설치류 모델에서 구강 배게이지에 대한 대체 방법으로 마이크로피펫 유도 약물 투여 사용

요약

여기에서는 연구 동물이 최소한의 스트레스와 불편함으로 치료제를 쉽게 섭취하도록 장려하는 구강 배당의 대체 방법으로 마이크로피펫 유도 약물 투여(MDA)를 설명합니다.

초록

주사기에 부착된 캐뉼라를 사용하는 구강 위(OG)는 연구 동물의 위에 화합물을 정밀하게 투여하는 데 사용되는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 불행히도 이 방법은 작업자와 연구 동물 모두에게 어려움을 안겨줍니다. 연구에 따르면 OG는 식도염, 식도 천공, 부주의한 기관 약물 투여 등의 합병증을 유발할 수 있습니다. 또한 OG는 혈장 및 분변 코르티코스테론 수치 증가(스트레스로 인한), 혈압 변화 및 심박수 증가와 관련이 있으며, 이는 연구 결과에 부정적인 영향을 미치거나 편향될 수 있습니다. 이전에 개발된 마이크로피펫 유도 약물 투여(MDA)라는 대체 방법은 동물이 최소 침습적 방식으로 치료제를 즉시 섭취하도록 장려합니다. 본 명세서에서는 서로 다른 비히클에서 재구성한 처리와 함께 MDA 기법을 사용하는 예를 제시하고 여러 다른 마우스 균주에 다양한 처리물을 효과적으로 전달하는 것을 보여줍니다. 또한 MDA가 약물 투여의 시기와 침습성을 감소시키고 핵심 장내 미생물 종의 정량적 분석으로 평가된 장내 마이크로바이옴 구성에 영향을 미치지 않는 기술임을 입증합니다. 전반적으로 MDA는 OG에 대한 스트레스가 적고 효과적인 대안을 제공할 수 있습니다.

서문

설치류 모델에 대한 약물 투여는 일반적으로 구강 위(OG)를 통해 이루어지며, 이는 용액이 들어 있는 주사기에 부착된 캐뉼라를 사용하여 위에 액체 제제를 직접 투여하는 것으로 구성됩니다. 이 기술은 동물에게 일관되고 정확한 투여량을 제공하지만 여러 가지 단점도 있습니다. OG는 인간의 식이 노출을 적절하게 모델링하지 않은 것에 대해 면밀히 조사되었습니다 ^1,2. 또한, OG는 상부 소화계의 의도하지 않은 손상(식도와 위의 천공), 투여 치료의 흡인, 호흡기 병변의 위험을 증가시킨다³. OG는 또한 불편함⁴, 혈압 및 심박수 증가^{5, 스트레스6,7},^{때로는 동물의} 배설에 대한 내성 감소로 인한 사망8과 관련이 있다. 이러한 생리학적 변화는 실험 결과를 방해하거나 혼란스럽게 할 수 있습니다. 따라서 이러한 부작용을 피하기 위해 새로운 절차가 연구되었습니다. 연구에서는 젤라틴을^{약물 매개체}9로 사용, 구강 용해 스트립(ODS)¹⁰, 자당으로 코팅된 가비지 바늘(gavage needles)¹¹, 유연한 공급 튜브, 밀 쿠키(wheat cookies)¹², 꿀(^honey)13, 땅콩버터 펠릿(peanut butter pellets⁾¹⁴과 같은 OG의 대체 절차를 활용했다. 불행히도, OG 기법에 대한 이러한 수정에는 수불용성 약물과의 비호환성, 처리를 위한 긴 준비 시간¹⁵, 약물 기호성 및 안정성¹⁵, 동물이 식품에 익숙해지는 등의 한계가 있습니다. 또한, 동물이 즉석에서 먹이를 줄 때 덜 정확한 투여가 발생할 가능성이 있습니다.

Scarborough 등⁷ 은 이전에 생쥐를 대상으로 한 대체 경구 치료 방법을 개발했는데, 이를 마이크로피펫 유도 약물 투여(MDA)라고 명명했습니다. 이 투여 방법은 약리학적 물질의 매개체로서 가당 연유 용액을 기반으로 하며, 연구 동물이 단일 채널 피펫 및 피펫 팁으로 용액을 분주하여 준비된 비히클 및/또는 약물 용액을 즉시 소비하도록 동기를 부여합니다. 이 기술을 소개하기 위해 설치류는 취급 시간을 단축하고 연구 동물이 피펫 팁⁴에서 마시는 것에 익숙해질 수 있도록 교육 세션(최소 2일)을 받습니다. Scarborough 등⁷ 및 Schalbetter 등¹⁶ 의 초기 검증 연구는 MDA 절차가 기존의 경구 위장 방법보다 구현하기 쉽고, 비용 효율적이며, 최소 침습적이고, 동물에게 스트레스가 적다는 것을 시사합니다. Scarborough 등은 신경 발달 장애의 모계 면역 활성화(MIA)에 대한 마우스 모델에서 MDA 기술의 사용을 소개했습니다⁷. 이 연구는 MDA를 사용하여 항정신병 약물 리스페리돈으로 치료받은 마우스의 약동학 프로파일이 OG의 사용과 유사하다는 것을 입증했습니다. 또한, MDA는 생쥐의 코르티코스테론(스트레스 호르몬) 수치 증가를 유도하지 않았으며, MDA 기법을 사용한 리스페리돈 만성 치료는 MIA로 인한 사회적 상호작용 결핍 및 암페타민 과민증의 용량 의존적 감소로 이어졌다⁷. 추가 연구에서는 마우스¹⁷ 및 랫트¹⁸ 모델 모두에서 MDA와 OG의 효능을 조사했습니다. MDA는 또한 복강내 주사와 비교되었으며 클로자핀-N-옥사이드를 마우스에 전달하는 데 효과적인 것으로 나타났습니다¹⁶. MDA가 동물 스트레스를 줄이고 치료 효능을 성공적으로 보인 것으로 보고됨에 따라, 이제 추가 쥐 모델을 사용하여 효과적인 약물 전달 방법으로서 MDA 기술을 더 자세히 탐구하는 것을 목표로 합니다. 여기에서는 살아있는 박테리아, 불용성 용액(옥수수 기름)으로 전달되는 실험 화합물 및 차량 대조군을 포함한 다양한 경구 치료제로 면역 기능이 저하된 FVB/NJ 및 C57BL/6J 균주와 면역 저하 NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG) 균주를 포함한 다양한 마우스 균주를 치료하기 위한 MDA 방법의 구현에 대해 설명합니다. 혈청과 대변에서 다양한 치료법의 활성과 존재를 평가하고, MDA 방법과 관련하여 핵심 장내 미생물총(core gut microbiota)에 대한 변화를 평가했습니다.

프로토콜

모든 동물 연구는 기관 지침에 따라 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 프로토콜 M021M197 및 M023M195에 따라 수행되었습니다. 사용 된 마우스 균주 (수컷 마우스, 7 주령)는 재료 표에 설명되어 있습니다. 수컷 마우스의 사용은 전립선 암의 진행중인 연구에 사용되었기 때문입니다. MDA 방법은 이전에 암컷 마우스에서도 효과적인 것으로 나타났습니다 ^7,17. 마우스는 각각의 케이지/치료 그룹에 무작위 배정되었습니다. 쥐는 케이지에서 특별한 순서 없이 처리되었습니다. 치료를 시행한 실험자는 치료 그룹에 대해 눈이 멀었습니다. 쥐에게 할당된 숫자는 치료된 순서가 아니라 ID를 나타냅니다. 데이터는 연구 타임라인 전반에 걸쳐 수집되었으며 편향을 피하기 위해 마지막에 분석되었습니다. 실험적 분석은 모든 데이터가 수집될 때까지 치료 그룹에 대해 맹검되었습니다.

참고: 이 프로토콜은 Scarborough et ^al.7에서 수정되었습니다.

1. 트리트먼트 준비

1. 가당 연유(성분: 우유와 설탕)와 분자생물학 등급의 물을 우유와 물의 3:10 비율로 준비합니다. 우유의 점도로 인해 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 가당 연유를 측정합니다.
2. 50mL 원뿔형 튜브를 사용하여 한 번에 5mL의 물을 우유와 천천히 혼합하여 분자 생물학 등급의 물과 가당 연유를 혼합합니다.
   참고: 이 단계는 생물 안전 작업대를 사용하여 멸균 상태에서 수행됩니다.
3. 우유 용액의 부분 표본(500μL 분취액으로 보관)을 준비하고 관심 처리와 결합될 때까지 부분 표본을 4°C에서 보관합니다.
4. 가당 연유/물 용액과 결합하기 전에 동물의 체중에 따라 올바른 농도로 각각의 차량에 트리트먼트를 다시 부유시킵니다.

2. MDA 교육 세션

참고: 이 섹션에서는 마우스 모델에 대해 설명합니다. 그러나 MDA 기법은 더 큰 설치류 모델의 경우 더 큰 부피/피펫 팁을 사용하여 필요에 따라 확장할 수 있습니다.

1. 선택 사항: 한 손으로 목덜미를 잡고 연구 동물을 부드럽게 제지합니다.
2. 단일 채널 피펫과 입으로 안내되는 200μL 피펫 팁을 사용하여 100μL의 가당 연유/물 용액만(실험적 처리를 추가하지 않음) 연구 동물에게 제공합니다.
3. 동물의 입을 놓치지 않도록 우유/물 용액을 천천히 분배하십시오. 동물이 5-15초 사이에 우유 용액을 쉽게 섭취하도록 합니다.
   참고: 이 교육은 최소 연속 2일(하루에 한 번의 교육 세션) 동안 진행되며 관리되는 볼륨에는 변화가 없습니다. MDA 훈련 세션을 위해 목덜미를 통한 부드러운 제지가 필요했습니다. Scarborough et ^al.7 은 MDA 훈련 첫날에는 동물을 완전히 제지하고 두 번째 날에는 꼬리로 제지할 것을 권장한다. 억제 방법은 더 큰 설치류 모델에 따라 다를 수 있습니다. 대조적으로, Vanhecke 등^[17 ]은 훈련 중에 쥐의 꼬리를 약간만 잡고 있었다.

3. MDA 공법을 이용한 마우스 치료

1. 연구 처리를 가당 연유/물 용액과 결합합니다(아래 검증 실험[섹션 4 및 섹션 5]의 예 참조).
2. 선택 사항: 한 손으로 목덜미를 잡고 연구 동물을 부드럽게 제지합니다.
   참고: Scarborough et ^al.7 은 생쥐가 훈련 기간 이후에는 더 이상 제지가 필요하지 않으며 피펫 팁으로 쉽게 마실 수 있다고 보고합니다. 이와는 대조적으로, Vanhecke 등^[17 ]은 가벼운 미각 혐오감을 유발할 수 있는 일부 치료법(예: 타목시펜)의 경우, 모든 치료 중에 목덜미를 통해 마우스를 부드럽게 제지하는 것이 가장 좋다고 보고했다. 이 연구는 또한 동물을 부드럽게 목덜미로 등에 눕히는 것이 치료 소비의 시간과 효능을 향상시킨다는 것을 확인했습니다.
3. 훈련 세션 중에 수행된 것처럼 단일 채널 피펫과 동물의 입으로 안내되는 200μL 피펫 팁을 사용하여 100μL의 치료를 시행합니다.
4. 한 번에 한 마리의 동물을 치료하십시오.
5. 치료 후 각 동물을 각각의 우리에 다시 넣으십시오.
   참고: MDA 방법을 사용한 치료는 매일 또는 반복적으로 투여할 수 있다 ^7,17.

4. 검증 실험 #1 - MDA를 이용한 장내 세균을 마우스에 경구 투여

참고: 이 섹션에서는 마우스의 장내 집락화 연구를 위해 살아있는 박테리아를 경구로 전달하기 위한 MDA 방법의 사용에 대해 설명합니다. 이 대표적인 파일럿 실험에서는 그람 양성 박테리아인 클로스트리듐 신든스(Clostridium scindens) 를 C57BL/6J 마우스에 전달합니다. 마우스는 MDA로 박테리아를 접종하기 전에 식수에서 이틀 연속 항생제(세폭시틴)를 투여했습니다.

1. 박테리아 배양
   1. 배양 C. scindens는 냉동 글리세롤 스톡을 사용하여 강화 클로스트리듐 브로스(RCB)에서 ATCC 35704 균주를 균주하여 500μL의 박테리아를 7mL RCB 튜브에 접종합니다. 37 °C에서 밤새 혐기성으로 자랍니다.
   2. 500μL의 야간 박테리아 배양을 사용하여 새로운 RCB 튜브를 접종하고 24시간 동안 혐기성으로 배양합니다. 혐기성 챔버에서 이 튜브를 제거하고 MDA에 대한 박테리아 처리를 준비하는 데 사용합니다. 이 동일한 튜브를 사용하여 밀리리터당 집락 형성 단위(CFU/mL)를 계산합니다.
2. C. scindens CFU/mL 계산
   1. 7mL의 RCB 배지에 접종된 3.5mL의 배양물을 사용하여 C. scindens 배양액을 1:3 희석합니다. 이 희석액의 샘플을 사용하여 -80°C에서 보관되는 20% 1mL 글리세롤 스톡(1:1)을 만듭니다.
   2. 100 μL의 1:3 희석액을 강화 클로스트리디알 한천(RCA) 플레이트에 플레이트합니다. 첫 번째 희석액을 사용하여 후속 연속 희석을 만들고 총 3회 더 플레이트를 만듭니다.
   3. RCA 플레이트를 배양한 후 콜로니를 세고 CFU를 계산합니다. 다음 방정식을 사용하여 희석된 샘플과 원본 샘플의 박테리아 세포 농도를 계산합니다.
      희석된 샘플의 CFU(cells/mL) = (RCA 플레이트에 계산된 콜로니 수)/(RCA 플레이트에 첨가된 희석된 샘플의 양(mL))
      원본 샘플의 CFU(cells/mL) = (희석된 샘플의 CFU)/(RCA 플레이트의 희석량)
3. MDA에 대한 C. scindens 치료 준비
   1. 50 μL(이 예에서는 1.265 x 10⁶ CFU/mL) + 50 μL의 C. scindens + 50 μL의 가당 연유/물 용액을 결합합니다.
      참고: 특정 CFU가 필요한 경우 600nm에서 광학 밀도(OD) 측정으로 표준 곡선을 생성하는 것과 같은 박테리아 세포 정량화의 대체 방법을 사용할 수 있습니다.
4. MDA를 이용한 C. scindens를 이용한 마우스의 경구치료
   1. 1-3일째에는 섹션 2(MDA 교육 세션)에 설명된 대로 마우스가 우유 용액에 익숙해지도록 합니다.
   2. 4일차에 MDA를 통해 C. scindens + 우유 용액 또는 PBS(대조군) + 우유 용액 100μL를 C57BL/6J 마우스에 투여합니다. 연구 기간 동안 생쥐를 한 번 치료하십시오.
5. 배설물 샘플 수집
   1. 쥐를 부드럽게 목덜미로 잡고 배설물 알갱이가 배출될 때까지 기다립니다. 직장에서 직접 대변 펠릿을 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 수집합니다. 샘플을 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
6. C. scindens 정량적 PCR(qPCR)
   1. 이전에 발표된 프로토콜^19,20을 사용하여 대변 DNA 추출을 수행합니다.
   2. 고감도 검출을 위해 DNA 형광측정기를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. DNA 샘플을 10ng/μL로 정규화하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
   3. qPCR을 사용하여 (i) C. scindens 균주 ATCC 35704의 desA 유전자에 대해 보존된 프라이머를 사용하는 C. scindens 박테리아, (ii) 앞서 설명한 바와 같이 박테리아 16S rRNA 유전자의 V6 초가변 영역에 대해 설계된 프라이머를 사용하는 총 박테리아^20,21.
      참고: 사용된 qPCR 조건 및 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다. C. scindens 균주 ATCC 35704 DNA를 사용하는 표준 곡선을 사용하여 desA+ 박테리아의 사본을 추정했습니다.

5. 검증 실험 #2 - MDA를 이용한 실험용 약물 투여

참고: 이 섹션에서는 MDA 방법을 사용하여 실험용 화합물을 마우스에 전달하는 방법에 대해 설명합니다. 이 대표적인 파일럿 실험에서는 대두 대사산물 에퀄(S-equol)을 NSG 및 FVB/NJ 마우스에 전달합니다.

1. S-equol 치료제의 준비
   참고: S-equol과 dimethyl sulfoxide(DMSO)는 모두 분주되어 사용할 때까지 -20°C에서 보관됩니다.
   1. 옥수수 기름과 결합된 DMSO에서 S-equol을 재구성합니다(90%). 옥수수 기름(220 μL)에 분주된 S-equol을 480 μL의 가당 연유/물 용액과 혼합합니다. 우유에서 기름이 분리되는 것을 피하기 위해 동물실에서 이 용액을 결합하고 혼합하십시오.
      알림: 용액의 분리가 관찰되면 처리 전에 용액을 혼합하십시오. 투여되는 S-equol의 용량은 25mg/kg/day입니다. 이 연구에 사용된 쥐는 모두 체중이 비슷했기 때문에 동일한 용량을 투여받았습니다. 치료 용량을 조정하고 연구 동물 체중에 따라 여러 제제로 만들어야 할 수도 있습니다.
   2. DMSO 차량과 옥수수 기름(90%)을 결합하십시오. 옥수수 기름(220μL)에 분주된 DMSO를 480μL의 가당 연유/물 용액과 혼합합니다. 우유에서 기름이 분리되는 것을 피하기 위해 동물실에서 이 용액을 결합하고 혼합하십시오.
      알림: 용액의 분리가 관찰되면 처리 전에 용액을 혼합하십시오.
2. MDA를 이용한 S-equol을 이용한 마우스의 경구투여
   1. 1일차와 2일차에는 섹션 2(MDA 교육 세션)에 설명된 대로 마우스가 우유 용액에 익숙해지도록 합니다.
      참고: 검증 실험 #1의 경우, Scarborough et al.에 기술된 훈련 시간을 따랐으며, 이는 3일의 적응 시간을 제안했습니다. 이 실험에서는 더 짧은 훈련 시간(2일)을 테스트한 결과 관심 있는 치료법의 투여를 변경하지 않는 것으로 나타났습니다.
   2. 3-43일째에 (i) PBS 대조군, (ii) DMSO 비히클 또는 (iii) S-equol을 모두 가당 연유/물 용액과 결합하여 마우스에 투여합니다. 용액의 마스터 믹스를 만들어 모든 연구 동물에게 균질한 처리 용액을 제공합니다. 각 마우스에 하루에 한 번, 일주일에 5일, 총 43일 동안 총 100μL씩 투여합니다.
3. 혈액 채취
   1. 안락사(이산화탄소 과다 복용) 후 심장 천자를 통해 혈액을 채취합니다. 혈액을 마이크로테이너 혈청 분리기 튜브로 옮기고 혼합한 후 추가 처리가 있을 때까지 실온(RT)에서 보관합니다.
   2. 254 x g 에서 5분 동안 완전 분리를 위한 원심분리기 혈액 샘플. 혈청(분리의 최상층)을 모아 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
4. 탠덤 질량분석법을 사용한 S-equol 액체 크로마토그래피(LC/MS/MS) 분석
   1. 이 실험에 사용된 화학 물질 및 시약에 대해서는 재료 표 파일을 참조하십시오.
   2. 교정 표준 및 품질 관리: S-equol 및 내부 표준(racemic equol-d4)의 원액을 1 mg/mL 농도로 DMSO에 준비하고 -20 °C에서 보관합니다.
   3. 스톡 표준 용액을 아세토니트릴:물(50:50)로 희석하여 농도가 다른 혼합 작업 용액을 준비합니다. 추출 용액으로 에틸 아세테이트의 내부 표준물을 100ng/mL 농도로 준비합니다. 재고 및 작업 용액을 4 °C에서 보관하고 매일, 희석 또는 직접 사용하십시오.
   4. 시료 추출
      1. 추출 용액(에틸 아세테이트 및 내부 표준물질, 섹션 5.4.3 참조)에 의한 단백질 침전을 사용하여 샘플을 준비한 다음 건조 질소(50°C) 하에서 상층액을 원심분리 및 증발합니다.
      2. 100μL의 50% 아세토니트릴로 시료를 재구성하고 LC/MS/MS 분석을 위해 오토샘플러 바이알로 옮깁니다.
   5. 시료 분리
      1. C18 컬럼, 2.1x50mm, 1.7μm로 분리를 달성합니다. 0.1% 포름산을 이동상 A로 사용하고 아세토니트릴 이동상 B에서 0.1% 포름산을 사용합니다.
      2. 그래디언트를 사용하고 0.5분 동안 0.3mL/분의 유속으로 이동상 B를 40%로 유지합니다. 그런 다음 1분 동안 유속을 100%로 높이고 2분 동안 유지한 다음 40분 동안 1% B로 돌아갑니다.
      3. 네거티브 모드에서 작동하는 전기 분무 이온화를 사용하는 질량 분광 검출기를 사용하여 컬럼 유출물을 모니터링합니다. 다음 다중 반응 모니터링(MRM) 전이를 모니터링하도록 분광계를 프로그래밍합니다: S-equol의 경우 241 → 119.1, 내부 표준물질인 equol-d4의 경우 245 → 123.
      4. 5-500ng/mL의 검량 범위를 사용하여 1/x² 가중치 기능이 있는 2차 방정식을 사용하여 내부 표준물질에 대한 분석의 면적 비율 피크를 사용하여 S-equol에 대한 검량선을 계산합니다.

6. MDA 치료가 핵심 장내 미생물총(Core Gut microbiota)에 미치는 영향 측정

참고: 이 섹션에서는 qPCR을 사용하여 MDA 처리 후 핵심 장내 미생물군 수준을 측정하는 방법에 대해 설명합니다.

1. 4.5.1 및 4.6.1 단계에 설명된 대로 대변 샘플 수집 및 DNA 추출을 수행합니다.
2. 고감도 검출을 위해 DNA 형광측정기를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. DNA 샘플을 10ng/μL로 정규화하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
3. qPCR을 사용하여 장내 미생물총((microbiota)의 구성원의 풍부함을 조사합니다: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. 및 (v) 앞서 설명한 바와 같이 박테리아 16S rRNA 유전자의 V6 초가변 영역에 대해 설계된 프라이머를 사용하여 총 박테리아 20,21,22.
   참고: 사용된 qPCR 조건 및 프라이머는 표 2에 나열되어 있습니다.

결과

MDA는 마우스 모델에서 박테리아 균주의 경구 전달에 사용할 수 있습니다. C57BL/6J 마우스는 MDA 교육 세션을 시작하기 전에 공생 미생물 군집을 제거하기 위해 2일 동안 항생제(음용수 내 세폭시틴)를 투여했습니다. 가당 연유/물 용액을 처리 투여 전 3일 동안 매일 1회 연속으로 투여하였다. 마우스는 MDA 치료 투여 중 부드러운 목덜미에 의해 잠시 제지되었습니?...

토론

OG는 이전에 여러 연구에서 평가된 바와 같이 혼란스러운 변수를 생성할 수 있는 연구 동물의 중요한 스트레스 원인이 될 수 있습니다 7,9,11,12,13,14,15,23. OG의 침?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL pipette tips	Mettler Toledo	17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detector	Sciex	N/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-835D-5
Ammonium acetate	Sigma–Aldrich	5.43834
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain# 000664
C. scindens strain 35704	American Type Culture Collection	35704
Cefoxitin	Sagent	NDC25021-109-10
Corn oil	MedChemExpress	HY-Y1888
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
ethanol	Fisher Scientific	AC611050040
Formic acid	Sigma–Aldrich	5.33002
FVB/NJ mice	Jackson Laboratories	Strain# 001800
Glycerol	Sigma–Aldrich	G5516
Hexane	Fisher Scientific	02-002-996
LC-MS grade water	Fisher Scientific	14-650-357
Methanol	Fisher Scientific	02-003-340
Microtainer serum separator tube	Becton Dickinson	02-675-185
Molecular biology grade water	Corning	46-000-CI
NSG mice	Jackson Laboratories	Strain# 005557
PBS	Corning	21-031-CV
Qubit DNA HS kit	Invitrogen	Q32851
Racemic equol-d4	Santa Cruz Biotechnology	sc-219827
Reinforced Clostridial agar	Anaerobe Systems	AS-6061
Reinforced Clostridial broth	Anaerobe Systems	AS-606
S-equol	MedChemExpress	HY-100583
S-equol reference standard for LC-MS	Cayman Chemical	10010173
Single channel pipette	Rainin	17008652
Streptococcus salivarius genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-1024D-5
Sweetened condensed milk	California Farms	B09TGQ7WV8
VSL#3	VSL#3	B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatia	Sigma–Aldrich	G7017