Kemirgen Modellerinde Oral Gavaja Alternatif Bir Yöntem Olarak Mikropipet Kılavuzluğunda İlaç Uygulamasının Kullanımı

Özet

Burada, mikropipet kılavuzluğunda ilaç uygulamasını (MDA), araştırma hayvanını minimum stres ve rahatsızlıkla tedavileri kolayca yutmaya teşvik eden oral gavaja alternatif bir yöntem olarak tanımlıyoruz.

Özet

Bir şırıngaya bağlı bir kanül kullanılarak yapılan oral gavaj (OG), araştırma hayvanlarının midesine bileşiklerin hassas dozunu sağlamak için kullanılan en yaygın yöntemlerden biridir. Ne yazık ki, bu yöntem hem operatör hem de araştırma hayvanı için zorluklarla birlikte gelir. Çalışmalar, OG'nin özofajit, yemek borusu perforasyonu ve yanlışlıkla trakeal ilaç uygulaması gibi komplikasyonlara yol açabileceğini göstermiştir. Ek olarak, OG, artmış plazma ve fekal kortikosteron seviyeleri (stres nedeniyle), değişmiş kan basıncı ve artmış kalp atış hızı ile ilişkilidir, bu da çalışma sonuçlarını olumsuz yönde etkileyebilir veya önyargılı olabilir. Mikropipet kılavuzluğunda ilaç uygulaması (MDA) olarak adlandırılan daha önce geliştirilmiş alternatif bir yöntem, hayvanı minimal invaziv bir şekilde tedavileri kolayca tüketmeye teşvik eder. Burada, MDA tekniğinin farklı araçlarda yeniden oluşturulan tedavilerle kullanımına ilişkin örnekler sunuyoruz ve çeşitli tedavilerin birden fazla farklı fare suşuna etkili bir şekilde uygulandığını gösteriyoruz. Ayrıca, MDA'nın ilaç uygulamasının zamanlamasını ve invazivliğini azaltan ve çekirdek bağırsak mikrobiyal türlerinin kantitatif analizi ile değerlendirildiği gibi bağırsak mikrobiyom bileşimini etkilemeyen bir teknik olduğunu gösteriyoruz. Genel olarak, MDA, OG'ye daha az stresli ve etkili bir alternatif sunabilir.

Giriş

Kemirgen modellerine ilaç uygulaması yaygın olarak, çözeltiyi içeren bir şırıngaya bağlı bir kanül kullanılarak doğrudan mideye sıvı bir preparatın uygulanmasından oluşan oral gavaj (OG) yoluyla gerçekleştirilir. Bu teknik, tedavinin hayvana tutarlı ve kesin bir şekilde dozlanmasına neden olur, ancak aynı zamanda birçok dezavantaj da taşır. OG, insan diyeti maruziyetlerini yeterince modellemediği için incelenmiştir ^1,2. Ayrıca, OG, üst sindirim sisteminde kasıtsız yaralanmalar (yemek borusu ve mide delinmesi), uygulanan tedavinin aspirasyonu ve solunum yolu lezyonları riskini artırır³. OG ayrıca rahatsızlık⁴, artmış kan basıncı ve kalp atış hızı⁵, ayrıca stres ^6,7 ve bazen de hayvan tarafından gavaj toleransının azalması nedeniyle ölüm⁸ ile ilişkilidir. Bu fizyolojik değişiklikler deneysel sonuçlara müdahale edebilir veya karıştırabilir; Bu nedenle, bu yan etkilerden kaçınmak için yeni prosedürler araştırılmıştır. Çalışmalar, jelatinin bir ilaç aracı^{olarak kullanılması 9}, ağızdan çözünen şeritler (ODS)¹⁰, sükroz kaplı gavaj iğneleri¹¹, esnek besleme tüpleri, buğday kurabiyeleri¹², bal¹³ ve fıstık ezmesi peletleri¹⁴ gibi OG'ye alternatif prosedürler kullanmıştır. Ne yazık ki, OG tekniğinde yapılan bu modifikasyonlarda, suda çözünmeyen ilaçlarla uyumsuzluk, tedavi için daha uzun hazırlık süresi¹⁵, ilaç lezzeti ve stabilitesi¹⁵ ve hayvanın gıdaya aşina olması dahil olmak üzere sınırlamalar vardır. Ayrıca, hayvanlar ad lib beslediğinde daha az hassas dozlama potansiyeli vardır.

Scarborough ve ^ark.7 daha önce farelerde mikropipet kılavuzluğunda ilaç uygulaması (MDA) olarak adlandırdıkları alternatif bir oral tedavi yöntemi geliştirdiler. Bu uygulama yöntemi, farmakolojik maddeler için bir araç olarak tatlandırılmış yoğunlaştırılmış bir süt çözeltisine dayanır ve çalışma hayvanlarını, çözeltiyi tek kanallı bir pipet ve pipet ucu ile dağıtarak hazırlanan aracı ve/veya ilaç çözeltilerini kolayca tüketmeye motive eder. Bu tekniği uygulamak için, kemirgenler, işlem sürelerini kısaltmak ve çalışma hayvanının pipet ucundan⁴ içmeye aşina olmasını sağlamak için bir eğitim seansına (en az 2 gün) tabi tutulur. Scarborough ve ^ark.7 ve Schalbetter ve ^ark.16 tarafından yapılan ilk doğrulama çalışmaları, MDA prosedürünün geleneksel oral gavaj yöntemlerine göre uygulanması kolay, uygun maliyetli, minimal invaziv ve hayvanlar için daha az stresli olduğunu göstermektedir. Scarborough ve ark. nörogelişimsel bozuklukların^maternal immün aktivasyonunun (MIA) bir fare modelinde MDA tekniğinin kullanımını tanıttı 7. Bu çalışma, MDA kullanılarak antipsikotik ilaç risperidon ile tedavi edilen farelerin farmakokinetik profillerinin OG kullanımı ile karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca, MDA, farelerde kortikosteron (bir stres hormonu) seviyelerinde bir artışa neden olmadı ve MDA tekniği kullanılarak risperidon ile kronik tedavi, MIA'nın neden olduğu sosyal etkileşim eksikliklerinde ve amfetamin aşırı duyarlılığında doza bağlı bir azalmaya yol açtı⁷. Ek çalışmalar, hem fare¹⁷ hem de sıçan¹⁸ modellerinde MDA'nın OG'ye karşı etkinliğini araştırmıştır. MDA ayrıca intraperitoneal enjeksiyon ile karşılaştırılmıştır ve farelere klozapin-N-oksit^{verilmesinde etkili olduğu gösterilmiştir 16}. MDA'nın hayvan stresini ve terapötik etkinliği azaltmadaki bildirilen başarısı nedeniyle, şimdi ek murin modelleri kullanarak MDA tekniğini etkili bir ilaç verme yöntemi olarak daha fazla araştırmayı amaçlıyoruz. Burada, bağışıklığı yetkinliğe sahip FVB/NJ ve C57BL/6J suşları ve bağışıklığı baskılanmış NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) suşu dahil olmak üzere farklı fare suşlarını canlı bakteriler, suda çözünmeyen çözeltilerde (mısır yağı) verilen deneysel bileşikler ve araç kontrolleri dahil olmak üzere farklı oral tedavilerle tedavi etmek için MDA yönteminin uygulanmasını açıklıyoruz. Serum ve dışkıdaki farklı tedavilerin aktivitesini ve varlığını değerlendirdik ve MDA yöntemiyle ilişkili olarak çekirdek bağırsak mikrobiyotasındaki değişiklikleri değerlendirdik.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, kurumsal yönergelere uygun olarak ve Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onaylı M021M197 ve M023M195 protokolleri kapsamında gerçekleştirilmiştir. Kullanılan fare suşları (erkek fareler, 7 haftalık) Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. Erkek farelerin kullanımı, devam eden prostat kanseri çalışmalarında kullanılmalarından kaynaklanıyordu. MDA yönteminin daha önce dişi farelerde de etkili olduğu gösterilmiştir ^7,17. Fareler kendi kafeslerine / tedavi gruplarına randomize edildi. Fareler kafeslerde ve belirli bir sırayla tedavi edildi. Tedavileri uygulayan deneyci, tedavi grubuna kör edildi. Bir fareye atanan numara, fareye tedavi edilme sırasına değil, kimliklerine atıfta bulundu. Veriler, çalışmanın zaman çizelgesi boyunca toplandı ve herhangi bir önyargıyı önlemek için sonunda analiz edildi. Deneysel tahliller, tüm veriler toplanana kadar tedavi grubuna kör edildi.

NOT: Bu protokol Scarborough ve ^ark.7'den değiştirilmiştir.

1. Tedavilerin hazırlanması

1. 3:10 oranında süt-su kullanarak şekerli yoğunlaştırılmış süt (malzemeler: süt ve şeker) ve moleküler biyoloji sınıfı sudan oluşan bir çözelti hazırlayın. Sütün viskozitesi nedeniyle tatlandırılmış yoğunlaştırılmış sütü 15 mL'lik konik bir tüp kullanarak ölçün.
2. 50 mL'lik bir konik tüp kullanarak, moleküler biyoloji dereceli suyu şekerli yoğunlaştırılmış sütle karıştırın ve her seferinde 5 mL suyu sütle yavaşça karıştırın.
   NOT: Bu adım, bir biyogüvenlik kabini kullanılarak steril koşullar altında gerçekleştirilir.
3. Süt çözeltisinin alikotlarını hazırlayın (500 μL alikotlar olarak saklanır) ve alikotları, ilgilenilen muamele ile birleştirilene kadar 4 ° C'de saklayın.
4. Tatlandırılmış yoğunlaştırılmış süt/su çözeltisi ile birleştirmeden önce, ilgili araçlarda hayvanın vücut ağırlığına göre doğru konsantrasyonda tedavileri yeniden askıya alın.

2. MDA eğitim oturumu

NOT: Bu bölümde fare modelleri açıklanmaktadır; bununla birlikte, MDA tekniği, daha büyük kemirgen modelleri için daha büyük hacimler/pipet uçları ile gerektiği gibi ölçeklendirilebilir.

1. İSTEĞE BAĞLI: Bir elinizle boynunun tırnağını tutarak çalışma hayvanını nazikçe tutun.
2. Çalışma hayvanına, tek kanallı bir pipet ve ağza yönlendirilen 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yalnızca 100 μL şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi (deneysel tedavi eklenmeden) sunun.
3. Hayvanın ağzını kaçırmamak için süt/su solüsyonunu yavaşça dağıtın. Hayvanın süt çözeltisini 5-15 s arasında kolayca tükettiğinden emin olun.
   NOT: Bu eğitim, en az 2 ardışık gün (günde bir eğitim seansı) boyunca gerçekleşir ve uygulanan ses seviyesinde herhangi bir değişiklik yapılmaz. MDA eğitim seansları için tırmıklama ile nazik bir kısıtlama gerekliydi. Scarborough ve ^ark.7 , MDA eğitiminin ilk gününde hayvanın tam olarak kısıtlanmasını ve ardından ikinci gün kuyruktan tutulmasını önermektedir. Kısıtlama yöntemi, daha büyük kemirgen modelleri için farklılık gösterebilir. Buna karşılık, Vanhecke ve ^ark.17 , eğitim sırasında fareleri sadece kuyruğundan hafifçe tuttu.

3. MDA yöntemini kullanarak fare tedavileri

1. Çalışma işlemini şekerli yoğunlaştırılmış süt/su çözeltisi ile birleştirin (aşağıdaki doğrulama deneyleri ile örneklere bakın [bölüm 4 ve bölüm 5]).
2. İSTEĞE BAĞLI: Bir elinizle boynunun tırnağını tutarak çalışma hayvanını nazikçe tutun.
   NOT: Scarborough ve ^ark.7 , farelerin artık eğitim süresinin ötesinde kısıtlamaya ihtiyaç duymadığını ve pipet ucundan kolayca içeceklerini bildirmektedir. Buna karşılık, Vanhecke ve ^ark.17 , hafif tat isteksizliğine sahip olabilecek bazı tedaviler (örneğin, tamoksifen) için, MDA'nın en iyi şekilde, tüm tedaviler sırasında fareleri tırmık yoluyla nazikçe kısıtlayarak gerçekleştirildiğini bildirmektedir. Bu çalışma aynı zamanda hayvanı hafif bir tırnekle sırt üstü yatırmanın tedavi tüketiminin süresini ve etkinliğini artırdığını da belirlemiştir.
3. Eğitim seansları sırasında yapıldığı gibi, tek kanallı bir pipet ve hayvanın ağzına yönlendirilen 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak 100 μL'lik tedavi uygulayın.
4. Bir seferde tek bir hayvanı tedavi edin.
5. Tedaviden sonra her hayvanı kendi kafesine geri koyun.
   NOT: MDA yöntemi kullanılarak yapılan tedaviler günlük veya tekrarlanan bir şekilde verilebilir ^7,17.

4. Doğrulama deneyi #1 - MDA kullanarak bağırsak bakterilerinin farelere oral yoldan verilmesi

NOT: Bu bölüm, farelerde bağırsak kolonizasyon çalışmaları için canlı bakterileri ağızdan vermek için MDA yönteminin kullanımını açıklar. Bu temsili pilot deneyde, gram pozitif bakteri Clostridium scindens C57BL / 6J farelerine verilir. Fareler, MDA ile bakteri aşılamasından önce içme suyunda art arda iki gün boyunca antibiyotiklerle (sefoxitin) tedavi edildi.

1. Bakteri kültürü
   1. Kültür C. scindens, 500 μL bakteriyi 7 mL'lik bir RCB tüpüne aşılamak için donmuş bir gliserol stoğu kullanarak güçlendirilmiş klostridyal et suyunda (RCB) ATCC 35704'ü suuş eder. Gece boyunca 37 °C'de anaerobik olarak büyür.
   2. Yeni bir RCB tüpünü aşılamak için gece boyunca 500 μL bakteri kültürü kullanın ve 24 saat anaerobik olarak inkübe edin. Bu tüpü anaerobik odadan çıkarın ve MDA için bakteri tedavisini hazırlamak için kullanın. Mililitre başına koloni oluşturan birimleri (CFU/mL) hesaplamak için aynı tüpü kullanın.
2. C. scindens CFU/mL'nin hesaplanması
   1. 7 mL RCB ortamına aşılanmış 3.5 mL kültür kullanarak C. scindens kültürünün 1: 3 oranında bir seyreltmesi oluşturun. -80 °C'de saklanan %20 1 mL gliserol stoğu (1:1) yapmak için bu seyreltmenin bir örneğini kullanın.
   2. Güçlendirilmiş clostridial agar (RCA) plakaları üzerine 1: 3 seyreltmenin 100 μL'si. Daha sonra sonraki seri seyreltmeleri yapmak için ilk seyreltmeyi kullanın ve toplam üç kez daha plakalayın.
   3. RCA plakalarının inkübe edilmesinden sonra, kolonileri sayın ve CFU'yu hesaplayın. Seyreltilmiş ve orijinal numunelerdeki bakteri hücrelerinin konsantrasyonunu hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
      Seyreltilmiş numunedeki CFU (hücreler/mL) = (RCA plakasında sayılan koloni sayısı)/(mL cinsinden RCA plakasına eklenen seyreltilmiş numune miktarı)
      Orijinal numunede CFU (hücreler/mL) = (seyreltilmiş numunede CFU)/(RCA plakasının seyreltilmesi)
3. MDA için C. scindens tedavisinin hazırlanması
   1. 50 μL'lik bir çözeltiyi birleştirin (bu örnekte 1.265 x 10⁶ CFU/mL) C. scindens + 50 μL şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi.
      NOT: Spesifik bir CFU'ya ihtiyaç duyulursa, 600 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçümleriyle standart bir eğri oluşturmak gibi alternatif bir bakteri hücresi niceleme yöntemi kullanılabilir.
4. MDA kullanılarak C. scindens ile farelerin oral tedavisi
   1. 1-3. günlerde, fareleri bölüm 2'de (MDA eğitim oturumu) açıklandığı gibi süt çözeltisiyle tanıştırın.
   2. 4. günde, 100 μL C. scindens + süt çözeltisi veya PBS (kontrol) + süt çözeltisi MDA yoluyla C57BL / 6J farelerine uygulayın. Çalışma süresince fareleri bir kez tedavi edin.
5. Dışkı örneği toplama
   1. Fareyi hafifçe tırnarak tutun ve dışkı topağını boşaltmalarını bekleyin. Dışkı peletlerini doğrudan rektumdan steril bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Numuneleri kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
6. C. scindens kantitatif PCR (qPCR)
   1. Daha önce yayınlanmış bir protokol^19,20 kullanarak fekal DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
   2. Yüksek hassasiyetli algılama için bir DNA florometresi kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin. DNA örneklerini 10 ng/μL'ye normalleştirin ve kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
   3. Aşağıdakilerin bolluğunu araştırmak için qPCR kullanın: (i) C. scindens suşu ATCC 35704'ün desA genine karşı korunmuş primerler kullanan C. scindens bakterileri, (ii) daha önce tarif edildiği gibi bakteriyel 16S rRNA geninin V6 hiperdeğişken bölgesine karşı tasarlanmış primerler kullanan toplam bakteri^20,21.
      NOT: Kullanılan qPCR koşulları ve primerler Tablo 1'de listelenmiştir. desA + bakterilerinin kopyalarını tahmin etmek için C. scindens suşu ATCC 35704 DNA'sını kullanan standart bir eğri kullanıldı.

5. Doğrulama deneyi #2 - MDA kullanarak farelere deneysel ilaç verilmesi

NOT: Bu bölüm, farelere deneysel bir bileşik vermek için MDA yönteminin kullanımını açıklar. Bu temsili pilot deneyde, soya metaboliti equol (S-equol) NSG ve FVB / NJ farelerine verilir.

1. S-equol tedavisinin hazırlanması
   NOT: Hem S-equol hem de dimetil sülfoksit (DMSO) aliquoted edilir ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklanır.
   1. S-equol'u mısır yağı (% 90) ile birlikte DMSO'da sulandırın. Aliquoted S-equol'u mısır yağında (220 μL) 480 μL şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi ile karıştırın. Yağın sütten ayrılmasını önlemek için bu çözeltiyi hayvan odasında birleştirin ve karıştırın.
      NOT: Çözeltinin ayrılması gözlenirse, işlemden önce çözeltiyi karıştırın. Uygulanan S-equol dozu 25 mg / kg / gün'dür. Bu çalışmada kullanılan farelerin hepsi ağırlık olarak benzerdi, bu yüzden aynı dozu aldılar. Tedavinin dozunun, çalışma hayvanı ağırlıklarına bağlı olarak ayarlanması ve çoklu preparatlar haline getirilmesi gerekebilir.
   2. DMSO aracını mısır yağı ile birleştirin (% 90). Aliquoted DMSO'yu mısır yağında (220 μL) 480 μL şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi ile karıştırın. Yağın sütten ayrılmasını önlemek için bu çözeltiyi hayvan odasında birleştirin ve karıştırın.
      NOT: Çözeltinin ayrılması gözlenirse, işlemden önce çözeltiyi karıştırın.
2. MDA kullanılarak farelerin S-equol ile oral tedavisi
   1. 1. ve 2. günlerde, fareleri bölüm 2'de (MDA eğitim oturumu) açıklandığı gibi süt çözeltisiyle tanıştırın.
      NOT: Doğrulama deneyi #1 için, Scarborough ve ark. 3 günlük bir alışma süresi öneren Scarborough ve ark. Bu deneyde, daha kısa bir eğitim süresi (2 gün) test edildi ve ilgilenilen tedavilerin uygulanmasını değiştirmediği bulundu.
   2. 3-43. günlerde, fareleri (i) PBS kontrolü, (ii) DMSO aracı veya (iii) S-equol ile tedavi edin, hepsi şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi ile birleştirilmiştir. Tüm çalışma hayvanlarına tedavilerin homojen bir çözeltisini sağlamak için çözeltinin ana karışımını yapın. Her fareye günde bir kez, haftada 5 gün, toplam 43 gün boyunca toplam 100 μL hacim uygulayın.
3. Kan alma
   1. Kalp delinmesi yoluyla ötenazi (aşırı dozda karbondioksit) sonrası kan toplayın. Kanı bir mikrotainer serum ayırıcı tüpe aktarın, karıştırın ve daha sonraki işlemlere kadar oda sıcaklığında (RT) saklayın.
   2. 5 dakika boyunca 254 x g'da ayırmayı tamamlamak için kan örneğini santrifüjleyin. Serumu (üst ayırma tabakası) toplayın ve kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
4. Tandem kütle spektrometresi (LC/MS/MS) testi ile S-equol sıvı kromatografisi
   1. Bu deney için kullanılan kimyasallar ve reaktifler için Malzeme Tablosu dosyasına bakın.
   2. Kalibrasyon standartları ve kalite kontrolü: DMSO'da 1 mg / mL konsantrasyonlarda S-equol ve dahili standart (rasemik equol-d4) stok çözeltilerini hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
   3. Farklı konsantrasyonlarda karışık bir çalışma çözeltisi hazırlamak için stok standart çözeltilerini asetonitril:su (50:50) ile seyreltin. 100 ng / mL konsantrasyonda ekstraksiyon çözeltisi olarak etil asetatta iç standardı hazırlayın. Stok ve çalışma solüsyonlarını 4 °C'de saklayın ve günlük, seyreltilmiş veya doğrudan kullanın.
   4. Numune çıkarma
      1. Numuneyi, ekstraksiyon çözeltisi (etil asetat artı dahili standart, bkz. bölüm 5.4.3) ile protein çökeltme ve ardından kuru nitrojen (50 °C) altında süpernatantın santrifüjlenmesi ve buharlaştırılması kullanarak hazırlayın.
      2. Numuneyi 100 μL %50 asetonitril içinde sulandırın ve LC/MS/MS analizi için otomatik numune alma cihazı şişelerine aktarın.
   5. Numune ayırma
      1. C18 sütunu, 2,1x50 mm, 1,7 μm ile ayırma elde edin. Mobil faz A olarak %0.1 formik asit ve asetonitril mobil faz B'de %0.1 formik asit kullanın.
      2. Bir gradyan kullanın ve mobil faz B'yi 0,5 dakika boyunca 0,3 mL/dk akış hızıyla %40'ta tutun. Ardından, akış hızını 1 dakika içinde %100'e yükseltin, orada 2 dakika tutun ve ardından 1 dakika boyunca %40 B'ye dönün.
      3. Negatif modda çalışan elektrosprey iyonizasyonu kullanan bir kütle spektrometrik dedektörü kullanarak kolon çıkış suyunu izleyin. Aşağıdaki çoklu reaksiyon izleme (MRM) geçişlerini izlemek için spektrometreyi programlayın: S-equol için 241 → 119.1 ve dahili standart equol-d245 için 123 → 4.
      4. 5-500 ng/mL kalibrasyon aralıklarını kullanarak 1/x² ağırlıklandırma fonksiyonuna sahip ikinci dereceden bir denklem kullanarak analizin iç standarda alan oranı zirvesini kullanarak S-equol için kalibrasyon eğrisini hesaplayın.

6. MDA tedavisinin çekirdek bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkisinin ölçülmesi

NOT: Bu bölüm, MDA tedavisinden sonra çekirdek bağırsak mikrobiyota düzeylerini ölçmek için qPCR kullanımını açıklamaktadır.

1. Adım 4.5.1 ve 4.6.1'de açıklandığı gibi dışkı örneği toplama ve DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
2. Yüksek hassasiyetli algılama için bir DNA florometresi kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin. DNA örneklerini 10 ng/μL'ye normalleştirin ve kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
3. Bağırsak mikrobiyotası üyelerinin bolluğunu araştırmak için qPCR kullanın: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. ve (v) daha önce tarif edildiği gibi bakteriyel 16S rRNA geninin V6 hiperdeğişken bölgesine karşı tasarlanmış primerler kullanan toplam bakteri 20,21,22.
   NOT: Kullanılan qPCR koşulları ve primerler Tablo 2'de listelenmiştir.

Sonuçlar

MDA, fare modellerinde bakteri suşlarının oral yoldan verilmesinde kullanılabilir. C57BL / 6J fareleri, MDA eğitim seansına başlamadan önce kommensal mikrobiyal toplulukları temizlemek için 2 gün boyunca antibiyotiklerle (içme suyunda sefoxitin) tedavi edildi. Şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi, tedavi uygulamasından önce 3 gün boyunca günde bir kez ardışık olarak uygulandı. Fareler, MDA tedavisi uygulaması sırasında hafif bir t?...

Tartışmalar

OG, daha önce birden fazla çalışmada^{değerlendirildiği} gibi kafa karıştırıcı bir değişken oluşturabilen araştırma hayvanlarında önemli bir stres kaynağı olabilir 7,9,11,12,13,14,15,23. OG'nin invazivliği...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL pipette tips	Mettler Toledo	17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detector	Sciex	N/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-835D-5
Ammonium acetate	Sigma–Aldrich	5.43834
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain# 000664
C. scindens strain 35704	American Type Culture Collection	35704
Cefoxitin	Sagent	NDC25021-109-10
Corn oil	MedChemExpress	HY-Y1888
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
ethanol	Fisher Scientific	AC611050040
Formic acid	Sigma–Aldrich	5.33002
FVB/NJ mice	Jackson Laboratories	Strain# 001800
Glycerol	Sigma–Aldrich	G5516
Hexane	Fisher Scientific	02-002-996
LC-MS grade water	Fisher Scientific	14-650-357
Methanol	Fisher Scientific	02-003-340
Microtainer serum separator tube	Becton Dickinson	02-675-185
Molecular biology grade water	Corning	46-000-CI
NSG mice	Jackson Laboratories	Strain# 005557
PBS	Corning	21-031-CV
Qubit DNA HS kit	Invitrogen	Q32851
Racemic equol-d4	Santa Cruz Biotechnology	sc-219827
Reinforced Clostridial agar	Anaerobe Systems	AS-6061
Reinforced Clostridial broth	Anaerobe Systems	AS-606
S-equol	MedChemExpress	HY-100583
S-equol reference standard for LC-MS	Cayman Chemical	10010173
Single channel pipette	Rainin	17008652
Streptococcus salivarius genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-1024D-5
Sweetened condensed milk	California Farms	B09TGQ7WV8
VSL#3	VSL#3	B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatia	Sigma–Aldrich	G7017