Verwendung der Mikropipetten-gesteuerten Verabreichung von Medikamenten als alternative Methode zur oralen Sonde in Nagetiermodellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die mikropipettengesteuerte Arzneimittelverabreichung (MDA) als eine alternative Methode zur oralen Sonde, die das Versuchstier dazu anregt, Behandlungen ohne weiteres und mit minimalem Stress und Unbehagen einzunehmen.

Zusammenfassung

Die orale Sonde (OG) mit Hilfe einer Kanüle, die an einer Spritze befestigt wird, ist eine der gebräuchlichsten Methoden, um dem Magen von Versuchstieren eine präzise Dosierung von Verbindungen zu verabreichen. Leider ist diese Methode sowohl für den Bediener als auch für das Versuchstier mit Schwierigkeiten verbunden. Studien haben gezeigt, dass OG zu Komplikationen führen kann, einschließlich Ösophagitis, Perforation der Speiseröhre und versehentlicher Verabreichung eines trachealen Arzneimittels. Darüber hinaus ist OG mit erhöhten Plasma- und fäkalen Corticosteronspiegeln (aufgrund von Stress), verändertem Blutdruck und erhöhter Herzfrequenz verbunden, was die Studienergebnisse negativ beeinflussen oder verzerren könnte. Eine zuvor entwickelte alternative Methode, die als Mikropipetten-gesteuerte Arzneimittelverabreichung (MDA) bezeichnet wird, bietet dem Tier einen Anreiz, Behandlungen auf minimal-invasive Weise bereitwillig zu konsumieren. Darin präsentieren wir Beispiele für die Anwendung der MDA-Technik mit Behandlungen, die in verschiedenen Vehikeln rekonstituiert wurden, und demonstrieren die effektive Verabreichung der verschiedenen Behandlungen an mehrere verschiedene Mausstämme. Wir zeigen ferner, dass MDA eine Technik ist, die den Zeitpunkt und die Invasivität der Arzneimittelverabreichung verringert und die Zusammensetzung des Darmmikrobioms nicht beeinflusst, wie sie durch quantitative Analyse der wichtigsten mikrobiellen Darmspezies beurteilt wird. Insgesamt kann MDA eine weniger belastende und effektive Alternative zu OG bieten.

Einleitung

Die Verabreichung von Medikamenten an Nagetiermodelle wird üblicherweise über eine orale Sonde (OG) erreicht, die darin besteht, ein flüssiges Präparat direkt in den Magen zu verabreichen, wobei eine Kanüle verwendet wird, die an einer Spritze befestigt ist, die die Lösung enthält. Diese Technik führt zu einer gleichmäßigen und präzisen Dosierung der Behandlung auf das Tier, bringt aber auch mehrere Nachteile mit sich. OG wurde unter die Lupe genommen, weil es die ernährungsbedingte Exposition des Menschen nicht angemessen modelliert^{hat 1,2}. Darüber hinaus erhöht OG das Risiko unbeabsichtigter Verletzungen des oberen Verdauungssystems (Perforation der Speiseröhre und des Magens), der Aspiration der verabreichten Behandlung und von Läsionen der Atemwege³. OG ist auch mit Beschwerden⁴, erhöhtem Blutdruck und erhöhter Herzfrequenz⁵ sowie Stress ^6,7 und manchmal Tod⁸ aufgrund einer verminderten Toleranz des Tieres gegenüber der Sonde verbunden. Diese physiologischen Veränderungen können experimentelle Ergebnisse beeinträchtigen oder verwirren; Daher wurden neue Verfahren erforscht, um diese Nebenwirkungen zu vermeiden. In Studien wurden alternative Verfahren zu OG verwendet, wie z. B. die Verwendung von Gelatine als Arzneimittelvehikel⁹, oral auflösende Streifen (ODS)¹⁰, mit Saccharose beschichtete Sondennadeln¹¹, flexible Ernährungssonden, Weizenkekse¹², Honig¹³ und Erdnussbutterpellets¹⁴. Leider gibt es bei diesen Modifikationen der OG-Technik Einschränkungen, einschließlich der Unverträglichkeit mit wasserunlöslichen Arzneimitteln, einer längeren Vorbereitungszeit für die Behandlung¹⁵, der Schmackhaftigkeit und Stabilität des Arzneimittels¹⁵ und der Eingewöhnung des Tieres an das Futter. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit einer weniger genauen Dosierung, wenn Tiere nach Belieben füttern.

Scarborough et ^al.7 hatten zuvor eine alternative orale Behandlungsmethode bei Mäusen entwickelt, die sie als Mikropipetten-gesteuerte Arzneimittelverabreichung (MDA) bezeichneten. Diese Verabreichungsmethode basiert auf einer gesüßten Kondensmilchlösung als Vehikel für pharmakologische Substanzen, wodurch die Versuchstiere motiviert werden, das vorbereitete Vehikel und/oder die Arzneimittellösungen bereitwillig zu konsumieren, indem die Lösung mit einer Einkanalpipette und einer Pipettenspitze abgegeben wird. Um diese Technik einzuführen, durchlaufen die Nagetiere eine Schulung (mindestens 2 Tage), um die Handhabungszeiten zu verkürzen und dem Versuchstier zu ermöglichen, sich mit dem Trinken aus der Pipettenspitze⁴ vertraut zu machen. Erste Validierungsstudien von Scarborough et ^al.7 und Schalbetter et ^al.16 deuten darauf hin, dass das MDA-Verfahren einfach umzusetzen, kostengünstig, minimalinvasiv und für die Tiere weniger belastend ist als herkömmliche orale Sondenverfahren. Scarborough et al. führten die Verwendung der MDA-Technik in einem Mausmodell der mütterlichen Immunaktivierung (MIA) von neurologischen Entwicklungsstörungen^{ein 7}. Diese Studie zeigte, dass die pharmakokinetischen Profile von Mäusen, die mit dem Antipsychotikum Risperidon unter MDA behandelt wurden, mit der Anwendung von OG vergleichbar waren. Darüber hinaus induzierte MDA bei den Mäusen keinen Anstieg des Corticosteronspiegels (ein Stresshormon), und eine chronische Behandlung mit Risperidon unter Verwendung der MDA-Technik führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der MIA-induzierten Defizite bei der sozialen Interaktion und der Amphetamin-Überempfindlichkeit⁷. Weitere Studien haben die Wirksamkeit von MDA gegenüber OG sowohl in^Maus-17- als auch in^{Ratten-18-Modellen} untersucht. MDA wurde auch mit intraperitonealer Injektion verglichen und es wurde gezeigt, dass es bei der Abgabe von Clozapin-N-oxid an Mäuse genauso wirksam ist¹⁶. Aufgrund des berichteten Erfolgs von MDA bei der Reduzierung von Tierstress und der therapeutischen Wirksamkeit wollen wir nun die MDA-Technik als effektive Methode zur Wirkstoffverabreichung mit zusätzlichen Mausmodellen weiter erforschen. Hier beschreiben wir die Implementierung der MDA-Methode zur Behandlung verschiedener Mausstämme, einschließlich der immunkompetenten FVB/NJ- und C57BL/6J-Stämme und des immungeschwächten NOD.Cg-Prkdc-scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG)-Stammes mit verschiedenen oralen Behandlungen, einschließlich lebender Bakterien, experimenteller Verbindungen, die in wasserunlöslichen Lösungen (Maisöl) verabreicht werden, und Vehikelkontrollen. Wir bewerteten die Aktivität und das Vorhandensein der verschiedenen Behandlungen im Serum und im Stuhl und wir bewerteten Veränderungen der Darmkernmikrobiota in Bezug auf die MDA-Methode.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien und im Rahmen der vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigten Protokolle M021M197 und M023M195 durchgeführt. Die verwendeten Mausstämme (männliche Mäuse, 7 Wochen alt) sind in der Materialtabelle beschrieben. Die Verwendung männlicher Mäuse war auf ihre Verwendung in den laufenden Studien zu Prostatakrebs zurückzuführen. Die MDA-Methode hat sich bereits auch bei weiblichen Mäusen als wirksam erwiesen ^7,17. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in ihre jeweiligen Käfige/Behandlungsgruppen eingeteilt. Die Mäuse wurden in Käfigen und in keiner bestimmten Reihenfolge behandelt. Der Experimentator, der die Behandlungen verabreichte, war für die Behandlungsgruppe verblindet. Die Nummer, die einer Maus zugewiesen wurde, bezog sich auf ihre ID und nicht auf die Reihenfolge, in der sie behandelt wurde. Die Daten wurden über den gesamten Zeitraum der Studie gesammelt und am Ende analysiert, um Verzerrungen zu vermeiden. Experimentelle Assays wurden für die Behandlungsgruppe verblindet, bis alle Daten gesammelt waren.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Scarborough et ^al.7 modifiziert.

1. Vorbereitung der Behandlungen

1. Bereiten Sie eine Lösung aus gesüßter Kondensmilch (Zutaten: Milch und Zucker) und molekularbiologischem Wasser mit einem Verhältnis von Milch zu Wasser von 3:10 vor. Messen Sie die gezuckerte Kondensmilch aufgrund der Viskosität der Milch mit einem konischen 15-ml-Röhrchen.
2. Mischen Sie mit einem konischen 50-ml-Röhrchen Wasser in molekularbiologischer Qualität mit der gesüßten Kondensmilch, indem Sie langsam jeweils 5 ml Wasser mit der Milch mischen.
   HINWEIS: Dieser Schritt wird unter sterilen Bedingungen mit einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt.
3. Bereiten Sie Aliquote der Milchlösung vor (gelagert als 500 μl Aliquote) und lagern Sie die Aliquote bei 4 °C, bis sie mit der betreffenden Behandlung kombiniert sind.
4. Resuspendieren Sie die Behandlungen in den jeweiligen Vehikeln in der richtigen Konzentration, die auf dem Körpergewicht des Tieres basiert, bevor Sie sie mit der gezuckerten Kondensmilch-Wasser-Lösung kombinieren.

2. MDA-Schulung

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden Mausmodelle beschrieben. Die MDA-Technik könnte jedoch bei Bedarf mit größeren Volumina/Pipettenspitzen für größere Nagetiermodelle skaliert werden.

1. OPTIONAL: Halten Sie das Versuchstier vorsichtig fest, indem Sie mit einer Hand den Nacken festhalten.
2. Geben Sie dem Versuchstier nur 100 μl gesüßte Kondensmilch/Wasser-Lösung (ohne Zusatz der experimentellen Behandlung) mit einer Einkanalpipette und einer 200 μl Pipettenspitze, die zum Mund geführt wird.
3. Geben Sie die Milch-Wasser-Lösung langsam ab, um das Maul des Tieres nicht zu übersehen. Stellen Sie sicher, dass das Tier die Milchlösung zwischen 5 und 15 s bereitwillig aufnimmt.
   HINWEIS: Diese Schulung findet an mindestens 2 aufeinanderfolgenden Tagen (eine Schulungssitzung pro Tag) statt, ohne dass sich das verabreichte Volumen ändert. Eine sanfte Zurückhaltung durch Scruff war für die MDA-Trainingseinheiten erforderlich. Scarborough et ^al.7 empfehlen, das Tier am ersten Tag des MDA-Trainings vollständig zu fixieren und dann am zweiten Tag am Schwanz zu fixieren. Die Methode der Fixierung kann bei größeren Nagetiermodellen unterschiedlich sein. Im Gegensatz dazu hielten Vanhecke et ^al.17 die Mäuse während des Trainings nur leicht am Schwanz.

3. Behandlungen von Mäusen mit der MDA-Methode

1. Kombinieren Sie die Studienbehandlung mit der gesüßten Kondensmilch-Wasser-Lösung (siehe Beispiele mit Validierungsexperimenten [Abschnitt 4 und Abschnitt 5] unten).
2. OPTIONAL: Halten Sie das Versuchstier vorsichtig fest, indem Sie mit einer Hand den Nacken festhalten.
   HINWEIS: Scarborough et ^al.7 berichten, dass Mäuse nach der Trainingszeit keine Fixierung mehr benötigen und bereitwillig aus der Pipettenspitze trinken. Im Gegensatz dazu berichten Vanhecke et ^al.17 , dass bei einigen Behandlungen (z. B. Tamoxifen), die eine leichte Geschmacksaversion hervorrufen können, MDA am besten durchgeführt wird, indem die Mäuse während aller Behandlungen sanft über den Schopf zurückgehalten werden. Diese Studie ergab auch, dass die Positionierung des Tieres auf dem Rücken mit sanftem Genick die Zeit und Wirksamkeit der Behandlung verbessert.
3. Verabreichen Sie 100 μl Behandlung mit einer Einkanalpipette und einer 200 μl Pipettenspitze, die zum Maul des Tieres geführt wird, wie während der Trainingseinheiten.
4. Behandeln Sie jeweils ein einzelnes Tier.
5. Setzen Sie jedes Tier nach der Behandlung wieder in seinen jeweiligen Käfig ein.
   HINWEIS: Behandlungen mit der MDA-Methode können täglich oder wiederholt durchgeführt werden ^7,17.

4. Validierungsexperiment #1 - Orale Verabreichung von Darmbakterien an Mäuse mit MDA

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Verwendung der MDA-Methode zur oralen Verabreichung lebender Bakterien für Darmbesiedlungsstudien bei Mäusen beschrieben. In diesem repräsentativen Pilotversuch wird das grampositive Bakterium Clostridium scindens an C57BL/6J-Mäuse abgegeben. Die Mäuse wurden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit Antibiotika (Cefoxitin) im Trinkwasser behandelt, bevor sie bakteriell mit MDA inokuliert wurden.

1. Bakterienkultur
   1. Kultur C. scindens Stamm ATCC 35704 in verstärkter Clostridienbouillon (RCB) unter Verwendung eines gefrorenen Glycerinstamms, um 500 μl Bakterien in ein 7 mL RCB-Röhrchen zu impfen. Anbau anaerob über Nacht bei 37 °C.
   2. Verwenden Sie 500 μl der Bakterienkultur über Nacht, um ein neues RCB-Röhrchen zu inokulieren und 24 Stunden lang anaerob zu inkubieren. Nehmen Sie dieses Röhrchen aus der anaeroben Kammer und verwenden Sie es, um die bakterielle Behandlung von MDA vorzubereiten. Verwenden Sie dasselbe Röhrchen, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) zu berechnen.
2. Berechnung von C. scindens KBE/ml
   1. Erstellen Sie eine 1:3-Verdünnung der C. scindens-Kultur , indem Sie 3,5 ml der Kultur verwenden, die in 7 ml RCB-Medium inokuliert wurden. Verwenden Sie eine Probe dieser Verdünnung, um eine 20%ige 1 mL Glycerinbrühe (1:1) herzustellen, die bei -80 °C gelagert wird.
   2. Platte 100 μl der 1:3-Verdünnung auf verstärkte Clostridienagar (RCA)-Platten. Verwenden Sie die erste Verdünnung, um dann weitere serielle Verdünnungen durchzuführen und insgesamt drei weitere Male zu plattieren.
   3. Nach der Inkubation der RCA-Platten werden die Kolonien gezählt und die KBE berechnet. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Konzentration von Bakterienzellen in der verdünnten und der ursprünglichen Probe zu berechnen:
      KBE in verdünnter Probe (Zellen/ml) = (Anzahl der auf der RCA-Platte gezählten Kolonien)/(Menge der verdünnten Probe, die der RCA-Platte zugesetzt wurde, in ml)
      KBE in der Originalprobe (Zellen/ml) = (KBE in verdünnter Probe)/(Verdünnung der RCA-Platte)
3. Vorbereitung der Behandlung von MDA mit C. scindens
   1. Kombinieren Sie eine Lösung von 50 μl (in diesem Beispiel 1,265 x 10⁶ KBE/ml) C. scindens + 50 μl der gezuckerten Kondensmilch-Wasser-Lösung.
      HINWEIS: Wenn eine bestimmte KBE benötigt wird, kann eine alternative Methode zur Quantifizierung von Bakterienzellen verwendet werden, z. B. die Erstellung einer Standardkurve mit Messungen der optischen Dichte (OD) bei 600 nm.
4. Orale Behandlung von Mäusen mit C. scindens unter Verwendung von MDA
   1. Machen Sie die Mäuse an den Tagen 1-3 mit der Milchlösung vertraut, wie in Abschnitt 2 (MDA-Trainingseinheit) beschrieben.
   2. An Tag 4 werden C57BL/6J-Mäusen 100 μl C . scindens + Milchlösung oder PBS (Kontrolle) + Milchlösung über MDA verabreicht. Behandeln Sie Mäuse einmal für die Dauer der Studie.
5. Entnahme von Kotproben
   1. Halten Sie die Maus sanft an den Schopf und warten Sie, bis sie ein Kotpellet abgibt. Sammeln Sie Kotpellets direkt aus dem Rektum in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei -80 °C.
6. C. scindens quantitative PCR (qPCR)
   1. Durchführung der Stuhl-DNA-Extraktion unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten Protokolls^19,20.
   2. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem DNA-Fluorometer für eine hochempfindliche Detektion. DNA-Proben auf 10 ng/μl normalisieren und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
   3. Verwenden Sie qPCR, um die Abundanz von: (i) C. scindens-Bakterien unter Verwendung konservierter Primer gegen das desA-Gen des C. scindens-Stammes ATCC 35704 zu untersuchen, (ii) Gesamtbakterien mit Primern, die gegen die hypervariable V6-Region des bakteriellen 16S-rRNA-Gens entwickelt wurden, wie zuvor beschrieben^20,21.
      HINWEIS: Die verwendeten qPCR-Bedingungen und Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Eine Standardkurve mit DNA des C . scindens-Stamms ATCC 35704 wurde verwendet, um die Kopien von desA+-Bakterien zu schätzen.

5. Validierungsexperiment #2 - Experimentelle Verabreichung von Medikamenten an Mäuse mit MDA

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Verwendung der MDA-Methode zur Verabreichung einer experimentellen Verbindung an Mäuse beschrieben. In diesem repräsentativen Pilotversuch wird der Sojametabolit Equol (S-Equol) an NSG- und FVB/NJ-Mäuse abgegeben.

1. Vorbereitung der S-Equol-Behandlung
   HINWEIS: Sowohl S-Equol als auch Dimethylsulfoxid (DMSO) werden aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
   1. Rekonstituieren Sie S-Equol in DMSO in Kombination mit Maisöl (90%). Aliquotiertes S-Equol in Maisöl (220 μl) mit 480 μl der gezuckerten Kondensmilch-Wasser-Lösung mischen. Kombinieren und mischen Sie diese Lösung im Tierzimmer, um eine Trennung des Öls von der Milch zu vermeiden.
      HINWEIS: Wenn eine Trennung der Lösung beobachtet wird, mischen Sie die Lösung vor der Behandlung. Die verabreichte Dosis von S-Equol beträgt 25 mg/kg/Tag. Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, waren alle ähnlich schwer, so dass sie die gleiche Dosis erhielten. Die Dosis der Behandlung muss möglicherweise angepasst und in mehrere Präparate umgewandelt werden, die auf dem Gewicht der Studientiere basieren.
   2. Kombinieren Sie das DMSO-Fahrzeug mit Maisöl (90%). Aliquotiertes DMSO in Maisöl (220 μl) mit 480 μl der gezuckerten Kondensmilch-Wasser-Lösung mischen. Kombinieren und mischen Sie diese Lösung im Tierzimmer, um eine Trennung des Öls von der Milch zu vermeiden.
      HINWEIS: Wenn eine Trennung der Lösung beobachtet wird, mischen Sie die Lösung vor der Behandlung.
2. Orale Behandlung von Mäusen mit S-Equol mit MDA
   1. Machen Sie die Mäuse an den Tagen 1 und 2 mit der Milchlösung vertraut, wie in Abschnitt 2 (MDA-Schulung) beschrieben.
      HINWEIS: Für das Validierungsexperiment #1 wurde die in Scarborough et al. beschriebene Trainingszeit befolgt, was auf eine 3-tägige Akklimatisierungszeit hindeutete. In diesem Experiment wurde eine kürzere Trainingszeit (2 Tage) getestet und es wurde festgestellt, dass sie die Verabreichung der interessierenden Behandlungen nicht veränderte.
   2. Behandeln Sie Mäuse an den Tagen 3 bis 43 mit (i) PBS-Kontrolle, (ii) DMSO-Vehikel oder (iii) S-Equol, alles in Kombination mit der gesüßten Kondensmilch/Wasser-Lösung. Machen Sie einen Mastermix der Lösung, um allen Versuchstieren eine homogene Lösung der Behandlungen zu liefern. Verabreichen Sie jeder Maus einmal täglich an 5 Tagen in der Woche ein Gesamtvolumen von 100 μl für insgesamt 43 Tage.
3. Blutentnahme
   1. Blutentnahme nach Euthanasie (Kohlendioxid-Überdosis) mittels Herzpunktion. Übertragen Sie das Blut in ein Microtainer-Serum-Separatorröhrchen, mischen Sie es und lagern Sie es bis zur weiteren Verarbeitung bei Raumtemperatur (RT).
   2. Zentrifugieren Sie die Blutprobe bis zur vollständigen Trennung bei 254 x g für 5 Minuten. Serum (oberste Trennschicht) auffangen und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
4. S-Ecol-Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) Assay
   1. In der Materialtabelle finden Sie die Chemikalien und Reagenzien, die für dieses Experiment verwendet wurden.
   2. Kalibrierstandards und Qualitätskontrolle: Stammlösungen aus S-Equol und internem Standard (racemisches Equol-d4) in DMSO in Konzentrationen von 1 mg/ml herstellen und bei -20 °C lagern.
   3. Die Standardlösungen werden mit Acetonitril:Wasser (50:50) verdünnt, um eine gemischte Arbeitslösung mit unterschiedlichen Konzentrationen herzustellen. Bereiten Sie den internen Standard in Ethylacetat als Extraktionslösung in einer Konzentration von 100 ng/ml vor. Vorrats- und Arbeitslösungen bei 4 °C lagern und täglich, verdünnt oder direkt anwenden.
   4. Extraktion von Proben
      1. Die Probe wird durch Proteinfällung in Form einer Extraktionslösung (Ethylacetat plus interner Standard, siehe Abschnitt 5.4.3) vorbereitet, gefolgt von einer Zentrifugation und Verdampfung des Überstands unter trockenem Stickstoff (50 °C).
      2. Rekonstituieren Sie die Probe in 100 μl 50 % Acetonitril und überführen Sie sie für die LC/MS/MS-Analyse in Autosampler-Fläschchen.
   5. Probentrennung
      1. Die Trennung wird mit einer C18-Säule, 2,1 x 50 mm, 1,7 μm erreicht. Verwenden Sie 0,1 % Ameisensäure als mobile Phase A und 0,1 % Ameisensäure in der mobilen Acetonitril-Phase B.
      2. Verwenden Sie einen Gradienten und halten Sie die mobile Phase B bei 40 % mit einer Flussrate von 0,3 mL/min für 0,5 min. Erhöhen Sie dann die Durchflussrate über 1 min auf 100 %, halten Sie sie dort für 2 min und kehren Sie dann für 1 min auf 40 % B zurück.
      3. Überwachen Sie das Säulenabwasser mit einem massenspektrometrischen Detektor mit Elektrospray-Ionisation, der im negativen Modus arbeitet. Programmieren Sie das Spektrometer so, dass es die folgenden MRM-Übergänge (Multiple Reaction Monitoring) überwacht: 241 → 119.1 für S-Equol und 245 → 123 für den internen Standard equol-d4.
      4. Berechnen Sie die Kalibrierkurve für S-Equol unter Verwendung des Flächenverhältnis-Peaks der Analyse zum internen Standard unter Verwendung einer quadratischen Gleichung mit einer 1/x 2-Gewichtungsfunktion unter Verwendung der Kalibrierbereiche von 5-500 ng/ml.

6. Messung der Wirkung der MDA-Behandlung auf die Darmmikrobiota

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Verwendung von qPCR zur Messung des Niveaus der Darmmikrobiota nach einer MDA-Behandlung beschrieben.

1. Führen Sie die Entnahme von Stuhlproben und die DNA-Extraktion durch, wie in den Schritten 4.5.1 und 4.6.1 beschrieben.
2. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem DNA-Fluorometer für eine hochempfindliche Detektion. DNA-Proben auf 10 ng/μl normalisieren und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
3. Verwenden Sie qPCR, um die Häufigkeit von Mitgliedern der Darmmikrobiota zu untersuchen: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. und (v) Gesamtbakterien unter Verwendung von Primern, die gegen die hypervariable V6-Region des bakteriellen 16S rRNA-Gens entwickelt wurden, wie zuvor beschrieben 20,21,22.
   HINWEIS: Die verwendeten qPCR-Bedingungen und Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Ergebnisse

MDA kann bei der oralen Verabreichung von Bakterienstämmen in Mausmodellen verwendet werden. C57BL/6J-Mäuse wurden 2 Tage lang mit Antibiotika (Cefoxitin im Trinkwasser) behandelt, um kommensale mikrobielle Gemeinschaften zu beseitigen, bevor sie mit der MDA-Trainingseinheit begannen. Die gesüßte Kondensmilch/Wasser-Lösung wurde vor der Verabreichung der Behandlung 3 Tage lang einmal täglich nacheinander verabreicht. Die Mäuse wurden während der MDA-Behandlung ku...

Diskussion

OG kann bei Versuchstieren eine signifikante Stressquelle sein, die eine Störvariable erzeugen kann, wie zuvor in mehreren Studien untersucht wurde 7,9,11,12,13,14,15,23. Aufgrund der Invasivität von OG wurden alternative...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL pipette tips	Mettler Toledo	17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detector	Sciex	N/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-835D-5
Ammonium acetate	Sigma–Aldrich	5.43834
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain# 000664
C. scindens strain 35704	American Type Culture Collection	35704
Cefoxitin	Sagent	NDC25021-109-10
Corn oil	MedChemExpress	HY-Y1888
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
ethanol	Fisher Scientific	AC611050040
Formic acid	Sigma–Aldrich	5.33002
FVB/NJ mice	Jackson Laboratories	Strain# 001800
Glycerol	Sigma–Aldrich	G5516
Hexane	Fisher Scientific	02-002-996
LC-MS grade water	Fisher Scientific	14-650-357
Methanol	Fisher Scientific	02-003-340
Microtainer serum separator tube	Becton Dickinson	02-675-185
Molecular biology grade water	Corning	46-000-CI
NSG mice	Jackson Laboratories	Strain# 005557
PBS	Corning	21-031-CV
Qubit DNA HS kit	Invitrogen	Q32851
Racemic equol-d4	Santa Cruz Biotechnology	sc-219827
Reinforced Clostridial agar	Anaerobe Systems	AS-6061
Reinforced Clostridial broth	Anaerobe Systems	AS-606
S-equol	MedChemExpress	HY-100583
S-equol reference standard for LC-MS	Cayman Chemical	10010173
Single channel pipette	Rainin	17008652
Streptococcus salivarius genomic DNA	American Type Culture Collection	BAA-1024D-5
Sweetened condensed milk	California Farms	B09TGQ7WV8
VSL#3	VSL#3	B07WX1LVHL
β-glucuronidase from Helix pomatia	Sigma–Aldrich	G7017