Uso della somministrazione di farmaci guidata da micropipette come metodo alternativo alla sonda gastrica orale nei modelli di roditori

Riepilogo

Qui, descriviamo la somministrazione di farmaci guidata da micropipette (MDA) come un metodo alternativo alla sonda gastrica orale che incentiva l'animale da ricerca a ingerire prontamente i trattamenti con il minimo stress e disagio.

Abstract

La sonda orale (OG) con l'uso di una cannula collegata a una siringa è uno dei metodi più comuni utilizzati per fornire un dosaggio preciso di composti allo stomaco degli animali da ricerca. Sfortunatamente, questo metodo presenta difficoltà sia per l'operatore che per l'animale da ricerca. Gli studi hanno dimostrato che l'OG può portare a complicanze, tra cui esofagite, perforazione dell'esofago e somministrazione involontaria di farmaci tracheali. Inoltre, l'OG è associato ad un aumento dei livelli plasmatici e di corticosterone fecale (a causa dello stress), all'alterazione della pressione sanguigna e all'aumento della frequenza cardiaca, che potrebbero influenzare negativamente o influenzare i risultati dello studio. Un metodo alternativo precedentemente sviluppato, chiamato somministrazione di farmaci guidata da micropipette (MDA), incentiva l'animale a consumare prontamente i trattamenti in modo minimamente invasivo. In questo articolo, presentiamo esempi dell'uso della tecnica MDA con trattamenti ricostituiti in diversi veicoli e dimostriamo l'efficacia della somministrazione dei vari trattamenti a più ceppi di topi diversi. Dimostriamo inoltre che l'MDA è una tecnica che riduce i tempi e l'invasività della somministrazione del farmaco e non influisce sulla composizione del microbioma intestinale valutata mediante analisi quantitativa delle specie microbiche intestinali principali. Nel complesso, l'MDA può offrire un'alternativa meno stressante ed efficace all'OG.

Introduzione

La somministrazione di farmaci a modelli di roditori avviene comunemente tramite sonda orale (OG), che consiste nella somministrazione di un preparato liquido direttamente nello stomaco utilizzando una cannula collegata a una siringa contenente la soluzione. Questa tecnica si traduce in un dosaggio costante e preciso del trattamento all'animale, ma comporta anche molteplici svantaggi. OG è stato esaminato per non aver modellato adeguatamente le esposizioni alimentari umane ^1,2. Inoltre, l'OG aumenta il rischio di lesioni non intenzionali all'apparato digerente superiore (perforazione dell'esofago e dello stomaco), all'aspirazione del trattamento somministrato e alle lesioni del tratto respiratorio³. L'OG è anche associato a disagio⁴, aumento della pressione sanguigna e della frequenza cardiaca⁵, nonché stress ^6,7 e talvolta morte⁸ a causa della ridotta tolleranza al gavage da parte dell'animale. Questi cambiamenti fisiologici potrebbero interferire o confondere i risultati sperimentali; Pertanto, sono state esplorate nuove procedure per evitare questi effetti collaterali. Gli studi hanno utilizzato procedure alternative all'OG, come l'uso della gelatina come veicolo farmacologico⁹, strisce a dissoluzione orale (ODS)¹⁰, aghi per sonda gastrica rivestiti di saccarosio¹¹, tubi di alimentazione flessibili, biscotti di grano¹², miele¹³ e pellet di burro di arachidi¹⁴. Sfortunatamente, ci sono limitazioni con queste modifiche alla tecnica OG, tra cui l'incompatibilità con i farmaci insolubili in acqua, un tempo di preparazione più lungo per il trattamento¹⁵, l'appetibilità e la stabilità del farmaco¹⁵ e la familiarizzazione dell'animale con il cibo. Inoltre, c'è la possibilità di un dosaggio meno preciso quando gli animali si nutrono ad lib.

Scarborough et ^al.7 hanno precedentemente sviluppato un metodo di trattamento orale alternativo nei topi, che hanno chiamato somministrazione di farmaci guidata da micropipette (MDA). Questo metodo di somministrazione si basa su una soluzione di latte condensato zuccherato come veicolo per sostanze farmacologiche, motivando gli animali dello studio a consumare prontamente il veicolo preparato e/o le soluzioni farmacologiche dispensando la soluzione con una pipetta a canale singolo e un puntale per pipetta. Per introdurre questa tecnica, i roditori vengono sottoposti a una sessione di addestramento (minimo 2 giorni) per ridurre i tempi di manipolazione e per consentire all'animale in studio di familiarizzare con l'assunzione dal puntale della pipetta⁴. Gli studi iniziali di validazione di Scarborough et ^al.7 e Schalbetter et ^al.16 suggeriscono che la procedura MDA è facile da implementare, economica, minimamente invasiva e meno stressante per gli animali rispetto ai metodi convenzionali di gavage orale. Scarborough et al. hanno introdotto l'uso della tecnica MDA in un modello murino di attivazione immunitaria materna (MIA) dei disturbi dello sviluppo neurologico⁷. Questo studio ha dimostrato che i profili farmacocinetici dei topi trattati con il farmaco antipsicotico risperidone utilizzando MDA erano paragonabili all'uso di OG. Inoltre, l'MDA non ha indotto un aumento dei livelli di corticosterone (un ormone dello stress) nei topi e il trattamento cronico con risperidone con la tecnica MDA ha portato a una diminuzione dose-dipendente dei deficit di interazione sociale indotti da MIA e dell'ipersensibilità alle anfetamine⁷. Ulteriori studi hanno esplorato l'efficacia dell'MDA rispetto all'OG sia nel topo¹⁷ che nel ratto¹⁸ . L'MDA è stato anche confrontato con l'iniezione intraperitoneale e si è dimostrato altrettanto efficace nel somministrare clozapina-N-ossido ai topi¹⁶. A causa del successo riportato dell'MDA nel ridurre lo stress animale e l'efficacia terapeutica, ora miriamo a esplorare ulteriormente la tecnica MDA come metodo efficace di somministrazione di farmaci utilizzando ulteriori modelli murini. Qui, descriviamo l'implementazione del metodo MDA per trattare diversi ceppi di topo, inclusi i ceppi FVB/NJ e C57BL/6J immunocompromessi e il ceppo immunocompromesso NOD.Cg-Prkdc^{scid Il2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG) con diversi trattamenti orali, tra cui batteri vivi, composti sperimentali somministrati in soluzioni insolubili in acqua (olio di mais) e controlli del veicolo. Abbiamo valutato l'attività e la presenza dei diversi trattamenti nel siero e nelle feci e abbiamo valutato le alterazioni del microbiota intestinale centrale in relazione al metodo MDA.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti seguendo le linee guida istituzionali e secondo i protocolli M021M197 e M023M195 approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Johns Hopkins University. I ceppi di topi utilizzati (topi maschi, di 7 settimane) sono descritti nella Tabella dei Materiali. L'uso di topi maschi era dovuto al loro uso negli studi in corso sul cancro alla prostata. Il metodo MDA ha precedentemente dimostrato di essere efficace anche nei topi femmina ^7,17. I topi sono stati randomizzati nelle rispettive gabbie/gruppi di trattamento. I topi sono stati trattati in gabbie e senza un ordine particolare. Lo sperimentatore che somministrava i trattamenti era all'oscuro del gruppo di trattamento. Il numero assegnato a un topo si riferiva al suo ID e non all'ordine in cui veniva trattato. I dati sono stati raccolti durante tutta la durata dello studio e analizzati alla fine per evitare qualsiasi pregiudizio. I saggi sperimentali sono stati tenuti in cieco al gruppo di trattamento fino a quando non sono stati raccolti tutti i dati.

NOTA: Questo protocollo è stato modificato da Scarborough et ^al.7.

1. Preparazione dei trattamenti

1. Preparare una soluzione di latte condensato zuccherato (ingredienti: latte e zucchero) e acqua di biologia molecolare utilizzando un rapporto 3:10 tra latte e acqua. Misurare il latte condensato zuccherato utilizzando una provetta conica da 15 ml a causa della viscosità del latte.
2. Utilizzando una provetta conica da 50 ml, mescolare acqua di biologia molecolare con il latte condensato zuccherato mescolando lentamente 5 ml di acqua alla volta con il latte.
   NOTA: Questa fase viene eseguita in condizioni sterili utilizzando una cappa di biosicurezza.
3. Preparare le aliquote della soluzione di latte (conservate come aliquote da 500 μl) e conservare le aliquote a 4 °C fino a quando non si combinano con il trattamento di interesse.
4. Risospendere i trattamenti nei rispettivi veicoli alla concentrazione corretta in base al peso corporeo dell'animale prima di combinarli con la soluzione di latte condensato/acqua zuccherata.

2. Sessione di formazione MDA

NOTA: Questa sezione descrive i modelli murini; tuttavia, la tecnica MDA potrebbe essere ampliata secondo necessità con volumi/puntali per pipette più grandi per modelli di roditori più grandi.

1. FACOLTATIVO: Trattenere delicatamente l'animale in studio tenendo la collottola con una mano.
2. Offrire all'animale in studio 100 μl di soluzione di latte/acqua condensata zuccherata (senza l'aggiunta del trattamento sperimentale) utilizzando una pipetta a canale singolo e un puntale per pipetta da 200 μl che viene guidato verso la bocca.
3. Erogare lentamente la soluzione di latte/acqua per evitare di perdere la bocca dell'animale. Assicurarsi che l'animale consumi prontamente la soluzione di latte tra 5-15 secondi.
   NOTA: Questo allenamento si svolge per un minimo di 2 giorni consecutivi (una sessione di allenamento al giorno), senza modifiche al volume somministrato. Per le sessioni di formazione MDA è stata necessaria una leggera moderazione con la collottola. Scarborough et ^al.7 raccomandano la contenzione completa dell'animale il primo giorno di addestramento MDA e poi la contenzione per la coda il secondo giorno. Il metodo di contenzione può differire per i modelli di roditori più grandi. Al contrario, Vanhecke et ^al.17 hanno tenuto i topi solo leggermente per la coda durante l'addestramento.

3. Trattamenti dei topi con il metodo MDA

1. Combinare il trattamento in studio con la soluzione di latte condensato/acqua zuccherata (vedere esempi con esperimenti di convalida [sezione 4 e sezione 5] di seguito).
2. FACOLTATIVO: Trattenere delicatamente l'animale in studio tenendo la collottola con una mano.
   NOTA: Scarborough et ^al.7 riportano che i topi non hanno più bisogno di contenzione oltre il periodo di allenamento e berranno prontamente dalla punta della pipetta. Al contrario, Vanhecke et ^al.17 riportano che per alcuni trattamenti (ad esempio, il tamoxifene) che potrebbero avere una lieve avversione al gusto, l'MDA viene eseguito al meglio trattenendo delicatamente i topi tramite collottola durante tutti i trattamenti. Questo studio ha anche stabilito che posizionare l'animale sulla schiena con una collottola delicata migliora il tempo e l'efficacia del consumo del trattamento.
3. Somministrare 100 μL di trattamento utilizzando una pipetta a canale singolo e una punta da 200 μL guidata verso la bocca dell'animale, come eseguito durante le sessioni di addestramento.
4. Tratta un singolo animale alla volta.
5. Rimetti ogni animale nella rispettiva gabbia dopo il trattamento.
   NOTA: I trattamenti con il metodo MDA possono essere somministrati quotidianamente o in modo ripetuto ^7,17.

4. Esperimento di validazione #1 - somministrazione orale di batteri intestinali ai topi utilizzando MDA

NOTA: Questa sezione descrive l'uso del metodo MDA per somministrare per via orale batteri vivi per studi di colonizzazione intestinale nei topi. In questo esperimento pilota rappresentativo, il batterio gram-positivo Clostridium scindens viene somministrato ai topi C57BL/6J. I topi sono stati trattati con antibiotici (cefoxitina) per due giorni consecutivi nell'acqua potabile prima dell'inoculazione batterica con MDA.

1. Coltura batterica
   1. Coltura del ceppo ATCC 35704 di C . scindens in brodo di clostridi rinforzato (RCB) utilizzando un brodo di glicerolo congelato per inoculare 500 μL di batteri in una provetta RCB da 7 mL. Coltivare anaerobicamente durante la notte a 37 °C.
   2. Utilizzare 500 μl di coltura batterica notturna per inoculare una nuova provetta RCB e incubare anaerobicamente per 24 ore. Rimuovere questo tubo dalla camera anaerobica e utilizzarlo per preparare il trattamento batterico per l'MDA. Utilizzare questa stessa provetta per calcolare le unità formanti colonie per millilitro (CFU/mL).
2. Calcolo di C. scindens CFU/mL
   1. Creare una diluizione 1:3 della coltura di C. scindens utilizzando 3,5 mL di coltura inoculata in 7 mL di terreno RCB. Utilizzare un campione di questa diluizione per ottenere un 20% di stock di glicerolo da 1 ml (1:1) che viene conservato a -80 °C.
   2. Piastra 100 μl della diluizione 1:3 su piastre di agar clostridiale rinforzato (RCA). Utilizzare la prima diluizione per poi effettuare le successive diluizioni seriali e placcare per un totale di altre tre volte.
   3. Dopo l'incubazione delle piastre RCA, contare le colonie e calcolare i CFU. Utilizzare la seguente equazione per calcolare la concentrazione di cellule batteriche nei campioni diluiti e originali:
      CFU in campione diluito (cellule/mL) = (numero di colonie contate sulla piastra RCA)/(quantità di campione diluito aggiunta alla piastra RCA in mL)
      CFU nel campione originale (cellule/mL) = (CFU nel campione diluito)/(diluizione della piastra RCA)
3. Preparazione del trattamento con C. scindens per l'MDA
   1. Combinare una soluzione di 50 μl (1,265 x 10,⁶ CFU/mL in questo esempio) di C. scindens + 50 μl di soluzione di latte condensato/acqua zuccherata.
      NOTA: Se è necessaria una CFU specifica, è possibile utilizzare un metodo alternativo di quantificazione delle cellule batteriche, come la creazione di una curva standard con misure di densità ottica (OD) a 600 nm.
4. Trattamento orale di topi con C. scindens mediante MDA
   1. Nei giorni 1-3, familiarizzare i topi con la soluzione di latte come descritto nella sezione 2 (sessione di formazione MDA).
   2. Il giorno 4, somministrare 100 μL di C. scindens + soluzione di latte o PBS (controllo) + soluzione di latte tramite MDA a topi C57BL/6J. Trattare i topi una volta per tutta la durata dello studio.
5. Raccolta di campioni fecali
   1. Tieni il topo con una collottola delicata e attendi che scarichino un pellet fecale. Raccogliere i pellet fecali direttamente dal retto in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml. Conservare i campioni a -80 °C fino al momento dell'uso.
6. PCR quantitativa (qPCR) di C. scindens
   1. Eseguire l'estrazione del DNA fecale utilizzando un protocollo precedentemente pubblicato^19,20.
   2. Determinare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro per DNA per un rilevamento ad alta sensibilità. Normalizzare i campioni di DNA a 10 ng/μL e conservarli a -20 °C fino al momento dell'uso.
   3. Utilizzare la qPCR per studiare l'abbondanza di: (i) batteri C. scindens utilizzando primer conservati contro il gene desA del ceppo ATCC 35704 di C. scindens, (ii) batteri totali utilizzando primer progettati contro la regione ipervariabile V6 del gene batterico 16S rRNA come precedentemente descritto^20,21.
      NOTA: Le condizioni qPCR e i primer utilizzati sono elencati nella Tabella 1. Una curva standard utilizzando il DNA del ceppo ATCC 35704 di C. scindens è stata utilizzata per stimare le copie dei batteri desA+.

5. Esperimento di validazione #2 - somministrazione sperimentale di farmaci ai topi utilizzando MDA

NOTA: Questa sezione descrive l'uso del metodo MDA per somministrare un composto sperimentale ai topi. In questo esperimento pilota rappresentativo, il metabolita della soia equolo (S-equolo) viene somministrato a topi NSG e FVB/NJ.

1. Preparazione del trattamento con S-equolo
   NOTA: Sia l'S-equolo che il dimetilsolfossido (DMSO) vengono aliquotati e conservati a -20 °C fino all'uso.
   1. Ricostituire l'S-equolo in DMSO combinato con olio di mais (90%). Miscelare l'S-equolo aliquotato in olio di mais (220 μl) con 480 μl di soluzione di latte condensato/acqua zuccherata. Unire e mescolare questa soluzione nella stanza degli animali per evitare la separazione dell'olio dal latte.
      NOTA: Se si osserva la separazione della soluzione, mescolare la soluzione prima del trattamento. La dose di S-equolo somministrata è di 25 mg/kg/die. I topi utilizzati in questo studio avevano tutti un peso simile, quindi hanno ricevuto la stessa dose. Potrebbe essere necessario aggiustare la dose del trattamento e suddividerla in più preparazioni in base al peso dell'animale in studio.
   2. Combina il veicolo DMSO con l'olio di mais (90%). Miscelare il DMSO aliquotato in olio di mais (220 μl) con 480 μl della soluzione di latte condensato/acqua zuccherata. Unire e mescolare questa soluzione nella stanza degli animali per evitare la separazione dell'olio dal latte.
      NOTA: Se si osserva la separazione della soluzione, mescolare la soluzione prima del trattamento.
2. Trattamento orale di topi con S-equolo utilizzando MDA
   1. Nei giorni 1 e 2, familiarizzare i topi con la soluzione di latte come descritto nella sezione 2 (sessione di formazione MDA).
      NOTA: Per l'esperimento di convalida #1, è stato seguito il tempo di addestramento descritto in Scarborough et al., che suggeriva un tempo di acclimatazione di 3 giorni. In questo esperimento, è stato testato un tempo di allenamento più breve (2 giorni), e si è riscontrato che non alterava la somministrazione dei trattamenti di interesse.
   2. Nei giorni 3-43, trattare i topi con (i) controllo PBS, (ii) veicolo DMSO o (iii) S-equolo, il tutto combinato con la soluzione di latte condensato/acqua zuccherata. Effettuare una miscela master della soluzione per fornire una soluzione omogenea dei trattamenti a tutti gli animali dello studio. Somministrare un volume totale di 100 μl a ciascun topo una volta al giorno, 5 giorni alla settimana, per un totale di 43 giorni.
3. Prelievo di sangue
   1. Raccogliere il sangue dopo l'eutanasia (overdose di anidride carbonica) tramite puntura cardiaca. Trasferire il sangue in una provetta separatore di siero microtainer, mescolare e conservare a temperatura ambiente (RT) fino a ulteriore lavorazione.
   2. Centrifugare il campione di sangue per completare la separazione a 254 x g per 5 min. Raccogliere il siero (strato superiore di separazione) e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
4. Cromatografia liquida di S-equolo con saggio di spettrometria di massa tandem (LC/MS/MS)
   1. Fare riferimento alla tabella dei materiali file per le sostanze chimiche e i reagenti utilizzati per questo esperimento.
   2. Standard di taratura e controllo qualità: Preparare soluzioni madre di S-equolo e standard interno (equolo racemico-d4) in DMSO a concentrazioni di 1 mg/mL e conservare a -20 °C.
   3. Diluire le soluzioni standard madre con acetonitrile:acqua (50:50) per preparare una soluzione di lavoro mista con diverse concentrazioni. Preparare lo standard interno in acetato di etile come soluzione di estrazione ad una concentrazione di 100 ng/mL. Conservare le soluzioni di stoccaggio e di lavoro a 4 °C e utilizzarle quotidianamente, diluite o direttamente.
   4. Estrazione del campione
      1. Preparare il campione utilizzando la soluzione di precipitazione delle proteine mediante estrazione (acetato di etile più standard interno, cfr. punto 5.4.3), seguita dalla centrifugazione e dall'evaporazione del surnatante in azoto secco (50 °C).
      2. Ricostituire il campione in 100 μl di acetonitrile al 50% e trasferirlo in fiale dell'autocampionatore per l'analisi LC/MS/MS.
   5. Separazione dei campioni
      1. Ottenere la separazione con una colonna C18, 2,1x50 mm, 1,7 μm. Utilizzare lo 0,1% di acido formico come fase mobile A e lo 0,1% di acido formico nella fase mobile B dell'acetonitrile.
      2. Utilizzare un gradiente e mantenere la fase mobile B al 40% con una portata di 0,3 mL/min per 0,5 min. Quindi, aumentare la portata al 100% in 1 minuto, tenerla lì per 2 minuti e poi tornare al 40% B per 1 minuto.
      3. Monitorare l'effluente della colonna utilizzando un rivelatore a spettrometria di massa che utilizza la ionizzazione elettrospray, che funziona in modalità negativa. Programmare lo spettrometro per monitorare le seguenti transizioni di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM): 241 → 119,1 per l'S-equolo e 245 → 123 per lo standard interno, l'equolo-d4.
      4. Calcolare la curva di calibrazione per l'S-equolo utilizzando il picco del rapporto di area dell'analisi rispetto allo standard interno utilizzando un'equazione quadratica con una funzione di ponderazione 1/x² utilizzando gli intervalli di calibrazione di 5-500 ng/mL.

6. Misurare l'effetto del trattamento con MDA sul microbiota intestinale centrale

NOTA: Questa sezione descrive l'uso della qPCR per misurare i livelli di microbiota intestinale centrale dopo il trattamento con MDA.

1. Eseguire la raccolta del campione fecale e l'estrazione del DNA come descritto nei passaggi 4.5.1 e 4.6.1.
2. Determinare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro per DNA per un rilevamento ad alta sensibilità. Normalizzare i campioni di DNA a 10 ng/μL e conservarli a -20 °C fino al momento dell'uso.
3. Utilizzare la qPCR per studiare l'abbondanza di membri del microbiota intestinale: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. e (v) batteri totali utilizzando primer progettati contro la regione ipervariabile V6 del gene batterico 16S rRNA come precedentemente descritto 20,21,22.
   NOTA: Le condizioni qPCR e i primer utilizzati sono elencati nella Tabella 2.

Risultati

L'MDA può essere utilizzato nella somministrazione orale di ceppi batterici in modelli murini. I topi C57BL/6J sono stati trattati con antibiotici (cefoxitina nell'acqua potabile) per 2 giorni per eliminare le comunità microbiche commensali prima di iniziare la sessione di formazione MDA. La soluzione di latte/acqua condensata zuccherata è stata somministrata una volta al giorno consecutivamente per 3 giorni prima della somministrazione del trattamento. I topi sono st...

Discussione

L'OG può essere una fonte significativa di stress negli animali da ricerca che può creare una variabile confondente, come precedentemente valutato in diversi studi 7,9,11,12,13,14,15,23. A causa dell'invasività dell'OG, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL pipette tips	Mettler Toledo	17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detector	Sciex	N/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-835D-5
Ammonium acetate	Sigma–Aldrich	5.43834
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain# 000664
C. scindens strain 35704	American Type Culture Collection	35704
Cefoxitin	Sagent	NDC25021-109-10
Corn oil	MedChemExpress	HY-Y1888
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
ethanol	Fisher Scientific	AC611050040
Formic acid	Sigma–Aldrich	5.33002
FVB/NJ mice	Jackson Laboratories	Strain# 001800
Glycerol	Sigma–Aldrich	G5516
Hexane	Fisher Scientific	02-002-996
LC-MS grade water	Fisher Scientific	14-650-357
Methanol	Fisher Scientific	02-003-340
Microtainer serum separator tube	Becton Dickinson	02-675-185
Molecular biology grade water	Corning	46-000-CI
NSG mice	Jackson Laboratories	Strain# 005557
PBS	Corning	21-031-CV
Qubit DNA HS kit	Invitrogen	Q32851
Racemic equol-d4	Santa Cruz Biotechnology	sc-219827
Reinforced Clostridial agar	Anaerobe Systems	AS-6061
Reinforced Clostridial broth	Anaerobe Systems	AS-606
S-equol	MedChemExpress	HY-100583
S-equol reference standard for LC-MS	Cayman Chemical	10010173
Single channel pipette	Rainin	17008652
Streptococcus salivarius genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-1024D-5
Sweetened condensed milk	California Farms	B09TGQ7WV8
VSL#3	VSL#3	B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatia	Sigma–Aldrich	G7017