Strategien zur Beurteilung autistischer Verhaltensweisen bei Mäusen

Zusammenfassung

Nagetiermodelle sind wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung von Kernverhaltensweisen im Zusammenhang mit der Autismus-Spektrum-Störung (ASS). In diesem Artikel erläutern wir zwei Verhaltenstests zur Modellierung der Kernmerkmale von ASD bei Mäusen: Self-Grooming, der sich wiederholendes Verhalten bewertet, und der Drei-Kammer-Test für soziale Interaktion, der soziale Beeinträchtigungen dokumentiert.

Zusammenfassung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) ist eine neurobiologisch komplexe Erkrankung mit einer heterogenen genetischen Ätiologie. Klinisch wird ASS durch Beeinträchtigungen der sozialen Kommunikation und restriktive oder sich wiederholende Verhaltensweisen wie Handflattern oder Aneinanderreihen von Gegenständen diagnostiziert. Diese Verhaltensmuster können in Mausmodellen mit ASD-verknüpften genetischen Mutationen zuverlässig beobachtet werden, was sie zu sehr nützlichen Werkzeugen für die Untersuchung der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen bei ASD macht. Das Verständnis, wie sich genetische Veränderungen auf die Neurobiologie und die bei ASD beobachteten Verhaltensweisen auswirken, wird die Entwicklung neuartiger zielgerichteter therapeutischer Wirkstoffe zur Verbesserung grundlegender Verhaltensstörungen erleichtern. Unser Labor hat mehrere Protokolle verwendet, die gut beschriebene Trainings- und Testverfahren umfassen, die ein breites Spektrum an Verhaltensdefiziten im Zusammenhang mit ASS widerspiegeln. Hier beschreiben wir zwei Assays, um die Kernmerkmale von ASD in Mausmodellen zu untersuchen: Self-Grooming (ein Maß für sich wiederholendes Verhalten) und den Drei-Kammer-Test für soziale Interaktion (ein Maß für den Ansatz der sozialen Interaktion und die Präferenz für soziale Neuheit).

Einleitung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) ist eine Entwicklungsstörung des Gehirns, die sich in sozialen Kommunikations- oder Interaktionsstörungen und eingeschränkten, sich wiederholenden Verhaltensmustern oder Interessen manifestiert ^1,2. Im Jahr 2022 wurde weltweit bei etwa 1 von 100 Kindern ASS diagnostiziert³. Nach Angaben der Centers for Disease Control and Prevention (CDC, USA) ist die Prävalenz von ASD seit 2008 um 30 % gestiegen und seit 2000 um mehr als das 2-fache^{gestiegen 4,5}. Personen mit ASD können auch Komorbiditäten aufweisen, wie z. B. geistige Behinderung (ID) (35,2 %, IQ ≤ 70), Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) (50 %-70 %) und andere genetische Syndrome ^2,4,6.

Die Verwendung von Tiermodellen in der ASD-Forschung, insbesondere von Nagetieren, hat wichtige Einblicke in die Auswirkungen verschiedener Umweltfaktoren geliefert, einschließlich Ernährung, Medikamente, Bewegung und Bereicherung 7,8,9,10 sowie genetischer Mutationen wie Shank, Fmr1, Mecp2, Pten und Tsc-Mutante 11,12,13, auf ASD-Symptome. Mausmodelle werden aufgrund ihrer sozialen Natur und ihrer gemeinsamen genetischen, biochemischen und elektrophysiologischen Merkmale mit dem Menschen häufig zur Untersuchung von ASD verwendet. Zum Beispiel können durch die Deletion eines bestimmten Gens (wie Shank3, Fmr1, Cntnap2 und Pten) abweichende soziale und sich wiederholende Verhaltensweisen rekapituliert werden, was eine starke Validität der Studie gewährleistet 14,15,16. Hier stellen wir Protokolle zur Verfügung, um Parallelen zwischen tierischen genetischen Modellen und menschlichen ASD-Symptomen zu untersuchen¹⁷. Wir beschreiben den Self-Grooming- und den Drei-Kammer-Test für soziale Interaktion, die zwei Kernsymptome bei ASD-Patienten widerspiegeln, nämlich eingeschränkte, sich wiederholende Verhaltensmuster bzw. Beeinträchtigungen der sozialen Interaktion (Kommunikation).

Basierend auf dem DSM-V (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders of the American Psychiatric Association 5^. Auflage) und ICD-11 (Internationale Klassifikation der Krankheiten 11. Revision) zeigen ASD-Patienten eingeschränkte, sich wiederholende und stereotype Verhaltensmuster, insbesondere nicht-funktionale körperfokussierte repetitive Verhaltensweisen (BFRBs) wie Schaukeln, Stimming, Nägelkauen, Haareziehen, Hautzupfen oder Zehengehen^{18, 19}. Urheberrecht Bei Tieren äußert sich repetitives Verhalten in längerer und wiederholter Selbstpflege. Die Fellpflege ist eine der häufigsten angeborenen Aktivitäten bei Nagetieren, wobei etwa 40 % ihrer Wachzeit für die Fellpflege aufgewendet^{werden 20,21}. Es ist instinktiv für Mäuse, ihre Haut oder ihr Fell zu lecken, um Fremdschmutz von der Körperoberfläche zu entfernen, was dazu dient, die Körpersauberkeit zu erhalten, Verletzungen vorzubeugen, Parasiten zu entfernen und die Temperatur zu regulieren. Grooming wird in zwei Arten eingeteilt: Social Grooming (Allo-Grooming), bei dem es sich um eine andere Maus handelt, und Self-Grooming. Self-Grooming zeigt ein stereotypes und konserviertes Sequenzierungsmuster, das aus vier Stadien besteht (meist diskret und nicht-sequentiell)^22,23. Im Stadium I (elliptischer Schlaganfall) leiten Mäuse die Fellpflege ein, indem sie zuerst beide Pfoten lecken und dann mit den Pfoten um die Nase herum putzen. Im Stadium II (einseitiger Schlaganfall) wischen sich Mäuse mit den Pfoten asymmetrisch über das Gesicht. Im Stadium III (Bilateraler Schlaganfall) wischen sich Mäuse symmetrisch über Kopf und Ohren. Im Stadium IV (Körperlecken) gehen Mäuse zum Körperlecken über, indem sie ihren Kopf nach hinten bewegen und die Fellpflege auf den Schwanz und die Genitalien ausdehnen können. Werden Mäuse einzeln in einen durchsichtigen Käfig gesetzt, kann das Selbstfellverhalten leicht erkannt und beobachtet werden. Mäuse erhöhen ihr Selbstpflegeverhalten, wenn sie mit Stress, Schmerzen oder sozialer Störung konfrontiert sind, was den Selbstpflegetest für die Erforschung neurologischer Störungen entscheidend macht²². Verschiedene Mausmodelle von ASD, einschließlich solcher mit genetischen Mutationen (wie Fmr1^−/y, Shank3B^−/-, NL1^−/−), pharmakologischen Interventionen (wie DO34, PolyI:C) und spezifischen Inzuchtstämmen (wie BTBR und C58/J), haben ein exzessives, sich wiederholendes Selbstpflegeverhalten gezeigt^24,25,26,27.

Veränderungen im Sozialverhalten dienen als eines der Kriterien für die Beurteilung von ASS. Nach dem DSM-V und der ICD-11 weisen ASD-Patienten anhaltende Beeinträchtigungen der sozialen Kommunikation und sozialen Interaktion auf^{1 8,19}. Diese können sich in verbalen und nonverbalen Kommunikationsdefiziten (d. h. abnormalem Blickkontakt, Gestik und Gesichtsausdruck), mangelndem Teilen von Interesse und Emotionen mit anderen, Unkenntnis sozialer Kontexte oder Schwierigkeiten beim Aufbau von Beziehungen äußern. In Übereinstimmung mit den Symptomen der sozialen Beeinträchtigung wurden verschiedene Verhaltensaufgaben entwickelt und optimiert, um soziale Interaktionen bei Mäusen zu bewerten, wie z. B. der direkte soziale Interaktionstest, der Drei-Kammer-Sozialansatz und der Test der Präferenz für soziale Neuheit sowie die Analyse von Ultraschall-Vokalisationen (USVs)^16,28. Der Drei-Kammer-Test für soziale Interaktion ist ein weit verbreitetes Experiment zur Bewertung von ASS-bezogenen Verhaltensweisen 17,29,30,31. Die Vorrichtung besteht aus drei miteinander verbundenen Kammern; Die linke und rechte Kammer enthalten einen Drahtkäfig, der entweder leer oder von einer Maus besetzt sein kann, so dass die Testmaus frei mit beiden Käfigen interagieren kann. Zwei Messungen helfen dabei, verschiedene Aspekte des Sozialverhaltens bei der Testmaus während des Drei-Kammer-Experiments zu bewerten. Zuerst wird die Testmaus für die Zeit bewertet, die sie mit dem leeren Käfig (dem neuartigen Objekt) im Vergleich zu einem Käfig verbracht hat, der eine neuartige Maus enthält. Dieser Teil der Aufgabe gibt Einblick in die Geselligkeit der Maus. Als nächstes wird eine unbekannte Maus in den zuvor leeren Drahtkäfig gelegt. Der Zeitunterschied in der Interaktion der Testmaus zwischen der unbekannten und der vertrauten Maus misst die Präferenz für soziales Neues. In diesem Teil der Aufgabe interagiert eine Kontrollmaus lieber mit einer unbekannten Maus als mit der zuvor angetroffenen Maus, die bereits im Geselligkeitsteil des Tests vorhanden war. Defizite in der sozialen Interaktion und eine verminderte Motivation zur Interaktion mit neuen Mäusen sind im Allgemeinen im Mausmodell der ASD zu finden. Der Drei-Kammer-Test hat sich seit seiner Erfindung als robust erwiesen. Es wurde verwendet, um soziale Phänotypen in verschiedenen Mausmodellen von ASD zu untersuchen, darunter ^Fmr1−/−, Shank3B^−/-, Cntnap2^−/− und der BTBR-Inzuchtstamm 32,33,34,35,36.

Die beiden Tests nutzen natürlich vorkommendes, spontanes Verhalten von Mäusen als verdienstvolle Werkzeuge zur Untersuchung von ASS-ähnlichem Verhalten. Da sie als Low-Stress-Tests gelten, ist es möglich, beide Tests innerhalb derselben Gruppe von Mäusen durchzuführen, um ASD-ähnliches Verhalten zu messen, wobei zuerst der Selbstpflegetest und an den folgenden Tagen der Dreikammer-Test der sozialen Interaktion durchgeführt wird. Die von uns zur Verfügung gestellten Protokolle stellen ein wesentliches Werkzeug für die Beurteilung von ASD-ähnlichem Verhalten und die Entwicklung neuer Therapeutika^dar 29,30,31. Letztendlich würden sie dazu beitragen, die Ergebnisse für Menschen zu verbessern, die von ASS betroffen sind.

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Protokoll

Alle Verfahren und Versuche mit Tierversuchen wurden durch die Vorschriften des Facility Animal Care Committee (FACC) genehmigt, die den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care, des McGill University Animal Care Committee und des NIH Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) folgen. Die Sicherungsnummer des Public Health Service (PHS) für die McGill University lautet F-16-00005 (A5006-01).

1. Vorbereitung der Tiere

1. Testmäuse: Wählen Sie 2-3 Monate (8 bis 13 Wochen) alte männliche und/oder weibliche Mäuse aus. Alle Mäuse, die in den Experimenten hier verwendet wurden, stammen aus dem C57BL/6J-Hintergrund. Für das Selbstfellverhalten und die Dreikammer-Assays für soziale Interaktion beträgt der allgemein akzeptable Bereich von Mäusen pro Gruppe n = 10-15, mit einem Minimum von n = 8.
   1. Bei genetisch veränderten Mäusen fügen Sie immer Wildtyp-Wurfgeschwister als Kontrolle hinzu. Ordnen Sie die Kontrollgruppe der Versuchsgruppe in Bezug auf genetischen Hintergrund, Alter, Geschlecht und Wohnbedingungen zu. Die in dieser Studie verwendeten homozygoten transgenen Mäuse sind normal groß und weisen keine groben körperlichen Anomalien auf.
      HINWEIS: In einigen komplexeren Fällen können Forscher daran interessiert sein, mehr als zwei Genotypen (d. h. Wildtyp, heterozygot, homozygot) zu bewerten, die Auswirkungen von Medikamenten zu untersuchen (d. h. Behandlung, Vehikelbehandlung, Nichtbehandlung) oder Männer und Frauen zu vergleichen. Bei der Arbeit mit weiblichen Mäusen ist es entscheidend, ihre Brunstzyklen zu berücksichtigen. Während weibliche Östruszyklen das Selbstpflegeverhalten nicht signifikant beeinflussen, haben Studien gezeigt, dass diese Zyklen die soziale Herangehensweise und die Präferenz für soziale Neuheit beeinflussen können^37,38.
2. Fremde Mäuse: Verwenden Sie mindestens 8 Wildtyp-Mäuse für den Drei-Kammer-Test. Verwenden Sie 2 Käfige, 4 Mäuse pro Käfig, die dem Alter, dem Geschlecht und dem gleichen genetischen Hintergrund (C57BL/6J) der Testmäuse entsprechen. Stellen Sie sicher, dass die fremden Mäuse zuvor keine Interaktion mit den Testmäusen hatten.
3. Unterbringung: Gruppenhaltung von 3-5 Mäusen pro Heimkäfig (71/2" B x 111/2" L x 5" H Maus-Kunststoffkäfige) und Aufrechterhaltung auf einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Geben Sie Mäusen Zugang zu Futter und Wasser im Käfig ad libitum.
   HINWEIS: In den Wohnräumen in diesem Arbeitszimmer geht das Licht um 7:00 Uhr morgens an.
4. Bringen Sie die Mäuse mindestens 1 Woche vor den Versuchen in die Verhaltenstesteinrichtung^{für Tiere 39,40}.
5. Handhabungs- und Verhaltenstests: Führen Sie den Test zu einer einheitlichen Tageszeit durch. Passen Sie die Startzeit in Abhängigkeit vom Lichtzyklus in den Mäusegehäuseräumen an. Bringen Sie die Mäuse zunächst in den Testraum und lassen Sie sie sich mindestens 30 Minuten lang bei gedimmtem Licht an den Testraum gewöhnen, bevor Sie mit den Verhaltenstests beginnen.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden Mausexperimente routinemäßig zwischen 7:00 und 15:00 Uhr durchgeführt (bezogen auf 7:00 Uhr Licht an und 19:00 Uhr Licht aus). Die eigentliche Initiierung des Verhaltenstests erfolgt also gegen 8 Uhr morgens.

2. Vorbereitung von Räumen und Geräten

1. Bereiten Sie einen kleinen Raum mit einer Gesamtgrundfläche zwischen 16 und 36 Fuß (5-12 m²; 6 m² Raum in dieser Studie) vor. Halten Sie für alle Experimente eine konstante Temperatur, Beleuchtung (einstellbare gedimmte Beleuchtung) und Geräuschpegel (idealerweise schalldicht) aufrecht.
   1. Wenn Sie Stehlampen (Glühbirnen 23 W, 120 V) verwenden, stellen Sie diese symmetrisch und auf jeder Seite in einem Abstand von mindestens 1 m zum Dreikammergerät auf, um die beiden Seitenkammern gleichmäßig zu beleuchten.
2. Stellen Sie das Gerät auf einen tragbaren weißen Tisch. Verwenden Sie für das Selbstpflegeexperiment saubere, transparente Käfige (71/2" B x 111/2" L x 5" H Maus-Kunststoffkäfige); Verwenden Sie einen Käfig pro Testmaus. Füllen Sie die Käfige mit ca. 1 cm frischer Einstreu ohne Nistmaterial. Verwenden Sie die gleiche Art von Einstreu wie im heimischen Käfig (hier frische Maiskolbeneinstreu ([1/4" Corncob-Einstreu]).
   HINWEIS: Die Käfige sollten die gleiche Größe wie die Käfige für zu Hause haben, mit einem Filterdeckel darauf, aber ohne Metallgitter (das normalerweise zum Halten von Flaschen und Lebensmittellieferungen verwendet wird).
3. Für das soziale Experiment wird ein Dreikammerapparat der Garnitur⁴¹ verwendet. Jede Kammer ist 20 cm x 40 cm x 22 (h) cm groß und von Plexiglaswänden umgeben. Jede Seitenkammer ist von der Mitte aus durch transparente, abnehmbare Schiebetüren (5 x 8 cm) zugänglich. Verwenden Sie zwei Drahtkäfige (Durchmesser: 7 cm, Höhe: 15 cm; mit Abdeckdeckeln (leer oder mit fremden Mäusen). Der Käfig ist erhöht und von glatten Edelstahldrahtstangen umschlossen (Stangendurchmesser: 3 mm, Stangenabstand: 7 mm). Schließen Sie das Sitzen auf den Käfigen nicht als Interaktionszeit ein.
   1. Wenn sowohl männliche als auch weibliche Mäuse in das Experiment einbezogen werden, beschriften Sie jeden Drahtkäfig für seine spezielle Funktion, um Kreuzkontaminationen zu minimieren.
4. Richten Sie Overhead- oder Frontkameras auf Stativen für Videoaufnahmen ein. Stellen Sie sicher, dass die Kameras vollständig aufgeladen sind und über ausreichend Speicherplatz verfügen.
5. Reinigen Sie zwischen jedem Versuch mit der Testmaus den Dreikammeraufbau und die Drahtkäfige gründlich mit einem geruchlosen Reinigungsmittel (hier Versa-Clean). Verdünnen Sie das Reinigungsmittel in Leitungswasser im Verhältnis 1:40, tragen Sie es auf die verschmutzte Oberfläche auf und trocknen Sie die Oberflächen vor dem nächsten Test mit einem Papiertuch ab, um Geruchsreste von der vorherigen Maus zu minimieren.
   HINWEIS: Ethylalkohol (70 %) oder andere geruchsintensive Desinfektionsmittel sollten nicht zur Reinigung des Geräts während sozialer Interaktionstests verwendet werden, da sie das Sozialverhalten von Nagetieren beeinträchtigen können.
6. Verwenden Sie Sichtschutzrollos, wie z. B. weiße Plastikbretter, die um das Gerät herum platziert werden können, um äußere Raumreize zu eliminieren.
7. Bereiten Sie ein kleines Whiteboard und einen Marker vor. Notieren Sie wichtige Informationen auf dem Whiteboard, einschließlich der Mausnummer, des Experimenttitels, des Datums und der Uhrzeit des Experiments.
   HINWEIS: Das Whiteboard wird der Kamera am Ende der Aufzeichnung präsentiert, um zu verhindern, dass die bewertende Person die Nummer der Maus kennt, bevor sie das Verhalten der Maus bewertet. Die Studie stellte sicher, dass das individuelle Bewertungsverhalten für die Versuchsgruppen blind blieb, um mögliche Verzerrungen zu minimieren.

3. Handhabung

1. Führen Sie Handhabungsverfahren an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor Beginn der Verhaltensexperimente durch.
2. Führen Sie Handhabungssitzungen im selben Testraum zu einer einheitlichen Zeit durch, idealerweise morgens, wenn die Mäuse aktiver sind.
3. Bringen Sie die Mäuse an jedem der 3 Tage in den Testraum und lassen Sie sie 30 min lang ungestört bei schummrigem Licht, um sich zu akklimatisieren.
4. Nach einer 30-minütigen Eingewöhnungsphase öffnen Sie den Käfig und führen eine behandschuhte Hand in den Käfig ein. Lassen Sie die Mäuse 1 Minute lang die Hand erkunden.
5. Schöpfen Sie die Mäuse vorsichtig auf die Hand (oder verwenden Sie ein kleines Pappröhrchen, um sie aufzuheben) und halten Sie sie locker. Lassen Sie die Mäuse 1-2 Minuten lang die Hand und das Handgelenk erkunden. In Fällen, in denen eine Maus sprunghaft oder aggressiv ist, platzieren Sie sie auf dem Raster und lassen Sie sie sich selbst komponieren.
6. Fahren Sie mit der Handhabung fort, bis die Maus bequem in der Hand bleibt. Wechseln Sie immer die Handschuhe, bevor Sie die Hände an den nächsten Käfig führen.
7. Nachdem Sie jeden Käfig mit Mäusen angefasst haben, setzen Sie sie vorsichtig in ihren Heimkäfig und wiederholen Sie dann den Vorgang.
8. Ziehen Sie neue Handschuhe an und fassen Sie fremde Mäuse an, wenn alle Versuchs- und Kontrollmäuse angefasst wurden, um zu vermeiden, dass die Testmäuse mit parfümierten Botschaften beeinträchtigt werden.
9. Behandeln Sie die fremden Mäuse auf die gleiche Weise.
10. Optional: Gewöhnen Sie die fremden Mäuse für 10-15 min an den Drahtkäfig und das Dreikammergerät.
    HINWEIS: Diese Gewöhnungssitzung hilft, Unruhe und abweichende Verhaltensweisen bei den fremden Mäusen während des Drei-Kammer-Tests zu reduzieren. Für den Drei-Kammer-Test berücksichtigt diese Studie jedoch nur das von der Testmaus initiierte soziale Annäherungsverhalten (Schnüffeln) des Käfigs, unabhängig davon, ob eine fremde Maus anwesend ist oder nicht. Das reziproke Schnüffeln durch die fremde Maus ist in diesem Assay nicht zuverlässig beobachtbar und wird daher nicht gezählt. Aufgrund dieser Einschränkung des Dreikammertests und zur Minimierung einer Kreuzkontamination chemischer Signale (wie z.B. Gerüche) hatten die fremden Mäuse in diesem Fall vor Beginn des Experiments keine Vorerfahrungen mit dem Drahtkäfig und der Apparatur.

4. Methode 1: Selbstpflege für sich wiederholendes Verhalten (Abbildung 1A)

1. Führen Sie alle Verhaltensexperimente zwischen 7:00 und 15:00 Uhr durch.
2. Schalten Sie gedimmtes Licht ein, wie oben beschrieben. Reinigen Sie den Tisch und richten Sie den Raum ein.
3. Bereiten Sie jeden Testkäfig mit einer dünnen Schicht frischer Einstreu vor (wie in Schritt 2.2 beschrieben).
4. Stellen Sie 1-2 Käfige auf den Tisch, getrennt von einander und der Raumumgebung durch weiße Plastikscheuklappen.
5. Platzieren Sie vor jedem Käfig eine Kamera, um die Testmaus zu erfassen.
6. Bringen Sie alle Mäuse in den Raum und decken Sie die Käfige während des Transfervorgangs mit einer Stofffolie ab, um Stress zu vermeiden.
7. Entfernen Sie das Blatt, sobald die Mäuse in den Testraum gestellt wurden, und lassen Sie sie vor Beginn des Experiments mindestens 30 Minuten lang mit gedimmtem Licht im Raum.
8. Notieren Sie sich zu Beginn des Tests die Mausidentifikationsnummer und die Testinformationen auf einem Whiteboard (wie in Schritt 2.7 beschrieben).
9. Starten Sie die Aufzeichnung und legen Sie die Testmaus in den Testkäfig.
10. Verlassen Sie den Raum während der 20-minütigen Aufnahmesession.
11. Betrachten Sie bei jedem Test die ersten 10 Minuten als Gewöhnung. Nutzen Sie die folgenden 10 Minuten, um das Pflegeverhalten zu beobachten und zu bewerten (siehe Abschnitt 6).
12. Nach 20 Minuten kehren Sie in den Raum zurück. Halten Sie das Whiteboard in die Kamera und stoppen Sie die Aufnahme.
13. Setzen Sie die Testmaus vorsichtig wieder in den Heimkäfig ein und wiederholen Sie den Versuch.
    HINWEIS: Gleichen Sie die Reihenfolge der Tests zwischen Versuchs- und Kontrollgruppen aus, um verschiedene äußere Einflüsse zu reduzieren.
14. Nachdem die Experimente abgeschlossen sind, bringen Sie die Mäuse in ihren Stallraum zurück.

5. Methode 2: Drei-Kammer-Test der sozialen Interaktion (Abbildung 2A)

1. Führen Sie alle Experimente zwischen 7:00 und 15:00 Uhr durch.
2. Reinigen Sie den Tisch und schalten Sie das Licht ein (gedimmtes Licht).
3. Stellen Sie das Dreikammer-Instrument aus Plexiglas auf den Tisch, umgeben von Sichtschutzrollos.
4. Platzieren Sie eine Kamera über dem Kopf und stellen Sie sicher, dass sich alle drei Kammern im Aufnahmerahmen der Kamera befinden.
5. Übertragen Sie die Test- und fremden Mäuse in den Raum. Decken Sie die Käfige während des Transfervorgangs mit einer Stofffolie ab und entfernen Sie die Folie einmal im Raum.
6. Lassen Sie die Mäuse vor Beginn des Experiments mindestens 30 min bei gedimmtem Licht im Raum.
7. Gewöhnung
   1. Halten Sie die drei Kammern während der Gewöhnungsphase leer.
   2. Wählen Sie zum Starten eine Testmaus aus und schreiben Sie die Identifikationsnummer auf das Whiteboard.
   3. Platzieren Sie dann die Testmaus vorsichtig im mittleren Fach, während die Schiebetüren noch geschlossen sind.
   4. Starten Sie die Aufnahme und öffnen Sie die Türen, damit die Testmaus die drei leeren Kammern erkunden kann.
   5. Verlassen Sie den Raum und lassen Sie die Testmaus 10 Minuten lang an das Gerät gewöhnen.
   6. Nachdem die Gewöhnung 10 Minuten abgeschlossen ist, kehren Sie in den Raum zurück. Führen Sie die Testmaus vorsichtig in das Mittelfach und schließen Sie die Schiebetüren.
   7. Zeigen Sie das Whiteboard an und stoppen Sie die Kamera.
8. Sozialer Ansatz (neuartiges Drahtkäfig-Objekt versus neuartige fremde Maus 1)
   1. Positionieren Sie zwei Drahtkäfige in der linken und rechten Kammer. Platzieren Sie diese Käfige diagonal gegenüberliegend in den Ecken jeder Kammer, wobei Sie einen Abstand von 5 cm zur Wand sicherstellen, damit die Testmaus um die Käfige herumlaufen kann. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Käfige nicht direkt zu den Kammertüren zeigen.
   2. Wähle eine fremde Maus aus und setze sie in einen der Drahtkäfige ein, während im anderen Drahtkäfig keine Maus anwesend ist.
   3. Um den Test zu starten, drücken Sie die Aufnahmetaste und entfernen Sie beide Schiebetüren. Verlassen Sie den Raum.
   4. Lassen Sie die Testmaus 10 Minuten lang einen leeren Drahtkäfig in einer Kammer und einen Käfig mit einer fremden Maus (neuartige fremde Maus 1 oder S1) in der anderen Kammer erkunden.
   5. Nach 10 Minuten kehren Sie in den Raum zurück. Zeigen Sie das Whiteboard in die Kamera und beenden Sie die Aufnahme.
   6. Setzen Sie die Maus wieder in das mittlere Fach ein und schließen Sie die Verbindungstüren.
      HINWEIS: Entfernen Sie die Drahtkäfige nach Abschluss des sozialen Ansatzes nicht aus dem Setup, damit sie während der gesamten Aufgabe in der gleichen Position bleiben.
9. Präferenz für soziale Neuheit (neuartige fremde Maus 2 versus neuartige Maus 1)
   1. Platzieren Sie eine neue, nie anzutreffende Maus auf dem zuvor leeren Drahtkäfig (Novel Stranger Mouse 2 oder S2).
      HINWEIS: S2 muss aus einem anderen Heimkäfig als S1 stammen.
   2. Starten Sie die Aufnahme und öffnen Sie die miteinander verbundenen Türen, damit die Testmaus das Gerät 10 Minuten lang erkunden kann.
   3. Verlassen Sie den Raum. Die Testmaus wird zwei Drahtkäfige erkunden: einen mit der zuvor angetroffenen S1-Maus aus der Phase der sozialen Annäherung und den anderen mit der neu eingeführten S2-Maus.
   4. Nach 10 Minuten kehren Sie in den Raum zurück. Zeigen Sie das Whiteboard in die Kamera und beenden Sie die Aufnahme.
   5. Bringen Sie alle Mäuse (Test- und neuartige fremde Mäuse) in ihre Käfige zurück.
   6. Reinigen Sie die Kammern und Drahtkäfige gründlich mit geruchsfreiem Desinfektionsmittel. Stellen Sie sicher, dass das Gerät getrocknet ist, bevor Sie es für das nächste Experiment verwenden.
   7. Wiederholen Sie den Versuch für alle verbleibenden Testmäuse.
      HINWEIS: Wechseln Sie die Platzierung der Käfige mit S1- und S2-Mäusen zwischen der linken und rechten Kammer für die verschiedenen Testmäuse ab. Das Gegengewicht verhindert eine verzerrte Bevorzugung einer bestimmten Kammer der Apparatur.
   8. Bringen Sie die Mäuse nach dem Test in die Haltungseinrichtung zurück.
   9. Stoppen Sie die Kamera zwischen jedem Teil des Tests und starten Sie sie neu, was zu 3 mal 10-minütigen Videos pro Testmaus führt.

6. Scoring und statistische Analyse

1. Notwendige Ausrüstung
   1. Verwenden Sie zwei Stoppuhren und einen Computer oder Laptop mit der folgenden Software: Microsoft Excel, GraphPad Prism und andere Statistikprogramme wie SPSS zum Bewerten, Zeichnen der Diagramme und zur statistischen Analyse.
2. Bewertung der Selbstpflege
   HINWEIS: Wenn eine Maus in einer angenehmen Umgebung platziert wird, kann ein stressarmes, spontanes Selbstpflegeverhalten beobachtet werden. Typischerweise beginnen Mäuse die Fellpflege, indem sie ihre Pfoten um die Nase und die Schnurrhaare lecken (Stadium I). Darauf können die Stadien II und III folgen, in denen die Maus ihr gesamtes Gesicht und ihren Kopf mit ihren Pfoten abwischt. Im Stadium IV fährt die Maus fort, ihren Körper zu putzen und ihren Schwanz zu lecken¹⁴. Angesichts der Seltenheit, mit der die Ohren (Stadium III) und Schwänze (Stadium IV) innerhalb eines 10-minütigen Testzeitraums gepflegt wurden, und mit dem Ziel, die Klarheit der manuellen Analyse zu verbessern, wurde das Selbstpflegeverhalten in zwei Haupttypen eingeteilt: rostale Fellpflege und kaudale Fellpflege. Die Rostralpflege umfasst Aktivitäten wie Pfotenlecken, Nasenpflege und gründliches Waschen von Gesicht, Ohren und Kopf. Bei der kaudalen Fellpflege wird der Körperteil geleckt, der Bereiche wie Bauch, Rücken, Hinter- und Genitalbereich sowie den Schwanz bedeckt.
   1. Beobachte das Pflegeverhalten genau und zeichne die Kämpfe auf. Eine individuelle Pflegesitzung findet statt, wenn die Maus eine einzige Instanz der Selbstpflege durchführt. Betrachten Sie eine Pflegesitzung von dem Moment an, in dem sie beginnt, bis zu ihrem Ende, unabhängig von den spezifischen Pflegeverhaltensweisen.
   2. Wenn die Testmaus ihre Fellpflege für einige Sekunden unterbricht, ohne die Position zu ändern, wird sie als Teil desselben Kampfes gezählt. Wenn die Maus jedoch mit der Fellpflege aufhört und zu erkunden beginnt, gehen Sie davon aus, dass die Fellpflege beendet ist.
   3. Zeichnen Sie außerdem nur dann eine vollständige Pflegesitzung auf, wenn die Maus kontinuierlich von vorne nach hinten (von Stufe I bis Stufe IV) putzt.
   4. Dokumentieren Sie die gesamte Putzzeit, die Anzahl der Putzvorgänge und die Anzahl der während des 10-minütigen Testzeitraums beobachteten vollständigen Fellpflege, indem Sie die Beobachtungen in den Intervallen 2 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten markieren.
3. Drei-Kammer-Test für soziale Interaktion
   Die Analyse bestimmt den Zeitpunkt und die Häufigkeit der Schnüffelinteraktion mit jeder Maus (neuartiges S1 und leerer Käfig für soziale Annäherung und S1 und neuartiges S2 für die Präferenz für soziale Neuheit).
   1. Verwenden Sie zwei Timer, um die Interaktionszeit mit der Maus in jedem Käfig und die Gesamtzeit in jeder Kammer aufzuzeichnen. Notieren Sie für jeden Teil des Tests (sozialer Ansatz und Präferenz für soziale Neuheit), wie oft die Testmaus jede Kammer betritt (Gesamteinträge).
   2. Bestimmen Sie die Zeit in den Fächern anhand des Vorhandenseins des Körpers der Testmaus in einer der Kammern (vier Pfoten müssen eintreten).
   3. Erfassen Sie die Interaktionszeit(en), wenn die Testmaus an der neuen fremden Maus schnüffelt (direkter Gesichtskontakt oder Schnüffeln am Schwanz der fremden Maus) oder am leeren Käfig schnüffelt. Betrachten Sie das Sitzen auf dem Käfig nicht als Interaktion.
   4. Bei 2 min, 5 min und 10 min aufnehmen. Führen Sie eine zeitabhängige Analyse durch.
   5. Vergleichen Sie den Sociability Discrimination Index (DI) innerhalb der Gruppen.
      HINWEIS: DI wird wie folgt berechnet: DI = (Zeit, die mit der S1-Maus interagiert - Zeit, die mit dem leeren Käfig interagiert)/Gesamtinteraktionszeit x 100. Während des Teils der sozialen Neuheit interagieren Kontrollmäuse mehr mit S2 (unbekannte Maus) als mit S1 (vertraute Maus). Die soziale Neuheit (soziales Gedächtnis) DI wird berechnet: DI = (Zeit der Interaktion mit der S2-Maus - die Zeit der Interaktion mit der bekannten Maus (S1)) / die gesamte Interaktionszeit x 100.
4. Statistische Analyse
   1. Verwenden Sie einen zweiseitigen, ungepaarten T-Test für Schüler, um die p-Werte mit einem signifikanten Niveau von p < 0,05 für die Selbstputzzeit, die Läufe und die vollen Brüche zu berechnen, bei denen es nur zwei Gruppen gibt.
   2. Verwenden Sie für den Drei-Kammern-Test den T-Test eines Schülers, um die statistische Signifikanz der Gesamteinträge zwischen zwei Gruppen zu berechnen. Wenn die Annahme der gleichen Varianz der Daten zwischen den Gruppen nicht erfüllt ist (Levene-Test p < 0,05), führen Sie einen Welch-T-Test durch, um die Abweichung anzupassen und die Mittelwerte unabhängiger Gruppen zu vergleichen.
      HINWEIS: Durch die Messung der Gesamtzahl der Einträge wird die Gesamtaktivität von Mäusen bewertet. Potenzielle Bedenken können auftreten (in Bezug auf motorische Beeinträchtigungen und hohe Angstzustände bei Mäusen), wenn die Versuchsgruppe den Dreikammerapparat signifikant weniger erforscht als die Kontrollgruppe. Um dies anzugehen, sollten Sie erwägen, die motorische Funktion und das angstähnliche Verhalten mit depressiven Verhaltenstests zu bewerten, da eine verminderte Exploration auf diese Zustände zurückzuführen sein könnte⁴².
   3. Verwenden Sie eine gemischte ANOVA, um die Zeit in jeder Kammer und die Wechselwirkungszeit für jeden Test zu vergleichen. Abhängig von der Anzahl der Gruppen und Faktoren verwenden Sie eine gemischte Zwei-Wege-ANOVA (2 Faktoren: Genotyp und Seite der Kammer oder Interaktion mit leerem Käfig und S1 oder S1 und S2) oder eine gemischte Drei-Wege-ANOVA (3 Faktoren: Genotyp, Behandlung und Seite der Kammer oder Interaktion mit leerer und S1 oder S1 und S2). Diese Analyse ist besonders nützlich, um die statistisch signifikante soziale Interaktion von Mäusen zwischen verschiedenen Faktoren aufzudecken.
      HINWEIS: Zu diesen Faktoren gehören der Haupteffekt des Genotyps (Einfluss verschiedener genetischer Hintergründe auf das Sozialverhalten), der Haupteffekt der Interaktion mit dem Käfig (Schnüffeln und Bevorzugung einer neuen fremden Maus gegenüber einem leeren Käfig oder einer zuvor angetroffenen Maus), der Haupteffekt der Behandlung (Einfluss verschiedener medikamentöser Behandlungen auf das Sozialverhalten von Mäusen) und die Interaktion mit der Genotyp-x-Behandlung (zeigen, wie sich die angewandte Behandlung auf den Genotyp auswirkt).
   4. Verwenden Sie anschließend den Post-hoc-Test von Bonferroni (α-Niveau auf 0,05), um den Vergleich zwischen verschiedenen Gruppen weiter zu bewerten.

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Ergebnisse

Das Säugetierziel Rapamycin (mTOR) spielt eine entscheidende Rolle im Zentralnervensystem (ZNS), indem es die De-novo-Proteinsynthese reguliert und die Autophagie unterdrückt⁴³. Eine Dysregulation des mTOR-Signalwegs und der synaptischen Proteinsynthese wurde mit ASD²⁸ in Verbindung gebracht. Genomweite Studien an ASD-Patienten haben verschiedene ASD-assoziierte Genmutationen identifiziert, einschließlich solcher, die Proteine b...

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Diskussion

Die meisten ätiologischen Ursachen, pathologischen Veränderungen und biologischen Marker von ASD sind nicht bekannt oder verfügbar. Die ASS-Diagnose basiert in erster Linie auf zwei etablierten Gruppen klinischer Symptome: anhaltende Defizite in der sozialen Kommunikation und übermäßige sich wiederholende Verhaltensweisen 18,19,55. Angesichts der Tatsache, dass es sich bei ASS um eine Spek...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4'' Teklad Corncob Bedding	Harlan, TEKLAD	7092-7097	The raw stock for corncob bedding products  is 100% corncob. No other components or additives are used.
HD Video Recording Cameratraditional Video Camera	Sony	HDRCX405	50 Mbps XAVC S1 1920 x 1080 at 60P, AVCHD and MP4 codecs. 30x Optical / 60x Clear Image Zoom to get closer to the action. 26.8 mm wide angle ZEISS Lens.
Nitrile Powder Free Examination Gloves	Aurelia, Transform	ASTM D6319-00	Tested for use with Chemotherapy drugs per ASTM D6978
Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	AN75PLF	AN75 Mouse 7½” W x 11½” L x 5” H
TÅGARP floor lamp and bulbs	IEKA	604.640.49	Bulbs are 23 W 120 V.
Ugo Basile Sociability Apparatus	Stoelting	60450	The Sociability Apparatus (3-chambered social test) is a valuable tool to study social behaviour in mice.
Versa-Clean	Fisherbrand	PVCLN04	Cleaning agent
Whiteboard and  Low Odor Dry Erase Marker	EXPO	NA	Dry erase markers in bold black