استراتيجيات تقييم السلوكيات الشبيهة بالتوحد في الفئران

Summary

نماذج القوارض هي أدوات قيمة لدراسة السلوكيات الأساسية المتعلقة باضطراب طيف التوحد (ASD). في هذه المقالة ، نوضح اختبارين سلوكيين لنمذجة السمات الأساسية لاضطراب طيف التوحد في الفئران: الاستمالة الذاتية ، التي تقيم السلوك المتكرر ، واختبار التفاعل الاجتماعي المكون من ثلاث غرف ، والذي يوثق الإعاقات الاجتماعية.

Abstract

اضطراب طيف التوحد (ASD) هو حالة معقدة من الناحية العصبية وبيولوجيا مع مسببات وراثية غير متجانسة. سريريا ، يتم تشخيص اضطراب طيف التوحد من خلال ضعف التواصل الاجتماعي والسلوكيات التقييدية أو المتكررة ، مثل رفرفة اليد أو اصطفاف الأشياء. يمكن ملاحظة هذه الأنماط السلوكية بشكل موثوق في نماذج الفئران ذات الطفرات الجينية المرتبطة باضطراب طيف التوحد ، مما يجعلها أدوات مفيدة للغاية لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية في ASD. إن فهم كيفية تأثير التغيرات الجينية على البيولوجيا العصبية والسلوكيات التي لوحظت في اضطراب طيف التوحد سيسهل تطوير مركبات علاجية مستهدفة جديدة لتحسين الإعاقات السلوكية الأساسية. استخدم مختبرنا العديد من البروتوكولات التي تشمل إجراءات التدريب والاختبار الموصوفة جيدا والتي تعكس مجموعة واسعة من العجز السلوكي المتعلق باضطراب طيف التوحد. هنا ، نقوم بتفصيل مقياسين لدراسة السمات الأساسية لاضطراب طيف التوحد في نماذج الفئران: الاستمالة الذاتية (مقياس للسلوك المتكرر) واختبار التفاعل الاجتماعي المكون من ثلاث غرف (مقياس لنهج التفاعل الاجتماعي وتفضيل الحداثة الاجتماعية).

Introduction

اضطراب طيف التوحد (ASD) هو اضطراب دماغي في النمو يظهر ضعف التواصل الاجتماعي أو التفاعل وأنماط مقيدة ومتكررة من السلوكيات أو الاهتمامات^1،2. في عام 2022 ، تم تشخيص ما يقرب من 1 من كل 100 طفل باضطراب طيف التوحد على مستوى^{العالم 3}. وفقا لمراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، زاد انتشار اضطراب طيف التوحد بنسبة 30٪ منذ عام 2008 وارتفع بأكثر من ضعفين منذ عام 2000 ^4,5. قد يظهر الأفراد المصابون باضطراب طيف التوحد أيضا مراضات مشتركة ، مثل الإعاقة الذهنية (ID) (35.2٪ ، معدل الذكاء ≤ 70) ، واضطراب نقص الانتباه / فرط النشاط (ADHD) (50٪ -70٪) ، والمتلازمات الوراثية الأخرى^2،4،6.

قدم استخدام النماذج الحيوانية في أبحاث ASD ، وخاصة القوارض ، رؤى مهمة حول تأثير العوامل البيئية المختلفة ، بما في ذلك النظام الغذائي والأدوية والتمارين الرياضية والإثراء^7،8،9،10 ، بالإضافة إلى الطفرات الجينية مثل Shank و Fmr1 و Mecp2 و Pten و Tsc mutant^11،12،13 ، على أعراض اضطراب طيف التوحد. تستخدم نماذج الفئران بشكل شائع للتحقيق في اضطراب طيف التوحد نظرا لطبيعتها الاجتماعية وسماتها الجينية والكيميائية الحيوية والفيزيولوجية الكهربية المشتركة مع البشر. على سبيل المثال ، عن طريق حذف جين معين (مثل Shank3 و Fmr1 و Cntnap2 و Pten) ، يمكن تلخيص السلوكيات الاجتماعية والمتكررة الشاذة ، مما يوفر صلاحية قوية للدراسة^14،15،16. هنا ، نقدم بروتوكولات لدراسة أوجه التشابه بين النماذج الوراثية الحيوانية وأعراض اضطراب طيف التوحد البشري¹⁷. نصف اختبار الاستمالة الذاتية والتفاعل الاجتماعي المكون من ثلاث غرف ، والتي تعكس عرضين أساسيين لدى مرضى ASD ، وهما أنماط السلوك المقيدة والمتكررة وضعف التفاعل الاجتماعي (التواصل) ، على التوالي.

استنادا إلى DSM-V (الدليل التشخيصي والإحصائي للاضطرابات العقلية للجمعية الأمريكية للطب النفسي الطبعة الخامسة) و ICD-11 (التصنيف الدولي للأمراض المراجعة الحادية عشرة) ، ينخرط مرضى اضطراب طيف التوحد في أنماط سلوكية مقيدة ومتكررة ونمطية ، على وجه الخصوص ، السلوكيات المتكررة غير الوظيفية التي تركز على الجسم (BFRBs) ، مثل التأرجح ، أو التحفيز ، أو قضم الأظافر ، أو نتف الشعر ، أو قطف الجلد ، أو المشي على أصابع^{القدم 18 ، 19}. في ، يتجلى السلوك المتكرر من خلال الاستمالة الذاتية لفترات طويلة والمتكررة. الاستمالة هي واحدة من أكثر الأنشطة الفطرية شيوعا بين القوارض ، حيث يقضي ما يقرب من 40٪ من وقت الاستيقاظ في الاستمالة^20،21. من الغريزي أن تلعق الفئران جلدها أو فرائها لإزالة الأوساخ الغريبة من سطح الجسم ، مما يعمل على الحفاظ على نظافة الجسم ، ومنع الإصابة ، وإزالة الطفيليات ، وتنظيم درجة الحرارة. يتم تصنيف الاستمالة إلى نوعين: الاستمالة الاجتماعية (الاستمالة الوراثية) ، والتي تتضمن الاستمالة بواسطة فأر آخر ، والاستمالة الذاتية. يظهر الاستمالة الذاتية نمط تسلسل نمطي ومحفوظ يتكون من أربع مراحل (معظمها منفصلة وغير متسلسلة)^22،23. في المرحلة الأولى (السكتة الدماغية الإهليلجية) ، تبدأ الفئران في الاستمالة عن طريق لعق كلا الكفوف أولا ثم الاستمالة حول الأنف بمخالبها. في المرحلة الثانية (السكتة الدماغية أحادية الجانب) ، تستخدم الفئران أقدامها لمسح وجهها بشكل غير متماثل. في المرحلة الثالثة (السكتة الدماغية الثنائية) ، تمسح الفئران رؤوسها وآذانها بشكل متماثل. في المرحلة الرابعة (لعق الجسم) ، تنتقل الفئران إلى لعق الجسم عن طريق تحريك رأسها للخلف وقد تمتد إلى الذيل والأعضاء التناسلية. عندما يتم وضع الفئران بشكل فردي في قفص شفاف ، يمكن التعرف بسهولة على سلوك الاستمالة الذاتية وملاحظته. تزيد الفئران من سلوك الاستمالة الذاتية عند مواجهة الإجهاد أو الألم أو الاضطراب الاجتماعي ، مما يجعل اختبار الاستمالة الذاتية حاسما عند البحث عن الاضطرابات العصبية²². أظهرت نماذج الفئران المختلفة لاضطراب طيف التوحد ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على طفرات جينية (مثل Fmr1^{− / y} و Shank3B^{− / -} و NL1^{− / −}) ، والتدخلات الدوائية (مثل DO34 ، PolyI: C) ، وسلالات فطرية محددة (مثل BTBR و C58 / J) ، سلوك الاستمالة الذاتية المتكرر^{المفرط 24،25،26،27}.

تعمل التغيرات في السلوك الاجتماعي كأحد معايير تقييم اضطراب طيف التوحد. وفقا ل DSM-V و ICD-11 ، يظهر مرضى ASD ضعف مستمر في التواصل الاجتماعي والتفاعل الاجتماعي^18،19. قد تظهر هذه في عجز التواصل اللفظي وغير اللفظي (أي الاتصال البصري غير الطبيعي والإيماءات وتعبيرات الوجه) ، أو عدم مشاركة الاهتمام والعواطف مع الآخرين ، أو عدم الوعي بالإشارات السياقية الاجتماعية ، أو صعوبات تطوير العلاقات. تماشيا مع أعراض الإعاقة الاجتماعية ، تم تصميم العديد من المهام السلوكية وتحسينها لتقييم التفاعلات الاجتماعية في الفئران ، مثل اختبار التفاعل الاجتماعي المباشر ، والنهج الاجتماعي المكون من ثلاث غرف وتفضيل اختبار الجدة الاجتماعية ، وتحليل الأصوات بالموجات فوق الصوتية (USVs) ^16،28. اختبار التفاعل الاجتماعي المكون من ثلاث غرف هو تجربة مستخدمة على نطاق واسع لتقييم السلوكيات المتعلقة باضطراب طيف التوحد^{17،29،30،31}. يتكون الجهاز من ثلاث غرف متصلة. تحتوي الغرفتان اليمنى واليسرى على قفص سلكي قد يكون فارغا أو مشغولا بالماوس ، مما يمكن ماوس الاختبار من التفاعل بحرية مع كلا القفصين. يساعد قياسان في تقييم الجوانب المختلفة للسلوك الاجتماعي في فأر الاختبار أثناء التجربة المكونة من ثلاث غرف. أولا ، يتم تسجيل فأرة الاختبار للوقت الذي يقضيه في التفاعل مع القفص الفارغ (كائن جديد) مقابل قفص يحتوي على فأر جديد. يوفر هذا الجزء من المهمة نظرة ثاقبة على التواصل الاجتماعي للماوس. بعد ذلك ، يتم وضع فأرة غير مألوفة في قفص سلكي فارغ سابقا. يقيس الفارق الزمني في تفاعل فأر الاختبار بين الفأر غير المألوف والمألوف تفضيل الحداثة الاجتماعية. في هذا الجزء من المهمة ، يفضل ماوس التحكم التفاعل مع فأرة غير مألوفة بدلا من الماوس الذي تمت مواجهته سابقا ، والذي كان موجودا بالفعل في جزء التواصل الاجتماعي من الاختبار. تم العثور على العجز في التفاعل الاجتماعي وانخفاض الدافع للتفاعل مع الفئران الجديدة بشكل عام في نموذج الفئران من ASD. أثبت اختبار الغرف الثلاث قوته منذ اختراعه. لقد تم استخدامه لدراسة الأنماط الظاهرية الاجتماعية في نماذج الفئران المختلفة لاضطراب طيف التوحد ، بما في ذلك Fmr1 ^{− / -} و Shank3B ^{− / -} و Cntnap2^{− / -} وسلالة BTBR الفطرية^{32،33،34،35،36}.

يستخدم الاختباران السلوك العفوي الطبيعي للفئران كأدوات جديرة بالتقدير لدراسة السلوك الشبيه باضطراب طيف التوحد. نظرا لأنها تعتبر اختبارات منخفضة الإجهاد ، فمن الممكن إجراء كلا الاختبارين داخل نفس المجموعة من الفئران لقياس السلوك الشبيه باضطراب طيف التوحد ، مع إجراء اختبار الاستمالة الذاتية أولا واختبار التفاعل الاجتماعي المكون من ثلاث غرف في الأيام اللاحقة. تقدم البروتوكولات التي نقدمها أداة أساسية لتقييم السلوك الشبيه باضطراب طيف التوحد وتطوير علاجات جديدة^29،30،31. في النهاية ، سيساهمون في تحسين النتائج للأفراد المصابين باضطراب طيف التوحد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات والتجارب التي تشمل الموضوعات الحيوانية من قبل لوائح لجنة رعاية المنشأة (FACC) ، والتي تتبع المبادئ التوجيهية التي وضعها المجلس الكندي لرعاية ، ولجنة رعاية بجامعة ماكجيل ، ومكتب رعاية المختبر التابع للمعاهد الوطنية للصحة (OLAW). رقم ضمان خدمة الصحة العامة (PHS) لجامعة ماكجيل هو F-16-00005 (A5006-01).

1. تحضير

1. فئران الاختبار: اختر الفئران الذكور و / أو الإناث بعمر 2-3 أشهر (8 إلى 13 أسبوعا). جميع الفئران المستخدمة في التجارب هنا هي من خلفية C57BL / 6J. بالنسبة لسلوك الاستمالة الذاتية ومقايسات التفاعل الاجتماعي المكونة من ثلاث غرف ، فإن النطاق المقبول عموما للفئران لكل مجموعة المقترح هو n = 10-15 ، بحد أدنى n = 8.
   1. بالنسبة للفئران المعدلة وراثيا ، أضف دائما زملائها من النوع البري كعنصر تحكم. قم بمطابقة المجموعة الضابطة مع المجموعة التجريبية من حيث الخلفية الجينية والعمر والجنس وظروف السكن. الفئران المعدلة وراثيا متماثلة اللواقح المستخدمة في هذه الدراسة طبيعية الحجم ولا تظهر أي تشوهات جسدية جسيمة.
      ملاحظة: في بعض الحالات الأكثر تعقيدا ، قد يكون الباحثون مهتمين بتقييم أكثر من نمطين جينيين (أي النوع البري ، متغاير الزيجوت ، متماثل اللواقح) ، أو التحقيق في آثار الأدوية (أي العلاج ، والعلاج ، وعدم العلاج) ، أو مقارنة الذكور والإناث. عند العمل مع إناث الفئران ، من الأهمية بمكان مراعاة دورات الشبق. في حين أن دورات الشبق الأنثوية لا تؤثر بشكل كبير على سلوكيات الاستمالة الذاتية ، فقد أشارت الدراسات إلى أن هذه الدورات يمكن أن تؤثر على النهج الاجتماعي وتفضيل الحداثة الاجتماعية^37،38.
2. الفئران الغريبة: استخدم ما لا يقل عن 8 فئران من النوع البري للاختبار المكون من ثلاث غرف. استخدم قفصين ، 4 فئران لكل قفص ، مطابقة العمر والجنس ونفس الخلفية الجينية (C57BL / 6J) لفئران الاختبار. تأكد من أن الفئران الغريبة لم يكن لديها تفاعل مسبق مع فئران الاختبار.
3. السكن: مجموعة من 3 إلى 5 فئران لكل قفص منزلي (أقفاص بلاستيكية للفأر 71/2 بوصة عرض × 11 بوصة × 5 بوصات ارتفاع) والحفاظ عليها في دورة إضاءة / ظلام مدتها 12 ساعة. تزويد الفئران بإمكانية الوصول إلى الطعام والماء في القفص المجاني.
   ملاحظة: في غرف السكن في هذه الدراسة، تضيء الأضواء في الساعة 7:00 صباحا.
4. نقل الفئران إلى منشأة الاختبار السلوكي الحيواني لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل التجارب^39,40.
5. التعامل والاختبار السلوكي: قم بإجراء الاختبار في وقت ثابت من اليوم. اضبط وقت البدء وفقا لدورة الضوء في غرف مبيت الماوس. أولا ، انقل الفئران إلى غرفة الاختبار واسمح لها بالتعود على غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل تحت إضاءة خافتة قبل بدء الاختبارات السلوكية.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إجراء تجارب الفئران بشكل روتيني بين الساعة 7:00 صباحا و 3:00 مساء (بالنسبة إلى ضوء 7:00 صباحا و7:00 مساء مطفأ). ومن ثم ، فإن البدء الفعلي لاختبار السلوك يحدث حوالي الساعة 8 صباحا.

2. إعداد الغرف والمعدات

1. قم بإعداد غرفة صغيرة بمساحات أرضية إجمالية تتراوح بين 16-36 قدما (5-12 م² ؛ 6 م² غرفة في هذه الدراسة). حافظ على درجة حرارة ثابتة وإضاءة (إضاءة خافتة قابلة للتعديل) ومستويات ضوضاء (عازلة للصوت بشكل مثالي) لجميع التجارب.
   1. في حالة استخدام مصابيح دائمة (مصابيح 23 واط ، 120 فولت) ، ضعها في مواقع متماثلة وعلى كل جانب ، على بعد 1 متر على الأقل من الجهاز المكون من ثلاث غرف ، لإضاءة الغرفتين الجانبيتين بالتساوي.
2. ضع الجهاز على طاولة بيضاء محمولة. لتجربة الاستمالة الذاتية ، استخدم أقفاصا نظيفة وشفافة (أقفاص بلاستيكية للفأر 71/2 بوصة عرض × 11 بوصة طول × 5 بوصات ارتفاع) ؛ استخدم قفصا واحدا لكل فأرة اختبار. املأ الأقفاص بحوالي 1 سم من الفراش الطازج بدون مواد التعشيش. استخدم نفس نوع الفراش كما هو الحال في قفص المنزل (هنا ، فراش كوز الذرة الطازج ([1/4 بوصة فراش كوز الذرة]).
   ملاحظة: يجب أن تكون الأقفاص بنفس حجم أقفاص المنزل ، مع وضع غطاء مرشح في الأعلى ، ولكن بدون شبكة معدنية (والتي تستخدم عادة لحمل الزجاجات وتوصيل الطعام).
3. بالنسبة للتجربة الاجتماعية ، استخدم جهازا من ثلاث غرف مجموعة⁴¹. يبلغ حجم كل حجرة 20 سم × 40 سم × 22 (ارتفاع) سم وتحيط بها جدران زجاجية. يمكن الوصول إلى كل غرفة جانبية من المركز عن طريق أبواب منزلقة شفافة يمكن إزالتها (5 × 8 سم). استخدم قفصين سلكيين (القطر: 7 سم ، الارتفاع: 15 سم ؛ مع أغطية غطاء (فارغة أو تحمل الفئران الغريبة). القفص مرتفع ومحاط بقضبان سلكية ناعمة من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطر الشريط: 3 مم ، تباعد القضبان: 7 مم). لا تقم بتضمين الجلوس فوق الأقفاص كوقت للتفاعل.
   1. إذا تم تضمين كل من الفئران من الذكور والإناث في التجربة ، فقم بتسمية كل قفص سلكي لوظيفته المخصصة لتقليل التلوث المتبادل.
4. قم بإعداد الكاميرات العلوية أو الأمامية على حوامل ثلاثية القوائم لتسجيلات الفيديو. تأكد من أن الكاميرات مشحونة بالكامل ولديها مساحة تخزين كافية.
5. بين كل تجربة اختبار الماوس ، قم بتنظيف الإعداد المكون من ثلاث غرف والأقفاص السلكية جيدا باستخدام عامل تنظيف عديم الرائحة (هنا ، Versa-Clean). قم بتخفيف عامل التنظيف في ماء الصنبور بنسبة 1:40 ، وقم بتطبيقه على السطح المتسخ ، وجفف الأسطح بمنشفة ورقية قبل الاختبار التالي لتقليل الرائحة المتبقية من الماوس السابق.
   ملاحظة: لا ينبغي استخدام الكحول الإيثيلي (70٪) أو المطهرات الأخرى ذات الروائح لتنظيف الجهاز أثناء اختبارات التفاعل الاجتماعي ، لأنها قد تؤثر على السلوك الاجتماعي للقوارض.
6. استخدم ستائر الخصوصية ، مثل الألواح البلاستيكية البيضاء ، والتي يمكن وضعها حول الجهاز للتخلص من إشارات الغرفة الخارجية.
7. قم بإعداد سبورة بيضاء صغيرة وعلامة. سجل المعلومات الأساسية على لوح المعلومات، بما في ذلك رقم الماوس وعنوان التجربة وتاريخ التجربة ووقتها.
   ملاحظة: يتم تقديم السبورة البيضاء إلى الكاميرا في نهاية التسجيل لمنع الشخص الذي يسجل النقاط من معرفة رقم الماوس قبل تقييم سلوك الماوس. ضمنت الدراسة أن سلوك التسجيل الفردي ظل أعمى عن المجموعات التجريبية لتقليل التحيز المحتمل.

3. المناولة

1. إجراء إجراءات المناولة لمدة ثلاثة أيام متتالية قبل بدء التجارب السلوكية.
2. قم بإجراء جلسات المناولة في نفس غرفة الاختبار في وقت ثابت ، ويفضل أن تكون الفئران أكثر نشاطا.
3. في كل يوم من الأيام الثلاثة ، أحضر الفئران إلى غرفة الاختبار واتركها دون إزعاج لمدة 30 دقيقة في ضوء خافت للتأقلم.
4. بعد فترة تأقلم مدتها 30 دقيقة ، افتح القفص وأدخل يدا مرتدية قفازا في القفص. اسمح للفئران باستكشاف اليد لمدة 1 دقيقة.
5. اغرف الفئران برفق على يدها (أو استخدم أنبوبا صغيرا من الورق المقوى لالتقاطها) ، وامسكها بشكل غير محكم. اسمح للفئران باستكشاف اليد والمعصم لمدة 1-2 دقيقة. في الحالات التي يكون فيها الماوس متثاقب أو عدوانيا ، ضعه على الشبكة واسمح له بتكوين نفسه.
6. استمر في التعامل حتى يصبح الماوس مرتاحا للبقاء على اليد. قم دائما بتغيير القفازات قبل إدخال اليدين إلى القفص التالي.
7. بعد التعامل مع كل قفص من الفئران ، ضعهم برفق في قفص منزلهم ، ثم كرر الإجراء.
8. ارتد قفازات جديدة وتعامل مع الفئران الغريبة عندما يتم التعامل مع جميع الفئران التجريبية والتحكم لتجنب التأثير على الفئران المختبرة برسائل معطرة.
9. تعامل مع الفئران الغريبة بنفس الطريقة.
10. اختياري: تعويد الفئران الغريبة على القفص السلكي والجهاز المكون من ثلاث غرف لمدة 10-15 دقيقة.
    ملاحظة: تساعد جلسة التعود هذه على تقليل الإثارة والسلوكيات الشاذة لدى الفئران الغريبة أثناء الاختبار المكون من ثلاث غرف. ومع ذلك ، بالنسبة للاختبار المكون من ثلاث غرف ، تأخذ هذه الدراسة في الاعتبار فقط سلوك النهج الاجتماعي (الاستنشاق) للقفص الذي بدأه فأر الاختبار ، سواء كان الفأر الغريب موجودا أم لا. لا يمكن ملاحظة الاستنشاق المتبادل بواسطة الفأر الغريب بشكل موثوق في هذا الفحص ، وبالتالي لا يتم احتسابه. نظرا لهذا القيد في الاختبار المكون من ثلاث غرف ولتقليل التلوث المتبادل للإشارات الكيميائية (مثل الروائح) ، في هذه الحالة ، لم يكن لدى الفئران الغريبة خبرة سابقة مع القفص السلكي والجهاز قبل بدء التجربة.

4. الطريقة 1: الاستمالة الذاتية للسلوك المتكرر (الشكل 1 أ)

1. قم بإجراء جميع التجارب السلوكية بين الساعة 7:00 صباحا و 3:00 مساء.
2. قم بتشغيل الأضواء الخافتة ، كما هو موضح أعلاه. نظف الطاولة وقم بإعداد الغرفة.
3. جهز كل قفص اختبار بطبقة رقيقة من الفراش الطازج (كما هو موضح في الخطوة 2.2).
4. ضع 1-2 أقفاص على الطاولة ، مفصولة عن بعضها البعض وبيئة الغرفة بواسطة غمامات بلاستيكية بيضاء.
5. ضع كاميرا أمام كل قفص لالتقاط ماوس الاختبار.
6. انقل جميع الفئران إلى الغرفة وقم بتغطية الأقفاص بورقة قماشية أثناء عملية النقل لتجنب الإجهاد.
7. قم بإزالة الورقة بمجرد وضع الفئران في غرفة الاختبار ، واتركها في الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل مع أضواء خافتة قبل بدء التجربة.
8. في بداية الاختبار، قم بتدوين رقم تعريف الماوس ومعلومات الاختبار على لوح المعلومات (كما هو موضح في الخطوة 2.7).
9. ابدأ التسجيل وضع ماوس الاختبار في قفص الاختبار.
10. اترك الغرفة خلال جلسة التسجيل التي تستغرق 20 دقيقة.
11. لكل اختبار ، ضع في اعتبارك أول 10 دقائق كعودة. استخدم الدقائق ال 10 التالية لمراقبة سلوك الاستمالة وتسجيله (انظر القسم 6).
12. بعد 20 دقيقة ، عد إلى الغرفة. اعرض السبورة البيضاء على الكاميرا وأوقف التسجيل.
13. ضع ماوس الاختبار برفق مرة أخرى في قفص المنزل وكرر التجربة.
    ملاحظة: موازنة ترتيب الاختبارات بين المجموعات التجريبية والضابطة لتقليل التأثيرات الخارجية المختلفة.
14. بعد الانتهاء من التجارب ، أعد الفئران إلى غرفة السكن الخاصة بهم.

5. الطريقة 2: اختبار التفاعل الاجتماعي ثلاثي الغرف (الشكل 2 أ)

1. قم بإجراء جميع التجارب بين الساعة 7:00 صباحا حتى الساعة 3:00 مساء.
2. نظف الطاولة وقم بتشغيل الأضواء (الأضواء الخافتة).
3. ضع أداة زجاج شبكي ثلاثية الغرف على الطاولة محاطة بستائر الخصوصية.
4. ضع كاميرا واحدة في الأعلى، مع التأكد من أن جميع الغرف الثلاث موجودة في إطار تسجيل الكاميرا.
5. انقل الاختبار والفئران الغريبة إلى الغرفة. قم بتغطية الأقفاص بورقة قماشية أثناء عملية النقل وقم بإزالة الورقة بمجرد دخولها إلى الغرفة.
6. اترك الفئران في الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل مع إضاءة خافتة قبل بدء التجربة.
7. التعود
   1. احتفظ بالغرف الثلاث فارغة أثناء مرحلة التعود.
   2. للبدء ، حدد ماوس اختبار واكتب رقم التعريف على لوح المعلومات.
   3. بعد ذلك ، ضع ماوس الاختبار برفق في المقصورة المركزية بينما لا تزال الأبواب المنزلقة مغلقة.
   4. ابدأ التسجيل وافتح الأبواب للسماح لماوس الاختبار باستكشاف الغرف الثلاث الفارغة.
   5. اخرج من الغرفة واترك فأرة الاختبار تعتاد على الجهاز لمدة 10 دقائق.
   6. بعد اكتمال التعود لمدة 10 دقائق ، عد إلى الغرفة. قم بتوجيه ماوس الاختبار برفق إلى المقصورة المركزية وأغلق الأبواب المنزلقة.
   7. اعرض السبورة البيضاء وأوقف الكاميرا.
8. النهج الاجتماعي (كائن قفص سلكي جديد مقابل فأر غريب رواية 1)
   1. ضع قفصين سلكين في الغرفتين اليمنى واليسرى. ضع هذه الأقفاص قطريا مقابل بعضها البعض في زوايا كل غرفة ، مما يضمن خلوصا 5 سم من الحائط ، مما يسمح لماوس الاختبار بالركض حول الأقفاص. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من أن الأقفاص لا تواجه أبواب الغرفة مباشرة.
   2. اختر فأرا غريبا وأدخله في أحد الأقفاص السلكية ، بينما لا يوجد فأر في القفص السلكي الآخر.
   3. لبدء الاختبار ، اضغط على تسجيل وإزالة كلا البابين المنزلقين. اترك الغرفة.
   4. اسمح لماوس الاختبار باستكشاف قفص سلكي فارغ في غرفة واحدة وقفص يحتوي على فأر غريب (فأر غريب جديد 1 أو S1) في الغرفة الأخرى لمدة 10 دقائق.
   5. بعد 10 دقائق ، عد إلى الغرفة. اعرض السبورة البيضاء على الكاميرا وقم بإنهاء التسجيل.
   6. أعد إدخال الماوس إلى المقصورة المركزية وأغلق الأبواب المتصلة.
      ملاحظة: لا تقم بإزالة الأقفاص السلكية من الإعداد بعد الانتهاء من اختبار النهج الاجتماعي حتى تظل في نفس الموضع أثناء المهمة بأكملها.
9. تفضيل الحداثة الاجتماعية (فأر غريب الرواية 2 مقابل فأر الرواية 1)
   1. ضع فأرة جديدة لم تصادف أبدا في قفص سلكي فارغ سابقا (ماوس غريب جديد 2 أو S2).
      ملاحظة: يجب أن يكون S2 من قفص منزلي مختلف عن S1.
   2. ابدأ التسجيل وافتح الأبواب المترابطة للسماح لماوس الاختبار باستكشاف الجهاز لمدة 10 دقائق.
   3. اترك الغرفة. سيستكشف ماوس الاختبار قفصين سلكيين: أحدهما مع ماوس S1 الذي تمت مواجهته سابقا من مرحلة النهج الاجتماعي والآخر مع ماوس S2 الذي تم تقديمه حديثا.
   4. بعد 10 دقائق ، عد إلى الغرفة. اعرض السبورة البيضاء على الكاميرا واختتم التسجيل.
   5. أعد جميع الفئران (الفئران التجريبية والغريبة) إلى أقفاص منازلهم.
   6. نظف الغرف والأقفاص السلكية جيدا بمطهر خال من الرائحة. تأكد من تجفيف الجهاز قبل استخدامه في التجربة التالية.
   7. كرر التجربة لجميع فئران الاختبار المتبقية.
      ملاحظة: قم بتبديل وضع الأقفاص مع الفئران S1 و S2 بين الغرفتين اليمنى واليسرى لفئران الاختبار المختلفة. يمنع الموازن التفضيل المتحيز تجاه غرفة معينة من الجهاز.
   8. بعد الاختبار ، أعد الفئران إلى المنشأة السكنية.
   9. بين كل جزء من الاختبار ، أوقف الكاميرا وأعد تشغيلها ، مما ينتج عنه مقاطع فيديو 3 مرات 10 دقائق لكل ماوس اختبار.

6. التهديف والتحليل الإحصائي

1. المعدات اللازمة
   1. استخدم ساعتي توقيت وجهاز كمبيوتر أو كمبيوتر محمول مع البرامج التالية: Microsoft Excel و GraphPad Prism وبرامج إحصائية أخرى مثل SPSS للتسجيل ورسم الرسوم البيانية والتحليل الإحصائي.
2. تسجيل العناية الذاتية
   ملاحظة: عندما يتم وضع الماوس في بيئة مريحة ، يمكن ملاحظة سلوك الاستمالة الذاتية التلقائي منخفض الضغط. عادة ، تبدأ الفئران في الاستمالة عن طريق لعق كفوفها حول الأنف والشعيرات (المرحلة الأولى). قد يتبع ذلك المرحلتان الثانية والثالثة ، حيث يشرع الفأر في مسح وجهه ورأسه بالكامل بمخالبه. في المرحلة الرابعة ، يستمر الفأر في العناية بجسمه ولعق ذيله¹⁴. نظرا لقلة تواتر العناية بآذانهم (المرحلة الثالثة) وذيولهم (المرحلة الرابعة) خلال فترة اختبار مدتها 10 دقائق ، وبهدف تعزيز وضوح التحليل اليدوي ، تم تصنيف سلوك الاستمالة الذاتية إلى نوعين أساسيين: الاستمالة المنقارية والاستمالة الذيلية. يتضمن الاستمالة المنقارية أنشطة مثل لعق المخلب ، والعناية بالأنف ، والغسيل الشامل للوجه والأذنين والرأس. يشمل الاستمالة الذيلية لعق جزء الجسم الذي يغطي مناطق مثل البطن والظهر والأطراف الخلفية ومنطقة الأعضاء التناسلية ، وكذلك الذيل.
   1. راقب سلوك الاستمالة بعناية وسجل النوبات. تحدث جلسة الاستمالة الفردية عندما ينخرط الماوس في حالة واحدة من الاستمالة الذاتية. ضع في اعتبارك جلسة العناية الشخصية من لحظة بدايها حتى توقفها ، بغض النظر عن سلوكيات الحلاقة المحددة المعنية.
   2. إذا أوقف ماوس الاختبار الاستمالة مؤقتا لبضع ثوان دون تغيير الموضع ، فقم باحتسابه كجزء من نفس المباراة. ومع ذلك ، إذا توقف الفأر عن الاستمالة وبدأ في الاستكشاف ، ففكر في أن نوبة الحلاقة قد انتهت.
   3. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتسجيل جلسة حلاقة كاملة فقط عندما يعتني الماوس باستمرار من الأمام إلى الخلف (من المرحلة الأولى إلى المرحلة الرابعة).
   4. قم بتوثيق إجمالي وقت الحلاقة ، وعدد نوبات الحلاقة ، وعدد نوبات الحلاقة الكاملة التي تمت ملاحظتها خلال فترة الاختبار التي تبلغ 10 دقائق ، مع وضع علامة على الملاحظات بفواصل زمنية مدتها دقيقتان و 5 دقائق و 10 دقائق.
3. اختبار التفاعل الاجتماعي المكون من ثلاث غرف
   يحدد التحليل وقت وتواتر تفاعل الاستنشاق مع كل فأر (رواية S1 والقفص الفارغ للنهج الاجتماعي ، و S1 والرواية S2 لتفضيل الحداثة الاجتماعية).
   1. استخدم مؤقتين لتسجيل وقت التفاعل مع الماوس في كل قفص وإجمالي الوقت الذي يقضيه في كل غرفة. لكل جزء من الاختبار (النهج الاجتماعي وتفضيل الحداثة الاجتماعية) ، سجل عدد المرات التي يدخل فيها فأر الاختبار إلى كل غرفة (إجمالي الإدخالات).
   2. حدد الوقت في المقصورات (الحجرات) من خلال وجود جسم فأر الاختبار داخل إحدى الغرف (يجب إدخال أربعة أقدام).
   3. سجل وقت (زمن) التفاعل عندما يشم ماوس الاختبار الماوس الغريب الجديد (الاتصال المباشر بالوجه أو استنشاق ذيل الماوس الغريب) أو يشم القفص الفارغ. لا تعتبر الجلوس على الجزء العلوي من القفص تفاعلا.
   4. سجل في 2 دقيقة و 5 دقائق و 10 دقائق. قم بإجراء تحليل يعتمد على الوقت.
   5. قارن مؤشر التمييز الاجتماعي (DI) داخل المجموعات.
      ملاحظة: يتم حساب DI على النحو التالي: DI = (وقت التفاعل مع الماوس S1 - وقت التفاعل مع القفص الفارغ) / إجمالي وقت التفاعل × 100. خلال جزء الحداثة الاجتماعية ، ستتفاعل فئران التحكم مع S2 (فأر غير مألوف) أكثر من S1 (الماوس المألوف). يتم حساب الحداثة الاجتماعية (الذاكرة الاجتماعية) DI: DI = (وقت التفاعل مع الماوس S2 - وقت التفاعل مع الماوس المألوف (S1)) / إجمالي وقت التفاعل × 100.
4. التحليل الإحصائي
   1. استخدم اختبار T للطالب غير المقترن ثنائي الذيل لحساب قيم p بمستوى كبير تم تعيينه عند p < 0.05 لوقت الاستمالة الذاتية والنوبات والنوبات الكاملة ، حيث توجد مجموعتان فقط.
   2. بالنسبة للاختبار المكون من ثلاث غرف ، استخدم اختبار T للطالب لحساب الدلالة الإحصائية لإجمالي الإدخالات بين مجموعتين. عندما لا يتم استيفاء افتراض التباين المتساوي للبيانات بين المجموعات (اختبار ليفين ص < 0.05) ، قم بإجراء اختبار ويلش T لضبط الانحراف ومقارنة وسائل المجموعات المستقلة.
      ملاحظة: قياس إجمالي الإدخالات يقيم النشاط الكلي للفئران. قد تنشأ مخاوف محتملة (تتعلق بالضعف الحركي وارتفاع مستويات القلق لدى الفئران) إذا استكشفت المجموعة التجريبية الجهاز المكون من ثلاث غرف أقل بكثير من المجموعة الضابطة. لمعالجة هذا الأمر ، ضع في اعتبارك تقييم الوظيفة الحركية والسلوك الشبيه بالقلق من خلال الاختبارات السلوكية الشبيهة بالاكتئاب ، حيث يمكن أن يعزى الاستكشاف المتناقص إلى هذه الحالات⁴².
   3. استخدم ANOVA مختلط الاتجاهات لمقارنة الوقت في كل غرفة ووقت التفاعل لكل اختبار. اعتمادا على عدد المجموعات والعوامل ، استخدم ANOVA مختلطا ثنائي الاتجاه (عاملان: النمط الجيني وجانب الغرفة ، أو التفاعل مع القفص الفارغ و S1 ، أو S1 و S2) ، أو ANOVA ثلاثي الاتجاهات مختلط (3 عوامل: النمط الجيني ، والعلاج ، وجانب الغرفة ، أو التفاعل مع فارغة و S1 ، أو S1 و S2). هذا التحليل مفيد بشكل خاص للكشف عن التفاعل الاجتماعي ذي الدلالة الإحصائية للفئران بين العوامل المختلفة.
      ملاحظة: تشمل هذه العوامل التأثير الرئيسي للنمط الجيني (تأثير الخلفيات الجينية المختلفة على السلوكيات الاجتماعية) ، والتأثير الرئيسي للتفاعل مع القفص (الاستنشاق وتفضيل الفأر الغريب الجديد مقابل قفص فارغ أو فأر تمت مواجهته سابقا) ، والتأثير الرئيسي للعلاج (تأثير العلاجات الدوائية المختلفة على السلوكيات الاجتماعية للفأر) ، وتفاعل علاج النمط الجيني x (تكشف كيف يؤثر العلاج المطبق على النمط الجيني).
   4. بعد ذلك ، استخدم اختبار Bonferroni اللاحق (المستوى α المحدد عند 0.05) لتقييم المقارنة بين المجموعات المختلفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يلعب هدف الثدييات من الرابامايسين (mTOR) أدوارا حاسمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) من خلال تنظيم تخليق البروتين من جديد وقمع الالتهام الذاتي⁴³. كان خلل تنظيم مسار mTOR وتخليق البروتين المشبكي متورطا في ASD²⁸. حددت الدراسات على مستوى الجينوم على مر?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

معظم الأسباب المسببة والتغيرات المرضية والعلامات البيولوجية لاضطراب طيف التوحد غير معروفة أو متاحة. يعتمد تشخيص اضطراب طيف التوحد بشكل أساسي على مجموعتين ثابتتين من الأعراض السريرية: العجز المستمر في التواصل الاجتماعي والسلوكيات المتكررة^{المفرطة 18،}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4'' Teklad Corncob Bedding	Harlan, TEKLAD	7092-7097	The raw stock for corncob bedding products  is 100% corncob. No other components or additives are used.
HD Video Recording Cameratraditional Video Camera	Sony	HDRCX405	50 Mbps XAVC S1 1920 x 1080 at 60P, AVCHD and MP4 codecs. 30x Optical / 60x Clear Image Zoom to get closer to the action. 26.8 mm wide angle ZEISS Lens.
Nitrile Powder Free Examination Gloves	Aurelia, Transform	ASTM D6319-00	Tested for use with Chemotherapy drugs per ASTM D6978
Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	AN75PLF	AN75 Mouse 7½” W x 11½” L x 5” H
TÅGARP floor lamp and bulbs	IEKA	604.640.49	Bulbs are 23 W 120 V.
Ugo Basile Sociability Apparatus	Stoelting	60450	The Sociability Apparatus (3-chambered social test) is a valuable tool to study social behaviour in mice.
Versa-Clean	Fisherbrand	PVCLN04	Cleaning agent
Whiteboard and  Low Odor Dry Erase Marker	EXPO	NA	Dry erase markers in bold black