme décrit dans la section 2 (séance d’entraînement MDA).
   2. Le jour 4, administrer 100 μL de la solution de lait C. scindens + ou de PBS (témoin) + solution de lait par MDA à des souris C57BL/6J. Traitez les souris une fois pendant toute la durée de l’étude.
5. Prélèvement d’échantillons fécaux
   1. Tenez la souris par une légère peau et attendez qu’elle décharge une boulette fécale. Prélevez les boulettes fécales directement du rectum dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 ml. Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à utilisation.
6. PCR quantitative de C. scindens (qPCR)
   1. Effectuer l’extraction de l’ADN fécal à l’aide d’un protocole précédemment publié^19,20.
   2. Déterminez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre à ADN pour une détection haute sensibilité. Normaliser les échantillons d’ADN à 10 ng/μL et les conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
   3. Utilisez la qPCR pour étudier l’abondance de : (i) bactéries C. scindens à l’aide d’amorces conservées contre le gène desA de la souche ATCC 35704 de C. scindens, (ii) bactéries totales à l’aide d’amorces conçues contre la région hypervariable V6 du gène de l’ARNr bactérien 16S comme décrit précédemment^20,21.
      REMARQUE : Les conditions de qPCR et les amorces utilisées sont répertoriées dans le Tableau 1. Une courbe standard utilisant l’ADN de la souche ATCC 35704 de C. scindens a été utilisée pour estimer les copies de la bactérie desA+.

5. Expérience de validation #2 - administration expérimentale de médicaments à des souris à l’aide de la MDA

REMARQUE : Cette section décrit l’utilisation de la méthode MDA pour administrer un composé expérimental à des souris. Dans cette expérience pilote représentative, le métabolite du soja equol (S-equol) est administré à des souris NSG et FVB/NJ.

1. Préparation du traitement S-equol
   REMARQUE : Le S-equol et le diméthylsulfoxyde (DMSO) sont tous deux aliquotes et stockés à -20 °C jusqu’à leur utilisation.
   1. Reconstitue le S-équol dans le DMSO associé à de l’huile de maïs (90 %). Mélanger du S-équol aliquote dans de l’huile de maïs (220 μL) avec 480 μL de la solution condensée sucrée de lait et d’eau. Combinez et mélangez cette solution dans la salle animalière pour éviter la séparation de l’huile du lait.
      REMARQUE : Si la séparation de la solution est observée, mélangez la solution avant le traitement. La dose de S-équol administrée est de 25 mg/kg/jour. Les souris utilisées dans cette étude avaient toutes un poids similaire, elles ont donc reçu la même dose. Il peut être nécessaire d’ajuster la dose du traitement et de la transformer en plusieurs préparations en fonction du poids des animaux à l’étude.
   2. Combinez le véhicule DMSO avec de l’huile de maïs (90 %). Mélanger du DMSO aliquote dans de l’huile de maïs (220 μL) avec 480 μL de la solution condensée sucrée de lait et d’eau. Combinez et mélangez cette solution dans la salle animalière pour éviter la séparation de l’huile du lait.
      REMARQUE : Si la séparation de la solution est observée, mélangez la solution avant le traitement.
2. Traitement oral de souris avec du S-équol par MDA
   1. Les jours 1 et 2, familiarisez les souris avec la solution de lait comme décrit dans la section 2 (séance d’entraînement MDA).
      REMARQUE : Pour l’expérience de validation #1, le temps d’entraînement décrit dans Scarborough et al. a été suivi, ce qui suggère un temps d’acclimatation de 3 jours. Dans cette expérience, un temps d’entraînement plus court (2 jours) a été testé et a révélé qu’il ne modifiait pas l’administration des traitements d’intérêt.
   2. Aux jours 3 à 43, traiter les souris avec (i) un témoin PBS, (ii) un véhicule DMSO ou (iii) du S-equol, le tout combiné avec la solution condensée sucrée de lait et d’eau. Faites un mélange principal de la solution pour fournir une solution homogène des traitements à tous les animaux étudiés. Administrer un volume total de 100 μL à chaque souris une fois par jour, 5 jours par semaine, pour un total de 43 jours.
3. Prélèvement sanguin
   1. Prélever du sang après l’euthanasie (surdose de dioxyde de carbone) par ponction cardiaque. Transférez le sang dans un tube séparateur de sérum microtainer, mélangez et conservez à température ambiante (RT) jusqu’à ce que le traitement soit ultérieur.
   2. Centrifuger l’échantillon de sang pour compléter la séparation à 254 x g pendant 5 min. Prélever le sérum (couche supérieure de séparation) et le conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
4. Chromatographie liquide S-equol avec spectrométrie de masse en tandem (LC/MS/MS)
   1. Reportez-vous au fichier de la Table des matériaux pour connaître les produits chimiques et les réactifs utilisés pour cette expérience.
   2. Étalons d’étalonnage et contrôle de la qualité : Préparer des solutions mères de S-équol et d’étalon interne (racémique équol-d4) dans du DMSO à des concentrations de 1 mg/mL et les conserver à -20 °C.
   3. Diluer les solutions mères étalons avec de l’acétonitrile et de l’eau (50:50) pour préparer une solution de travail mixte de différentes concentrations. Préparer l’étalon interne dans de l’acétate d’éthyle comme solution d’extraction à une concentration de 100 ng/mL. Conservez les stocks et les solutions de travail à 4 °C et utilisez-les quotidiennement, diluées ou directement.
   4. Extraction d’échantillons
      1. Préparer l’échantillon en utilisant la précipitation des protéines par une solution d’extraction (acétate d’éthyle plus étalon interne, voir section 5.4.3), suivie d’une centrifugation et d’une évaporation du surnageant sous azote sec (50 °C).
      2. Reconstituer l’échantillon dans 100 μL d’acétonitrile à 50 % et le transférer dans des flacons d’échantillonneur automatique pour l’analyse LC/MS/MS.
   5. Séparation des échantillons
      1. Réalisez la séparation avec une colonne C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 μm. Utilisez de l’acide formique à 0,1 % comme phase mobile A et de l’acide formique à 0,1 % dans la phase mobile B de l’acétonitrile.
      2. Utilisez un gradient et maintenez la phase B mobile à 40 % avec un débit de 0,3 mL/min pendant 0,5 min. Ensuite, augmentez le débit à 100 % sur 1 min, maintenez-le pendant 2 min, puis revenez à 40 % B pendant 1 min.
      3. Surveiller l’effluent de la colonne à l’aide d’un détecteur spectrométrique de masse par ionisation par électronébulisation, qui fonctionne en mode négatif. Programmez le spectromètre pour surveiller les transitions de surveillance des réactions multiples (MRM) suivantes : 241 → 119.1 pour S-equol et 245 → 123 pour l’étalon interne, equol-d4.
      4. Calculer la courbe d’étalonnage pour S-equol à l’aide du rapport de surface crête de l’analyse par rapport à l’étalon interne à l’aide d’une équation quadratique avec une fonction de pondération de 1/x² à l’aide des plages d’étalonnage de 5 à 500 ng/mL.

6. Mesurer l’effet du traitement à la MDA sur le microbiote intestinal central

REMARQUE : Cette section décrit l’utilisation de la qPCR pour mesurer les niveaux de microbiote intestinal central après un traitement MDA.

1. Effectuer le prélèvement d’échantillons fécaux et l’extraction de l’ADN comme décrit aux étapes 4.5.1 et 4.6.1.
2. Déterminez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre à ADN pour une détection haute sensibilité. Normaliser les échantillons d’ADN à 10 ng/μL et les conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
3. Utilisez la qPCR pour étudier l’abondance des membres du microbiote intestinal : (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp., et (v) bactéries totales à l’aide d’amorces conçues contre la région hypervariable V6 du gène de l’ARNr bactérien 16S comme décrit précédemment 20,21,22.
   REMARQUE : Les conditions de qPCR et les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau 2.

Résultats

La MDA peut être utilisée dans l’administration orale de souches bactériennes dans des modèles murins. Les souris C57BL/6J ont été traitées avec des antibiotiques (céfoxitine dans l’eau potable) pendant 2 jours pour éliminer les communautés microbiennes commensales avant de commencer la séance d’entraînement MDA. La solution condensée sucrée de lait et d’eau a été administrée une fois par jour consécutivement pendant 3 jours avant l’administra...

Discussion

La MO peut être une source importante de stress chez les animaux de recherche qui peut créer une variable confondante, comme l’ont déjà évalué plusieurs études 7,9,11,12,13,14,15,23. En raison de l’invasivité de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL pipette tips	Mettler Toledo	17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detector	Sciex	N/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-835D-5
Ammonium acetate	Sigma–Aldrich	5.43834
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain# 000664
C. scindens strain 35704	American Type Culture Collection	35704
Cefoxitin	Sagent	NDC25021-109-10
Corn oil	MedChemExpress	HY-Y1888
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
ethanol	Fisher Scientific	AC611050040
Formic acid	Sigma–Aldrich	5.33002
FVB/NJ mice	Jackson Laboratories	Strain# 001800
Glycerol	Sigma–Aldrich	G5516
Hexane	Fisher Scientific	02-002-996
LC-MS grade water	Fisher Scientific	14-650-357
Methanol	Fisher Scientific	02-003-340
Microtainer serum separator tube	Becton Dickinson	02-675-185
Molecular biology grade water	Corning	46-000-CI
NSG mice	Jackson Laboratories	Strain# 005557
PBS	Corning	21-031-CV
Qubit DNA HS kit	Invitrogen	Q32851
Racemic equol-d4	Santa Cruz Biotechnology	sc-219827
Reinforced Clostridial agar	Anaerobe Systems	AS-6061
Reinforced Clostridial broth	Anaerobe Systems	AS-606
S-equol	MedChemExpress	HY-100583
S-equol reference standard for LC-MS	Cayman Chemical	10010173
Single channel pipette	Rainin	17008652
Streptococcus salivarius genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-1024D-5
Sweetened condensed milk	California Farms	B09TGQ7WV8
VSL#3	VSL#3	B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatia	Sigma–Aldrich	G7017