Uso de la administración de fármacos guiada por micropipetas como método alternativo a la sonda nasogástrica oral en modelos de roedores

Resumen

Aquí, describimos la administración de fármacos guiada por micropipeta (MDA) como un método alternativo a la sonda nasogástrica oral que incentiva al animal de investigación a ingerir tratamientos fácilmente con un mínimo de estrés e incomodidad.

Resumen

La sonda nasogástrica oral (OG) con el uso de una cánula conectada a una jeringa es uno de los métodos más comunes utilizados para administrar una dosis precisa de compuestos al estómago de los animales de investigación. Desafortunadamente, este método presenta dificultades tanto para el operador como para el animal de investigación. Los estudios han demostrado que la OG puede provocar complicaciones, como esofagitis, perforación del esófago y administración inadvertida de fármacos traqueales. Además, la OG se asocia con un aumento de los niveles plasmáticos y fecales de corticosterona (debido al estrés), alteración de la presión arterial y aumento de la frecuencia cardíaca, lo que podría influir negativamente o sesgar los resultados del estudio. Un método alternativo desarrollado anteriormente, denominado administración de fármacos guiada por micropipetas (MDA), incentiva al animal a consumir tratamientos fácilmente de una manera mínimamente invasiva. En este trabajo, presentamos ejemplos del uso de la técnica MDA con tratamientos reconstituidos en diferentes vehículos y demostramos la administración efectiva de los variados tratamientos a múltiples cepas de ratones diferentes. Además, demostramos que el MDA es una técnica que disminuye el momento y la invasividad de la administración de fármacos y no afecta a la composición del microbioma intestinal evaluada mediante el análisis cuantitativo de las principales especies microbianas intestinales. En general, la MDA puede ofrecer una alternativa menos estresante y eficaz a la OG.

Introducción

La administración de fármacos a modelos de roedores se realiza comúnmente a través de sonda nasogástrica oral (OG), que consiste en administrar una preparación líquida directamente en el estómago utilizando una cánula conectada a una jeringa que contiene la solución. Esta técnica da como resultado una dosificación consistente y precisa del tratamiento para el animal, pero también conlleva múltiples desventajas. La OG ha sido examinada por no modelar adecuadamente las exposiciones dietéticas humanas ^1,2. Además, la OG aumenta el riesgo de lesiones no intencionales en el sistema digestivo superior (perforación del esófago y el estómago), aspiración del tratamiento administrado y lesiones del tracto respiratorio³. La OG también se asocia con malestar⁴, aumento de la presión arterial y la frecuencia cardíaca⁵, así como estrés ^6,7 y, a veces, la muerte⁸ debido a la disminución de la tolerancia al sonda nasogástrica por parte del animal. Estos cambios fisiológicos pueden interferir o confundir los resultados experimentales; Por lo tanto, se han explorado nuevos procedimientos para evitar estos efectos secundarios. Los estudios han utilizado procedimientos alternativos a la OG, como el uso de gelatina como vehículo farmacológico⁹, tiras de disolución oral (ODS)¹⁰, agujas sonda recubiertas de sacarosa¹¹, tubos de alimentación flexibles, galletas de trigo¹², miel¹³ y gránulos de mantequilla de maní¹⁴. Desafortunadamente, existen limitaciones con estas modificaciones en la técnica OG, incluyendo la incompatibilidad con medicamentos insolubles en agua, un tiempo de preparación más largo para el tratamiento¹⁵, la palatabilidad y estabilidad del medicamento¹⁵, y la familiarización del animal con el alimento. Además, existe la posibilidad de que la dosificación sea menos precisa cuando los animales se alimentan ad libitum.

Scarborough et ^al.7 desarrollaron previamente un método alternativo de tratamiento oral en ratones, al que denominaron administración de fármacos guiada por micropipetas (MDA). Este método de administración se basa en una solución de leche condensada azucarada como vehículo de sustancias farmacológicas, lo que motiva a los animales de estudio a consumir fácilmente el vehículo preparado y/o las soluciones farmacológicas mediante la dispensación de la solución con una pipeta monocanal y una punta de pipeta. Para introducir esta técnica, los roedores se someten a una sesión de entrenamiento (mínimo 2 días) para acortar los tiempos de manipulación y permitir que el animal de estudio se familiarice con la bebida de la punta de la pipeta⁴. Los estudios iniciales de validación realizados por Scarborough et ^al.7 y Schalbetter et ^al.16 sugieren que el procedimiento MDA es fácil de implementar, rentable, mínimamente invasivo y menos estresante para los animales que los métodos convencionales de sonda nasogástrica oral. Scarborough et al. introdujeron el uso de la técnica MDA en un modelo murino de activación inmune materna (MIA) de trastornos del neurodesarrollo⁷. Este estudio demostró que los perfiles farmacocinéticos de los ratones tratados con el fármaco antipsicótico risperidona mediante MDA eran comparables al uso de OG. Además, el MDA no indujo un aumento en los niveles de corticosterona (una hormona del estrés) en los ratones, y el tratamiento crónico con risperidona utilizando la técnica de MDA condujo a una disminución dependiente de la dosis en los déficits de interacción social inducidos por MIA y la hipersensibilidad a las anfetaminas⁷. Estudios adicionales han explorado la eficacia de MDA frente a OG en modelos de ratón¹⁷ y rata¹⁸ . El MDA también se ha comparado con la inyección intraperitoneal y se ha demostrado que es igual de eficaz en la administración de N-óxido de clozapina a ratones¹⁶. Debido al éxito reportado de MDA en la reducción del estrés animal y la eficacia terapéutica, ahora buscamos explorar más a fondo la técnica de MDA como un método efectivo de administración de fármacos utilizando modelos murinos adicionales. Aquí, describimos la implementación del método MDA para tratar diferentes cepas de ratones, incluidas las cepas FVB/NJ y C57BL/6J inmunocompetentes y la cepa inmunocomprometida NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) con diferentes tratamientos orales, incluidas bacterias vivas, compuestos experimentales administrados en soluciones insolubles en agua (aceite de maíz) y controles de vehículos. Evaluamos la actividad y presencia de los diferentes tratamientos en suero y heces, y evaluamos las alteraciones de la microbiota intestinal central en relación con el método MDA.

Protocolo

Todos los estudios en animales se realizaron siguiendo las pautas institucionales y bajo los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins (IACUC, por sus siglas en inglés) M021M197 y M023M195. Las cepas de ratón utilizadas (ratones machos, de 7 semanas de edad) se describen en la Tabla de Materiales. El uso de ratones machos se debió a su uso en los estudios en curso sobre el cáncer de próstata. El método MDA ha demostrado previamente ser eficaz también en ratones hembra ^7,17. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a sus respectivas jaulas/grupos de tratamiento. Los ratones fueron tratados en jaulas y sin ningún orden en particular. El experimentador que administraba los tratamientos estaba ciego al grupo de tratamiento. El número asignado a un ratón se refería a su ID y no al orden en que fueron tratados. Los datos se recogieron a lo largo de la línea de tiempo del estudio y se analizaron al final para evitar cualquier sesgo. Los ensayos experimentales se cegaron al grupo de tratamiento hasta que se recopilaron todos los datos.

NOTA: Este protocolo ha sido modificado de Scarborough et ^al.7.

1. Preparación de los tratamientos

1. Prepare una solución de leche condensada azucarada (ingredientes: leche y azúcar) y agua de grado de biología molecular usando una proporción de 3:10 de leche a agua. Mida la leche condensada azucarada con un tubo cónico de 15 mL debido a la viscosidad de la leche.
2. Usando un tubo cónico de 50 mL, mezcle agua de grado de biología molecular con la leche condensada azucarada mezclando lentamente 5 mL de agua a la vez con la leche.
   NOTA: Este paso se realiza en condiciones estériles utilizando una cabina de bioseguridad.
3. Preparar las alícuotas de la solución láctea (almacenadas en 500 μL de alícuotas) y almacenar las alícuotas a 4 °C hasta que se combinen con el tratamiento de interés.
4. Vuelva a suspender los tratamientos en sus respectivos vehículos a la concentración correcta en función del peso corporal del animal antes de combinarlos con la solución de leche condensada/agua azucarada.

2. Sesión de formación MDA

NOTA: En esta sección se describen los modelos de ratón; sin embargo, la técnica MDA podría ampliarse según sea necesario con volúmenes/puntas de pipeta más grandes para modelos de roedores más grandes.

1. OPCIONAL: Sujete suavemente al animal de estudio sosteniendo el pescuezo con una mano.
2. Ofrecer al animal de estudio 100 μL de solución de agua y leche condensada azucarada únicamente (sin la adición del tratamiento experimental) utilizando una pipeta monocanal y una punta de pipeta de 200 μL que se guía hasta la boca.
3. Dispense la solución de leche/agua lentamente para evitar que no llegue a la boca del animal. Asegúrese de que el animal consuma fácilmente la solución láctea entre 5 y 15 s.
   NOTA: Este entrenamiento se realiza durante un mínimo de 2 días consecutivos (una sesión de entrenamiento por día), sin cambios en el volumen administrado. Se necesitó una sujeción suave por el pescuezo para las sesiones de entrenamiento de MDA. Scarborough et ^al.7 recomiendan la sujeción total del animal el primer día de entrenamiento de MDA y luego la sujeción por la cola el segundo día. El método de sujeción puede diferir para los modelos de roedores más grandes. Por el contrario, Vanhecke et ^al.17 solo sujetaron a los ratones ligeramente por la cola durante el entrenamiento.

3. Tratamientos con ratones mediante el método MDA

1. Combine el tratamiento del estudio con la solución de leche condensada azucarada/agua (véanse ejemplos con experimentos de validación [sección 4 y sección 5] a continuación).
2. OPCIONAL: Sujete suavemente al animal de estudio sosteniendo el pescuezo con una mano.
   NOTA: Scarborough et ^al.7 informan que los ratones ya no requieren restricción más allá del período de entrenamiento y beberán fácilmente de la punta de la pipeta. En contraste, Vanhecke et ^al.17 informan que para algunos tratamientos (por ejemplo, tamoxifeno) que podrían tener una leve aversión al sabor, la MDA se realiza mejor sujetando suavemente a los ratones mediante un pescuezo durante todos los tratamientos. Este estudio también determinó que colocar al animal boca arriba con un pescuezo suave mejora el tiempo y la eficacia del consumo del tratamiento.
3. Administrar 100 μL de tratamiento utilizando una pipeta monocanal y una punta de pipeta de 200 μL guiada hasta la boca del animal, tal y como se realiza durante las sesiones de entrenamiento.
4. Trata a un solo animal a la vez.
5. Vuelva a colocar a cada animal en su jaula respectiva después del tratamiento.
   NOTA: Los tratamientos con el método MDA pueden administrarse diariamente o de forma repetida ^7,17.

4. Experimento de validación #1 - administración oral de bacterias intestinales a ratones usando MDA

NOTA: Esta sección describe el uso del método MDA para administrar bacterias vivas por vía oral para estudios de colonización intestinal en ratones. En este experimento piloto representativo, la bacteria grampositiva Clostridium scindens se administra a ratones C57BL/6J. Los ratones fueron tratados con antibióticos (cefoxitina) durante dos días consecutivos en el agua potable antes de la inoculación bacteriana con MDA.

1. Cultivo bacteriano
   1. Cultivo de la cepa ATCC 35704 de C. scindens en caldo clostridial reforzado (RCB) utilizando un caldo de glicerol congelado para inocular 500 μL de bacterias en un tubo RCB de 7 mL. Crece anaeróbicamente durante la noche a 37 °C.
   2. Utilice 500 μL del cultivo de bacterias durante la noche para inocular un nuevo tubo RCB e incube anaeróbicamente durante 24 h. Retire este tubo de la cámara anaeróbica y utilícelo para preparar el tratamiento bacteriano para la MDA. Utilice este mismo tubo para calcular las unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL).
2. Cálculo de C . scindens UFC/mL
   1. Cree una dilución 1:3 del cultivo de C. scindens utilizando 3,5 mL del cultivo inoculado en 7 mL de medio RCB. Utilice una muestra de esta dilución para hacer un caldo de glicerol al 20% 1 mL (1:1) que se almacena a -80 °C.
   2. Placa de 100 μL de la dilución 1:3 en placas de agar clostridial reforzado (RCA). Utilice la primera dilución para luego hacer diluciones en serie posteriores y emplatar un total de tres veces más.
   3. Después de la incubación de las placas RCA, cuente las colonias y calcule la UFC. Utilice la siguiente ecuación para calcular la concentración de células bacterianas en las muestras diluidas y originales:
      UFC en muestra diluida (células/mL) = (número de colonias contadas en la placa RCA)/(cantidad de muestra diluida añadida a la placa RCA en mL)
      UFC en la muestra original (células/mL) = (UFC en la muestra diluida)/(dilución de la placa RCA)
3. Preparación del tratamiento de C. scindens para la MDA
   1. Combine una solución de 50 μL (1.265 x 10⁶ UFC/mL en este ejemplo) de C. scindens + 50 μL de la solución de leche condensada/agua azucarada.
      NOTA: Si se necesita una UFC específica, se puede utilizar un método alternativo de cuantificación de células bacterianas, como la creación de una curva estándar con mediciones de densidad óptica (OD) a 600 nm.
4. Tratamiento oral de ratones con C. scindens mediante MDA
   1. En los días 1-3, familiarice a los ratones con la solución láctea como se describe en la sección 2 (sesión de entrenamiento MDA).
   2. El día 4, administre 100 μL de C. scindens + solución de leche o PBS (control) + solución de leche a través de MDA a ratones C57BL/6J. Trate a los ratones una vez durante la duración del estudio.
5. Recogida de muestras fecales
   1. Sujete al ratón por un pescuezo suave y espere a que descargue una bolita fecal. Recoja los gránulos fecales directamente del recto en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml. Almacene las muestras a -80 °C hasta su uso.
6. PCR cuantitativa de C. scindens (qPCR)
   1. Realizar la extracción de ADN fecal utilizando un protocolo previamente publicado^19,20.
   2. Determine la concentración de ADN utilizando un fluorómetro de ADN para la detección de alta sensibilidad. Normalice las muestras de ADN a 10 ng/μL y almacene a -20 °C hasta su uso.
   3. Utilice la qPCR para investigar la abundancia de: (i) bacterias C. scindens utilizando cebadores conservados contra el gen desA de la cepa ATCC 35704 de C. scindens, (ii) bacterias totales utilizando cebadores diseñados contra la región hipervariable V6 del gen bacteriano 16S rRNA como se ha descrito anteriormente^20,21.
      NOTA: Las condiciones de qPCR y los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1. Se utilizó una curva estándar utilizando el ADN de la cepa ATCC 35704 de C. scindens para estimar las copias de la bacteria desA+.

5. Experimento de validación #2 - administración experimental de fármacos a ratones utilizando MDA

NOTA: Esta sección describe el uso del método MDA para administrar un compuesto experimental a ratones. En este experimento piloto representativo, el metabolito de soja equol (S-equol) se administra a ratones NSG y FVB/NJ.

1. Preparación del tratamiento con S-equol
   NOTA: Tanto el S-equol como el dimetilsulfóxido (DMSO) se alícutras y se almacenan a -20 °C hasta su uso.
   1. Reconstituir S-equol en DMSO combinado con aceite de maíz (90%). Mezcle S-equol alícuota en aceite de maíz (220 μL) con 480 μL de la solución de leche condensada/agua azucarada. Combine y mezcle esta solución en la habitación del animal para evitar la separación del aceite de la leche.
      NOTA: Si se observa la separación de la solución, mezcle la solución antes del tratamiento. La dosis de S-equol administrada es de 25 mg/kg/día. Los ratones utilizados en este estudio tenían un peso similar, por lo que recibieron la misma dosis. Es posible que sea necesario ajustar la dosis del tratamiento y convertirla en múltiples preparaciones en función del peso de los animales del estudio.
   2. Combine el vehículo DMSO con aceite de maíz (90%). Mezcle DMSO alícuota en aceite de maíz (220 μL) con 480 μL de la solución de leche condensada/agua azucarada. Combine y mezcle esta solución en la habitación del animal para evitar la separación del aceite de la leche.
      NOTA: Si se observa la separación de la solución, mezcle la solución antes del tratamiento.
2. Tratamiento oral de ratones con S-equol mediante MDA
   1. En los días 1 y 2, familiarice a los ratones con la solución láctea como se describe en la sección 2 (sesión de entrenamiento MDA).
      NOTA: Para el experimento de validación #1, se siguió el tiempo de entrenamiento descrito en Scarborough et al., lo que sugirió un tiempo de aclimatación de 3 días. En este experimento, se probó un tiempo de entrenamiento más corto (2 días), y se encontró que no alteraba la administración de los tratamientos de interés.
   2. En los días 3 a 43, trate a los ratones con (i) control de PBS, (ii) vehículo DMSO o (iii) S-equol, todo combinado con la solución de leche condensada/agua azucarada. Hacer una mezcla maestra de la solución para entregar una solución homogénea de los tratamientos a todos los animales de estudio. Administrar un volumen total de 100 μL a cada ratón una vez al día, 5 días a la semana, durante un total de 43 días.
3. Extracción de sangre
   1. Recolectar sangre después de la eutanasia (sobredosis de dióxido de carbono) a través de una punción cardíaca. Transfiera la sangre a un tubo separador de suero microtainer, mezcle y almacene a temperatura ambiente (RT) hasta su posterior procesamiento.
   2. Centrifugar la muestra de sangre hasta completar la separación a 254 x g durante 5 min. Recoja el suero (capa superior de separación) y guárdelo a -20 °C hasta su uso.
4. Cromatografía líquida S-equol con ensayo de espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS)
   1. Consulte el archivo de la Tabla de Materiales para conocer los productos químicos y reactivos utilizados para este experimento.
   2. Patrones de calibración y control de calidad: Preparar soluciones madre de S-equol y patrón interno (equol racémico-d4) en DMSO a concentraciones de 1 mg/mL y almacenar a -20 °C.
   3. Diluir las soluciones patrón madre con acetonitrilo:agua (50:50) para preparar una solución de trabajo mixta con diferentes concentraciones. Prepare el patrón interno en acetato de etilo como solución de extracción a una concentración de 100 ng/mL. Almacene el caldo y las soluciones de trabajo a 4 °C y utilícelo a diario, diluido o directamente.
   4. Extracción de muestras
      1. Preparar la muestra utilizando precipitación de proteínas por solución de extracción (acetato de etilo más patrón interno, ver sección 5.4.3), seguida de centrifugación y evaporación del sobrenadante bajo nitrógeno seco (50 °C).
      2. Reconstituya la muestra en 100 μL de acetonitrilo al 50% y transfiérala a viales de muestreador automático para el análisis LC/MS/MS.
   5. Separación de muestras
      1. Logre la separación con una columna C18, 2,1x50 mm, 1,7 μm. Utilice ácido fórmico al 0,1% como fase móvil A y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo fase móvil B.
      2. Utilice un gradiente y mantenga la fase móvil B al 40% con un caudal de 0,3 mL/min durante 0,5 min. Luego, aumente el caudal al 100% durante 1 minuto, manténgalo allí durante 2 minutos y luego vuelva al 40% B durante 1 minuto.
      3. Monitoree el efluente de la columna usando un detector de espectrometría de masas que usa ionización por electrospray, que está operando en modo negativo. Programe el espectrómetro para monitorear las siguientes transiciones de monitoreo de reacción múltiple (MRM): 241 → 119.1 para S-equol y 245 → 123 para el estándar interno, equol-d4.
      4. Calcule la curva de calibración para S-equol utilizando el pico de la relación de área del análisis con el estándar interno utilizando una ecuación cuadrática con una función de ponderación de 1/x² utilizando los rangos de calibración de 5-500 ng/mL.

6. Medición del efecto del tratamiento con MDA en la microbiota intestinal central

NOTA: En esta sección se describe el uso de la qPCR para medir los niveles de microbiota intestinal central después del tratamiento con MDA.

1. Realice la recolección de muestras fecales y la extracción de ADN como se describe en los pasos 4.5.1 y 4.6.1.
2. Determine la concentración de ADN utilizando un fluorómetro de ADN para la detección de alta sensibilidad. Normalice las muestras de ADN a 10 ng/μL y almacene a -20 °C hasta su uso.
3. Utilice la qPCR para investigar la abundancia de miembros de la microbiota intestinal: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. y (v) bacterias totales utilizando cebadores diseñados contra la región hipervariable V6 del gen de ARNr bacteriano 16S descrito anteriormente 20,21,22.
   NOTA: Las condiciones de qPCR y los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 2.

Resultados

El MDA se puede utilizar en la administración oral de cepas bacterianas en modelos de ratón. Los ratones C57BL/6J fueron tratados con antibióticos (cefoxitina en el agua potable) durante 2 días para eliminar las comunidades microbianas comensales antes de comenzar la sesión de entrenamiento de MDA. La solución de leche condensada/agua azucarada se administró una vez al día consecutivamente durante 3 días antes de la administración del tratamiento. Los ratones f...

Discusión

La OG puede ser una fuente significativa de estrés en animales de investigación que puede crear una variable de confusión, como se evaluó previamente en múltiples estudios 7,9,11,12,13,14,15,23. Debido a la invasividad...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL pipette tips	Mettler Toledo	17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detector	Sciex	N/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-835D-5
Ammonium acetate	Sigma–Aldrich	5.43834
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain# 000664
C. scindens strain 35704	American Type Culture Collection	35704
Cefoxitin	Sagent	NDC25021-109-10
Corn oil	MedChemExpress	HY-Y1888
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
ethanol	Fisher Scientific	AC611050040
Formic acid	Sigma–Aldrich	5.33002
FVB/NJ mice	Jackson Laboratories	Strain# 001800
Glycerol	Sigma–Aldrich	G5516
Hexane	Fisher Scientific	02-002-996
LC-MS grade water	Fisher Scientific	14-650-357
Methanol	Fisher Scientific	02-003-340
Microtainer serum separator tube	Becton Dickinson	02-675-185
Molecular biology grade water	Corning	46-000-CI
NSG mice	Jackson Laboratories	Strain# 005557
PBS	Corning	21-031-CV
Qubit DNA HS kit	Invitrogen	Q32851
Racemic equol-d4	Santa Cruz Biotechnology	sc-219827
Reinforced Clostridial agar	Anaerobe Systems	AS-6061
Reinforced Clostridial broth	Anaerobe Systems	AS-606
S-equol	MedChemExpress	HY-100583
S-equol reference standard for LC-MS	Cayman Chemical	10010173
Single channel pipette	Rainin	17008652
Streptococcus salivarius genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-1024D-5
Sweetened condensed milk	California Farms	B09TGQ7WV8
VSL#3	VSL#3	B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatia	Sigma–Aldrich	G7017