Strategie per valutare i comportamenti simil-autistici nei topi

Riepilogo

I modelli di roditori sono strumenti preziosi per studiare i comportamenti fondamentali legati al disturbo dello spettro autistico (ASD). In questo articolo, esponiamo due test comportamentali per modellare le caratteristiche principali dell'ASD nei topi: l'auto-toelettatura, che valuta il comportamento ripetitivo, e il test di interazione sociale a tre camere, che documenta le menomazioni sociali.

Abstract

Il disturbo dello spettro autistico (ASD) è una condizione neurobiologicamente complessa con un'eziologia genetica eterogenea. Clinicamente, l'ASD viene diagnosticato da disturbi della comunicazione sociale e comportamenti restrittivi o ripetitivi, come sbattere le mani o allineare oggetti. Questi modelli comportamentali possono essere osservati in modo affidabile in modelli murini con mutazioni genetiche legate all'ASD, rendendoli strumenti molto utili per studiare i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti nell'ASD. Comprendere come i cambiamenti genetici influenzano la neurobiologia e i comportamenti osservati nell'ASD faciliterà lo sviluppo di nuovi composti terapeutici mirati per migliorare i disturbi comportamentali di base. Il nostro laboratorio ha impiegato diversi protocolli che comprendono procedure di formazione e test ben descritte che riflettono un'ampia gamma di deficit comportamentali legati all'ASD. Qui, descriviamo in dettaglio due saggi per studiare le caratteristiche principali dell'ASD nei modelli murini: l'auto-toelettatura (una misura del comportamento ripetitivo) e il test di interazione sociale a tre camere (una misura dell'approccio all'interazione sociale e della preferenza per la novità sociale).

Introduzione

Il disturbo dello spettro autistico (ASD) è un disturbo dello sviluppo cerebrale che manifesta disturbi della comunicazione o dell'interazione sociale e modelli di comportamenti o interessi ristretti e ripetitivi ^1,2. Nel 2022, a circa 1 bambino su 100 è stato diagnosticato l'ASD a livello globale³. Secondo i Centers for Disease Control and Prevention (CDC, USA), la prevalenza dell'ASD è aumentata del 30% dal 2008 ed è aumentata di oltre 2 volte dal 2000 ^4,5. Gli individui con ASD possono anche mostrare comorbilità, come disabilità intellettiva (ID) (35,2%, QI ≤ 70), disturbo da deficit di attenzione/iperattività (ADHD) (50%-70%) e altre sindromi genetiche ^2,4,6.

L'uso di modelli animali nella ricerca sull'ASD, in particolare i roditori, ha fornito informazioni significative sull'impatto di vari fattori ambientali, tra cui dieta, farmaci, esercizio fisico e arricchimento 7,8,9,10, nonché mutazioni genetiche come Shank, Fmr1, Mecp2, Pten e mutante Tsc 11,12,13, sui sintomi dell'ASD. I modelli murini sono comunemente usati per studiare l'ASD a causa della loro natura sociale e delle caratteristiche genetiche, biochimiche ed elettrofisiologiche condivise con gli esseri umani. Ad esempio, attraverso la delezione di un gene specifico (come Shank3, Fmr1, Cntnap2 e Pten), i comportamenti sociali aberranti e ripetitivi possono essere ricapitolati, fornendo una forte validità dello studio 14,15,16. Qui, forniamo protocolli per lo studio dei parallelismi tra i modelli genetici animali e i sintomi dell'ASD umano¹⁷. Descriviamo il test di auto-toelettatura e il test di interazione sociale a tre camere, che riflettono due sintomi principali nei pazienti con ASD, vale a dire modelli di comportamento limitati e ripetitivi e disturbi dell'interazione sociale (comunicazione), rispettivamente.

Sulla base del DSM-V (Manuale diagnostico e statistico dei disturbi mentali dell'American Psychiatric Association^5th Edition) e dell'ICD-11 (International Classification of Diseases 11th Revision), i pazienti con ASD si impegnano in modelli di comportamento limitati, ripetitivi e stereotipati, in particolare comportamenti ripetitivi non funzionali incentrati sul corpo (BFRB), come dondolare, stimming, mangiarsi le unghie, tirare i capelli, stuzzicare la pelle o camminare in punta di piedi^{18, 19}. Negli animali, il comportamento ripetitivo si manifesta con un'autotoelettatura prolungata e ripetitiva. La toelettatura è una delle attività innate più comuni tra i roditori, con circa il 40% del loro tempo di veglia trascorso sulla toelettatura^20,21. È istintivo per i topi leccarsi la pelle o il pelo per rimuovere lo sporco estraneo dalla superficie del corpo, il che serve a mantenere la pulizia del corpo, prevenire lesioni, rimuovere i parassiti e regolare la temperatura. La toelettatura è classificata in due tipi: toelettatura sociale (allo-grooming), che coinvolge la toelettatura da parte di un altro topo, e auto-grooming. L'auto-grooming mostra un pattern di sequenziamento stereotipato e conservato costituito da quattro stadi (per lo più discreti e non sequenziali)^22,23. Nella fase I (ictus ellittico), i topi iniziano la toelettatura prima leccando entrambe le zampe e poi pulendo intorno al naso con le zampe. Nella fase II (ictus unilaterale), i topi usano le zampe per pulirsi il viso in modo asimmetrico. Nella fase III (ictus bilaterale), i topi si puliscono simmetricamente la testa e le orecchie. Nella fase IV (leccamento del corpo), i topi passano al leccamento del corpo muovendo la testa all'indietro e possono estendere la toelettatura alla coda e ai genitali. Quando i topi vengono collocati individualmente in una gabbia trasparente, il comportamento di auto-toelettatura può essere facilmente riconosciuto e osservato. I topi aumentano il comportamento di auto-cura di fronte a stress, dolore o disgregazione sociale, rendendo il test di auto-cura cruciale nella ricerca sui disturbi neurologici²². Diversi modelli murini di ASD, compresi quelli con mutazioni genetiche (come Fmr1^−/y, Shank3B^−/-, NL1^−/-), interventi farmacologici (come DO34, PolyI:C) e specifici ceppi consanguinei (come BTBR e C58/J), hanno dimostrato un comportamento di auto-toelettatura eccessivamente ripetitivo 24,25,26,27.

Le alterazioni del comportamento sociale servono come uno dei criteri per la valutazione dell'ASD. Secondo il DSM-V e l'ICD-11, i pazienti con ASD mostrano disturbi persistenti della comunicazione sociale e dell'interazione sociale^{1 8,19}. Questi possono manifestarsi in deficit di comunicazione verbale e non verbale (ad esempio, contatto visivo, gesti ed espressioni facciali anormali), mancanza di condivisione di interessi ed emozioni con gli altri, inconsapevolezza dei segnali contestuali sociali o difficoltà nello sviluppo di relazioni. In linea con i sintomi di compromissione sociale, sono stati progettati e ottimizzati vari compiti comportamentali per valutare le interazioni sociali nei topi, come il test di interazione sociale diretta, l'approccio sociale a tre camere e la preferenza per il test di novità sociale e l'analisi delle vocalizzazioni ultrasoniche (USV)^16,28. Il test di interazione sociale a tre camere è un esperimento ampiamente utilizzato per valutare i comportamenti correlati all'ASD 17,29,30,31. L'apparato comprende tre camere collegate; Le camere sinistra e destra contengono una gabbia metallica che può essere vuota o occupata da un topo, consentendo al topo di prova di interagire liberamente con entrambe le gabbie. Due misurazioni aiutano a valutare diversi aspetti del comportamento sociale nel topo di prova durante l'esperimento a tre camere. In primo luogo, il topo di prova viene valutato per il tempo trascorso interagendo con la gabbia vuota (nuovo oggetto) rispetto a una gabbia che contiene un nuovo topo. Questa parte del compito fornisce informazioni sulla socievolezza del topo. Successivamente, un topo sconosciuto viene inserito nella gabbia metallica precedentemente vuota. La differenza di tempo nell'interazione del topo di prova tra il topo sconosciuto e quello familiare misura la preferenza per la novità sociale. In questa parte del compito, un mouse di controllo preferisce interagire con un sconosciuto piuttosto che con il topo incontrato in precedenza, che era già presente nella parte di socialità del test. I deficit nell'interazione sociale e la diminuzione della motivazione nell'interagire con nuovi topi si trovano generalmente nel modello murino di ASD. Il test a tre camere si è dimostrato robusto sin dalla sua invenzione. È stato utilizzato per studiare i fenotipi sociali in vari modelli murini di ASD, tra cui Fmr1^-/-, Shank3B^-/-, Cntnap2^-/-, e il ceppo inbred BTBR 32,33,34,35,36.

I due test utilizzano il comportamento naturale e spontaneo dei topi come strumenti meritevoli per studiare il comportamento simile all'ASD. Poiché sono considerati test a basso stress, è possibile condurre entrambi i test all'interno dello stesso gruppo di topi per misurare il comportamento simile all'ASD, con il test di auto-toelettatura eseguito per primo e il test di interazione sociale a tre camere nei giorni successivi. I protocolli che forniamo presentano uno strumento essenziale per la valutazione del comportamento ASD-like e lo sviluppo di nuove terapie 29,30,31. In definitiva, contribuirebbero a migliorare i risultati per le persone affette da ASD.

Protocollo

Tutte le procedure e gli esperimenti che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dai regolamenti del Facility Animal Care Committee (FACC), che seguono le linee guida stabilite dal Canadian Council on Animal Care, dal McGill University Animal Care Committee e dall'Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) del NIH. Il numero di garanzia del servizio sanitario pubblico (PHS) per la McGill University è F-16-00005 (A5006-01).

1. Preparazione degli animali

1. Topi di prova: selezionare topi maschi e/o femmine di 2-3 mesi (da 8 a 13 settimane). Tutti i topi utilizzati negli esperimenti qui sono di origine C57BL/6J. Per il comportamento di auto-toelettatura e i saggi di interazione sociale a tre camere, l'intervallo generalmente accettabile di topi per gruppo suggerito è n = 10-15, con un minimo di n = 8.
   1. Per i topi geneticamente modificati, aggiungere sempre compagni di cucciolata wildtype come controllo. Abbina il gruppo di controllo con il gruppo sperimentale in termini di background genetico, età, sesso e condizioni abitative. I topi transgenici omozigoti utilizzati in questo studio sono di dimensioni normali e non mostrano anomalie fisiche grossolane.
      NOTA: In alcuni casi più complessi, i ricercatori potrebbero essere interessati a valutare più di due genotipi (ad esempio, wild type, eterozigote, omozigote), a studiare gli effetti dei farmaci (ad esempio, trattamento, trattamento con veicolo, non trattamento) o a confrontare maschi e femmine. Quando si lavora con topi femmine, è fondamentale tenere conto dei loro cicli estrali. Sebbene i cicli estrali femminili non influenzino in modo significativo i comportamenti di auto-cura, gli studi hanno indicato che questi cicli possono influenzare l'approccio sociale e la preferenza per la novità sociale^37,38.
2. Topi estranei: usa almeno 8 topi di tipo selvatico per il test a tre camere. Usa 2 gabbie, 4 topi per gabbia, che corrispondono all'età, al sesso e allo stesso background genetico (C57BL/6J) dei topi di prova. Assicurati che i topi estranei non abbiano avuto precedenti interazioni con i topi di prova.
3. Alloggiamento: Gruppo ospita 3-5 topi per gabbia domestica (71/2" L x 111/2" L x 5" H gabbie di plastica per topi) e mantiene un ciclo luce/buio di 12 ore. Fornire ai topi l'accesso al cibo e all'acqua nella gabbia ad libitum.
   NOTA: Nelle stanze di alloggio in questo studio, le luci si accendono alle 7:00 del mattino.
4. Trasferire i topi alla struttura di test comportamentali sugli animali per un minimo di 1 settimana prima degli esperimenti^39,40.
5. Test di manipolazione e comportamentali: condurre il test in un momento costante della giornata. Regolare l'ora di inizio in base al ciclo di luce nelle stanze dell'alloggiamento del mouse. Innanzitutto, trasferisci i topi nella sala prove e consenti loro di abituarsi alla sala prove per un minimo di 30 minuti in condizioni di illuminazione soffusa prima di iniziare i test comportamentali.
   NOTA: In questo studio, gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti di routine tra le 7:00 e le 15:00 (rispetto alla luce accesa alle 7:00 e alla luce spenta alle 19:00). Quindi, l'inizio effettivo del test comportamentale avviene intorno alle 8 del mattino.

2. Preparazione della stanza e dell'attrezzatura

1. Prepara una piccola stanza con una superficie complessiva compresa tra 16-36 piedi (5-12 m²; 6 m² stanza in questo studio). Mantieni temperatura, illuminazione (illuminazione attenuata regolabile) e livelli di rumore costanti (idealmente insonorizzati) per tutti gli esperimenti.
   1. Se si utilizzano lampade da terra (lampadine da 23 W, 120 V), posizionarle in posizioni simmetriche e su ciascun lato, ad almeno 1 m di distanza dall'apparecchio a tre camere, in modo da illuminare le due camere laterali in modo uniforme.
2. Posizionare l'apparecchio su un tavolo bianco portatile. Per l'esperimento di auto-toelettatura, utilizzare gabbie pulite e trasparenti (gabbie di plastica per topi da 71/2" L x 111/2" L x 5" A); Utilizzare una gabbia per topo di prova. Riempi le gabbie con circa 1 cm di lettiera fresca senza materiale di nidificazione. Utilizzare lo stesso tipo di lettiera della gabbia domestica (qui, lettiera di pannocchia di mais fresca ([1/4" lettiera di pannocchia]).
   NOTA: Le gabbie devono avere le stesse dimensioni delle gabbie domestiche, con un coperchio del filtro posizionato sopra, ma senza una griglia metallica (che normalmente viene utilizzata per contenere bottiglie e consegna di cibo).
3. Per l'esperimento sociale, utilizzare un set di apparecchi a tre camere⁴¹. Ogni camera misura 20 cm x 40 cm x 22 (h) cm ed è circondata da pareti in plexiglas. Ogni camera laterale è accessibile dal centro tramite porte scorrevoli trasparenti che possono essere rimosse (5 x 8 cm). Utilizzare due gabbie metalliche (diametro: 7 cm, altezza: 15 cm; con coperchio (vuoto o con in mano per topi estranei). La gabbia è rialzata e racchiusa da barre lisce in filo di acciaio inox (diametro barra: 3 mm, interasse barra: 7 mm). Non includere la seduta sopra le gabbie come tempo di interazione.
   1. Se nell'esperimento sono inclusi sia topi maschi che femmine, etichettare ogni gabbia metallica per la sua funzione dedicata per ridurre al minimo la contaminazione incrociata.
4. Installa le fotocamere dall'alto o frontali su treppiedi per le registrazioni video. Assicurarsi che le fotocamere siano completamente cariche e che dispongano di spazio di archiviazione sufficiente.
5. Tra un esperimento e l'altro sui topi, pulire accuratamente la configurazione a tre camere e le gabbie metalliche con un detergente inodore (qui, Versa-Clean). Diluire il detergente in acqua di rubinetto in un rapporto di 1:40, applicarlo sulla superficie sporca e asciugare le superfici con un tovagliolo di carta prima del test successivo per ridurre al minimo l'odore residuo del mouse precedente.
   NOTA: L'alcol etilico (70%) o altri disinfettanti con odori non devono essere utilizzati per pulire l'apparecchio durante i test di interazione sociale, poiché potrebbero influire sul comportamento sociale dei roditori.
6. Utilizzare tende per la privacy, come pannelli di plastica bianca, che possono essere posizionati intorno all'apparecchio per eliminare i segnali esterni della stanza.
7. Prepara una piccola lavagna e un pennarello. Registra le informazioni essenziali sulla lavagna, tra cui il numero del mouse, il titolo dell'esperimento, la data e l'ora dell'esperimento.
   NOTA: La lavagna viene presentata alla telecamera al termine della registrazione per evitare che la persona che segna conosca il numero del mouse prima di valutare il comportamento del mouse. Lo studio ha assicurato che il comportamento di punteggio individuale rimanesse cieco ai gruppi sperimentali per ridurre al minimo i potenziali bias.

3. Movimentazione

1. Eseguire le procedure di manipolazione per tre giorni consecutivi prima dell'inizio degli esperimenti comportamentali.
2. Condurre sessioni di manipolazione nella stessa sala di prova a un orario coerente, idealmente al mattino quando i topi sono più attivi.
3. In ciascuno dei 3 giorni, porta i topi nella sala di prova e lasciali indisturbati per 30 minuti in penombra per acclimatarsi.
4. Dopo un periodo di acclimatazione di 30 minuti, aprire la gabbia e introdurre una mano guantata nella gabbia. Lasciare che i topi esplorino la mano per 1 minuto.
5. Raccogli delicatamente i topi sulla mano (o usa un piccolo tubo di cartone per raccoglierli), tenendoli liberamente. Lasciare che i topi esplorino la mano e il polso per 1-2 minuti. Nei casi in cui un mouse è nervoso o aggressivo, posizionalo sulla griglia e lascialo ricomporre.
6. Continuare a maneggiare finché il mouse non si sente a proprio agio rimanendo sulla mano. Cambiare sempre i guanti prima di introdurre le mani nella gabbia successiva.
7. Dopo aver maneggiato ogni gabbia di topi, posizionali delicatamente nella loro gabbia domestica, quindi ripeti la procedura.
8. Indossa guanti nuovi e maneggia i topi estranei quando tutti i topi sperimentali e di controllo sono stati maneggiati per evitare di influenzare i topi di prova con messaggi profumati.
9. Gestisci i topi estranei allo stesso modo.
10. Opzionale: Abituare i topi estranei alla gabbia metallica e all'apparecchio a tre camere per 10-15 minuti.
    NOTA: Questa sessione di assuefazione aiuta a ridurre l'agitazione e i comportamenti aberranti nei topi estranei durante il test a tre camere. Tuttavia, per il test a tre camere, questo studio considera solo il comportamento di approccio sociale (annusare) della gabbia avviato dal topo di prova, indipendentemente dalla presenza o meno di un topo estraneo. L'annusare reciprocamente da parte del topo estraneo non è osservabile in modo affidabile in questo test e, pertanto, non viene conteggiato. A causa di questa limitazione del test a tre camere e per ridurre al minimo la contaminazione incrociata dei segnali chimici (come gli odori), in questo caso, i topi estranei non avevano precedenti esperienze con la gabbia metallica e l'apparato prima dell'inizio dell'esperimento.

4. Metodo 1: Auto-grooming per comportamenti ripetitivi (Figura 1A)

1. Esegui tutti gli esperimenti comportamentali tra le 7:00 e le 15:00.
2. Accendere le luci soffuse, come descritto sopra. Pulisci il tavolo e allestisci la stanza.
3. Preparare ogni gabbia di prova con un sottile strato di lettiera fresca (come descritto al punto 2.2).
4. Metti 1-2 gabbie sul tavolo, separate l'una dall'altra e dall'ambiente della stanza da paraocchi di plastica bianca.
5. Posiziona una telecamera davanti a ogni gabbia per catturare il mouse di prova.
6. Trasferisci tutti i topi nella stanza e copri le gabbie con un foglio di tessuto durante il processo di trasferimento per evitare stress.
7. Rimuovere il foglio una volta che i topi sono stati posizionati nella sala prove, lasciandoli nella stanza per almeno 30 minuti con luci soffuse prima dell'inizio dell'esperimento.
8. All'inizio del test, annotare il numero di identificazione del mouse e le informazioni sul test su una lavagna (come descritto nel passaggio 2.7).
9. Avviare la registrazione e posizionare il mouse di prova nella gabbia di prova.
10. Lasciare la stanza durante la sessione di registrazione di 20 minuti.
11. Per ogni test, considera i primi 10 minuti come assuefazione. Utilizzare i seguenti 10 minuti per osservare e valutare il comportamento di toelettatura (vedere la sezione 6).
12. Dopo 20 minuti, torna in camera. Presenta la lavagna alla fotocamera e interrompi la registrazione.
13. Riposiziona delicatamente il mouse di prova nella gabbia di casa e ripeti l'esperimento.
    NOTA: Controbilanciare l'ordine dei test tra gruppi sperimentali e di controllo per ridurre le varie influenze esterne.
14. Al termine degli esperimenti, riporta i topi nella loro stanza di alloggio.

5. Metodo 2: Test di interazione sociale a tre camere (Figura 2A)

1. Esegui tutti gli esperimenti tra le 7:00 e le 15:00.
2. Pulisci il tavolo e accendi le luci (luci soffuse).
3. Posiziona lo strumento in plexiglass a tre camere sul tavolo circondato da tende per la privacy.
4. Posizionare una telecamera sopra la testa, assicurandosi che tutte e tre le camere si trovino nel fotogramma di registrazione della telecamera.
5. Trasferisci il test e i topi estranei nella stanza. Coprire le gabbie con un foglio di tessuto durante il processo di trasferimento e rimuovere il foglio una volta nella stanza.
6. Lasciare i topi nella stanza per almeno 30 minuti con illuminazione soffusa prima dell'inizio dell'esperimento.
7. Assuefazione
   1. Tenere vuote le tre camere durante la fase di assuefazione.
   2. Per iniziare, seleziona un mouse di prova e scrivi il numero di identificazione sulla lavagna.
   3. Quindi, posizionare delicatamente il mouse di prova nello scomparto centrale mentre le porte scorrevoli sono ancora chiuse.
   4. Avvia la registrazione e apri le porte per consentire al mouse di prova di esplorare le tre camere vuote.
   5. Uscire dalla stanza e lasciare che il mouse di prova si abitui all'apparecchio per 10 minuti.
   6. Dopo 10 minuti di assuefazione, tornare nella stanza. Guidare delicatamente il mouse di prova verso lo scomparto centrale e chiudere le porte scorrevoli.
   7. Visualizza la lavagna e arresta la fotocamera.
8. Approccio sociale (nuovo oggetto gabbia metallica contro nuovo topo estraneo 1)
   1. Posizionare due gabbie metalliche nelle camere sinistra e destra. Posiziona queste gabbie diagonalmente l'una di fronte all'altra negli angoli di ciascuna camera, garantendo una distanza di 5 cm dalla parete, consentendo al topo di prova di correre intorno alle gabbie. Inoltre, assicurarsi che le gabbie non siano rivolte direttamente verso le porte della camera.
   2. Scegli un topo estraneo e introducilo in una delle gabbie metalliche, mentre nessun topo è presente nell'altra gabbia metallica.
   3. Per avviare il test, premere il tasto di registrazione e rimuovere entrambe le porte scorrevoli. Lascia la stanza.
   4. Lasciare che il topo di prova esplori una gabbia metallica vuota in una camera e una gabbia contenente un topo estraneo (il nuovo topo estraneo 1 o S1) nell'altra camera per 10 minuti.
   5. Dopo 10 minuti, torna in camera. Visualizza la lavagna sulla fotocamera e termina la registrazione.
   6. Reintrodurre il mouse nello scomparto centrale e chiudere le porte di interconnessione.
      NOTA: Non rimuovere le gabbie metalliche dalla configurazione dopo aver terminato il test di approccio sociale in modo che rimangano nella stessa posizione durante l'intera attività.
9. Preferenza per la novità sociale (novel stranger mouse 2 versus novel mouse 1)
   1. Posiziona un nuovo topo mai incontrato nella gabbia metallica precedentemente vuota (nuovo stranger mouse 2 o S2).
      NOTA: S2 deve provenire da una gabbia domestica diversa da S1.
   2. Avvia la registrazione e apri le porte interconnesse per consentire al mouse di prova di esplorare l'apparato per 10 minuti.
   3. Lascia la stanza. Il mouse di prova esplorerà due gabbie metalliche: una con il topo S1 precedentemente incontrato nella fase di approccio sociale e l'altra con il mouse S2 appena introdotto.
   4. Dopo 10 minuti, torna in camera. Visualizza la lavagna sulla fotocamera e concludi la registrazione.
   5. Riporta tutti i topi (test e nuovi topi più estranei) nelle loro gabbie domestiche.
   6. Pulire accuratamente le camere e le gabbie metalliche con un disinfettante inodore. Assicurarsi che l'apparecchio sia asciutto prima di utilizzarlo per l'esperimento successivo.
   7. Ripeti l'esperimento per tutti i topi di prova rimanenti.
      NOTA: Alternare il posizionamento delle gabbie con i mouse S1 e S2 tra le camere sinistra e destra per i diversi topi di prova. Il contrappeso impedisce una preferenza distorta verso una particolare camera dell'apparato.
   8. Dopo il test, riportare i topi alla struttura di stabulazione.
   9. Tra ogni parte del test, arrestare e riavviare la fotocamera, ottenendo video 3 volte 10 minuti per mouse di prova.

6. Punteggio e analisi statistica

1. Attrezzatura necessaria
   1. Usa due cronometri e un computer o laptop con il seguente software: Microsoft Excel, GraphPad Prism e altri programmi statistici come SPSS per il punteggio, la rappresentazione grafica dei grafici e l'analisi statistica.
2. Punteggio di auto-pulizia
   NOTA: Quando un topo viene collocato in un ambiente confortevole, si può osservare un comportamento di auto-toelettatura spontaneo a basso stress. In genere, i topi iniziano la toelettatura leccandosi le zampe intorno al naso e ai baffi (stadio I). Questo potrebbe essere seguito dalle fasi II e III, in cui il topo procede a pulirsi l'intera faccia e la testa con le zampe. Nella fase IV il topo continua a pulirsi il corpo e a leccarsi la coda¹⁴. Data la scarsa frequenza di toelettatura delle orecchie (stadio III) e della coda (stadio IV) entro un periodo di test di 10 minuti, e con l'obiettivo di migliorare la chiarezza dell'analisi manuale, il comportamento di auto-toelettatura è stato classificato in due tipi principali: toelettatura rostale e toelettatura caudale. La toelettatura rostrale prevede attività come leccarsi le zampe, la cura del naso e il lavaggio accurato del viso, delle orecchie e della testa. La toelettatura caudale include leccare la parte del corpo che copre aree come la pancia, la schiena, gli arti posteriori e l'area genitale, nonché la coda.
   1. Osserva attentamente il comportamento di toelettatura e registra gli attacchi. Una sessione di toelettatura individuale si verifica quando il mouse si impegna in una singola istanza di autopulitura. Prendi in considerazione una sessione di toelettatura dal momento in cui inizia fino a quando non si interrompe, indipendentemente dai comportamenti specifici di toelettatura coinvolti.
   2. Se il mouse di prova mette in pausa la toelettatura per alcuni secondi senza cambiare posizione, contalo come parte dello stesso incontro. Tuttavia, se il topo smette di pulirsi e inizia a esplorare, considera che l'incontro di toelettatura si è concluso.
   3. Inoltre, registra una sessione di toelettatura completa solo quando il mouse si pulisce continuamente dalla parte anteriore a quella posteriore (dalla fase I alla fase IV).
   4. Documentare il tempo totale di toelettatura, il numero di attacchi di toelettatura e il numero di attacchi di toelettatura completi osservati durante il periodo di test di 10 minuti, segnando le osservazioni a intervalli di 2 minuti, 5 minuti e 10 minuti.
3. Test di interazione sociale a tre camere
   L'analisi determina il tempo e la frequenza dell'interazione di sniffing con ciascun topo (nuovo S1 e gabbia vuota per l'approccio sociale, e S1 e nuovo S2 per la preferenza per la novità sociale).
   1. Usa due timer per registrare il tempo di interazione con il mouse in ogni gabbia e il tempo totale trascorso in ogni camera. Per ogni parte del test (approccio sociale e preferenza per la novità sociale), registrare il numero di volte in cui il topo di prova entra in ciascuna camera (totale delle voci).
   2. Determinare il tempo in compartimenti in base alla presenza del corpo del topo di prova all'interno di una delle camere (devono entrare quattro zampe).
   3. Registra il tempo di interazione quando il topo di prova annusa il nuovo topo sconosciuto (contatto diretto con il viso o annusando la coda del topo estraneo) o annusa la gabbia vuota. Non considerare il sedersi sulla parte superiore della gabbia come interazione.
   4. Registra a 2 minuti, 5 minuti e 10 minuti. Esegui un'analisi dipendente dal tempo.
   5. Confrontare l'indice di discriminazione della socialità (DI) all'interno dei gruppi.
      NOTA: DI viene calcolato come: DI = (tempo di interazione con il mouse S1 - tempo di interazione con la gabbia vuota)/tempo di interazione totale x 100. Durante la parte di novità sociale, i topi di controllo interagiranno più con S2 (topo sconosciuto) che con S1 (topo familiare). Viene calcolata la DI della novità sociale (memoria sociale): DI = (tempo di interazione con il mouse S2 - tempo di interazione con il mouse familiare (S1))/ tempo di interazione totale x 100.
4. Analisi statistica
   1. Usa il T-test di uno studente non accoppiato a due code per calcolare i valori p con un livello significativo impostato a p < 0,05 per il tempo di auto-cura, gli attacchi e gli attacchi completi, dove ci sono solo due gruppi.
   2. Per il test a tre camere, utilizzare il test T di uno studente per calcolare la significatività statistica delle voci totali tra due gruppi. Quando l'ipotesi della varianza uguale dei dati tra i gruppi non è soddisfatta (test di Levene p < 0,05), eseguire un test T di Welch per regolare la deviazione e confrontare le medie di gruppi indipendenti.
      NOTA: La misurazione delle voci totali valuta l'attività complessiva dei topi. Potenziali preoccupazioni possono sorgere (legate alla compromissione motoria e agli alti livelli di ansia dei topi) se il gruppo sperimentale esplora l'apparato a tre camere in modo significativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo. Per affrontare questo problema, si consideri la valutazione della funzione motoria e del comportamento ansioso con test comportamentali simili alla depressione, poiché una diminuzione dell'esplorazione potrebbe essere attribuita a queste condizioni⁴².
   3. Utilizzare un'ANOVA a vie miste per confrontare il tempo in ciascuna camera e il tempo di interazione per ogni test. A seconda del numero di gruppi e fattori, utilizzare un'ANOVA mista a due vie (2 fattori: genotipo e lato della camera, o interazione con gabbia vuota e S1, o S1 e S2), o un'ANOVA mista a tre vie (3 fattori: genotipo, trattamento e lato della camera, o interazione con vuoto e S1, o S1 e S2). Questa analisi è particolarmente utile per rivelare l'interazione sociale statisticamente significativa dei topi tra vari fattori.
      NOTA: Questi fattori includono l'effetto principale del genotipo (impatto di diversi background genetici sui comportamenti sociali), l'effetto principale dell'interazione con la gabbia (annusare e preferire un nuovo topo estraneo rispetto a una gabbia vuota o a un topo incontrato in precedenza), l'effetto principale del trattamento (impatto di vari trattamenti farmacologici sui comportamenti sociali dei topi) e l'interazione del trattamento genotipo x (rivelare come il trattamento applicato influisce sul genotipo).
   4. Successivamente, utilizzare il test post hoc di Bonferroni (livello α impostato a 0,05) per valutare ulteriormente il confronto tra diversi gruppi.

Risultati

Il bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) svolge un ruolo cruciale nel sistema nervoso centrale (SNC) regolando la sintesi proteica de novo e reprimendo l'autofagia⁴³. La disregolazione della via mTOR e della sintesi proteica sinaptica è stata implicata nell'ASD²⁸. Studi sull'intero genoma su pazienti con ASD hanno identificato varie mutazioni geniche associate all'ASD, comprese quelle che colpiscono le proteine coinvolte...

Discussione

La maggior parte delle cause eziologiche, dei cambiamenti patologici e dei marcatori biologici dell'ASD non sono noti o disponibili. La diagnosi di ASD si basa principalmente su due serie di sintomi clinici stabiliti: deficit persistenti nella comunicazione sociale e comportamenti ripetitivi eccessivi 18,19,55. Dato che l'ASD è un disturbo dello spettro che comprende un'ampia gamma di sintomi, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4'' Teklad Corncob Bedding	Harlan, TEKLAD	7092-7097	The raw stock for corncob bedding products  is 100% corncob. No other components or additives are used.
HD Video Recording Cameratraditional Video Camera	Sony	HDRCX405	50 Mbps XAVC S1 1920 x 1080 at 60P, AVCHD and MP4 codecs. 30x Optical / 60x Clear Image Zoom to get closer to the action. 26.8 mm wide angle ZEISS Lens.
Nitrile Powder Free Examination Gloves	Aurelia, Transform	ASTM D6319-00	Tested for use with Chemotherapy drugs per ASTM D6978
Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	AN75PLF	AN75 Mouse 7½” W x 11½” L x 5” H
TÅGARP floor lamp and bulbs	IEKA	604.640.49	Bulbs are 23 W 120 V.
Ugo Basile Sociability Apparatus	Stoelting	60450	The Sociability Apparatus (3-chambered social test) is a valuable tool to study social behaviour in mice.
Versa-Clean	Fisherbrand	PVCLN04	Cleaning agent
Whiteboard and  Low Odor Dry Erase Marker	EXPO	NA	Dry erase markers in bold black