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摘要

啮齿动物模型是研究与自闭症谱系障碍 （ASD） 相关核心行为的宝贵工具。在本文中，我们阐述了两种用于模拟小鼠 ASD 核心特征的行为测试:自我梳理，评估重复行为，以及三腔社交互动测试，记录社交障碍。

摘要

自闭症谱系障碍 （ASD） 是一种神经生物学复杂的疾病，具有异质性遗传病因。在临床上，ASD 是通过社交沟通障碍和限制性或重复性行为来诊断的，例如拍打手或排列物体。这些行为模式可以在具有 ASD 相关基因突变的小鼠模型中可靠地观察到，使其成为研究 ASD 潜在细胞和分子机制的非常有用的工具。了解遗传变化如何影响在 ASD 中观察到的神经生物学和行为将有助于开发新的靶向治疗化合物来改善核心行为障碍。我们的实验室采用了多种协议，包括描述良好的培训和测试程序，这些程序反映了与 ASD 相关的广泛行为缺陷。在这里，我们详细介绍了两种分析方法来研究小鼠模型中 ASD 的核心特征:自我梳理（重复行为的测量）和三室社交互动测试（社交互动方法和对社交新奇事物偏好的测量）。

引言

自闭症谱系障碍 （ASD） 是一种发育性脑部疾病，表现为社交沟通或互动障碍以及受限、重复的行为或兴趣模式 1,2。2022 年，全球约有 1/100 儿童被诊断出患有 ASD3。根据美国疾病控制和预防中心（CDC）的数据，自 2008 年以来，ASD 的患病率增加了 30%，自 2000 年以来增加了 2 倍多 4,5。ASD 患者也可能表现出合并症，例如智力障碍 （ID） （35.2%，智商 ≤ 70）、注意力缺陷/多动障碍 （ADHD） （50%-70%） 和其他遗传综合征 2,4,6。

在 ASD 研究中使用动物模型，尤其是啮齿动物，为各种环境因素的影响提供了重要的见解，包括饮食、药物、运动和富集 7,8,9,10，以及 Shank、Fmr1、Mecp2、Pten 和 Tsc 突变体等基因突变 11,12,13，关于 ASD 症状。小鼠模型通常用于研究 ASD，因为它们具有社会性质以及与人类共享的遗传、生化和电生理特征。例如，通过删除特定基因（如 Shank3、Fmr1、Cntnap2 和 Pten），可以概括异常的社交和重复行为，从而为研究提供强大的有效性 14,15,16。在这里，我们提供了研究动物遗传模型与人类 ASD 症状之间相似之处的方案17。我们描述了自我梳理和三腔社交互动测试，它们分别反映了 ASD 患者的两个核心症状，即受限、重复的行为模式和社交互动（沟通）障碍。

根据 DSM-V（美国精神病学协会精神障碍诊断和统计手册第5 版）和 ICD-11（国际疾病分类第 11 版），ASD 患者从事受限、重复和刻板的行为模式，特别是非功能性以身体为中心的重复行为 （BFRB），例如摇晃、刺激、咬指甲、拉毛、抠皮肤或踮脚尖走路18，19.在动物中，重复行为表现为长时间和重复的自我梳理。梳理毛发是啮齿动物最常见的先天活动之一，大约 40% 的醒来时间花在梳理上20,21。老鼠本能地舔舐自己的皮肤或皮毛，以去除体表的异物，这有助于保持身体清洁、防止受伤、清除寄生虫和调节温度。梳理分为两种类型:社交梳理 （allo-grooming） 和自梳理。自我梳理显示了一种刻板且保守的测序模式，由四个阶段（大部分是离散和非顺序的）组成22,23。在第一阶段（椭圆笔划），小鼠首先舔两只爪子，然后用爪子在鼻子周围梳理毛发。在 II 期 （单侧中风） 中，小鼠用爪子不对称地擦拭脸部。在 III 期 （双侧中风） 中，小鼠对称地擦拭头部和耳朵。在第四阶段（舔身体），小鼠通过向后移动头部过渡到舔身体，并可能将梳理扩展到尾巴和生殖器。当小鼠被单独放置在透明笼子中时，可以很容易地识别和观察自我梳理行为。当面临压力、痛苦或社交混乱时，小鼠会增加自我梳理行为，这使得自我梳理测试在研究神经系统疾病时至关重要22。不同的 ASD 小鼠模型，包括具有基因突变（如 Fmr1−/y、Shank3B−/-、NL1−/−）、药物干预（如 DO34、PolyI:C）和特异性自交系（如 BTBR 和 C58/J）的小鼠模型，已表现出过度重复的自我梳理行为 24,25,26,27。

社交行为的改变是评估 ASD 的标准之一。根据 DSM-V 和 ICD-11，ASD 患者表现出持续的社交沟通和社交互动障碍1 8,19。这些可能表现为语言和非语言沟通缺陷（即异常的眼神交流、手势和面部表情）、缺乏与他人分享兴趣和情感、对社会背景线索的无意识或难以发展关系。根据社交障碍症状，已经设计并优化了各种行为任务来评估小鼠的社交互动，例如直接社交互动测试、三室社交方法和社交新奇偏好测试，以及超声发声 （USV） 分析16,28。三室社交互动测试是一种广泛使用的实验，用于评估 ASD 相关行为 17,29,30,31。该装置包括三个相连的腔室;左右腔室包含一个金属丝笼，该金属丝笼可能是空的，也可能被鼠标占据，使测试鼠标能够与两个金属笼自由交互。在三室实验期间，两项测量有助于评估测试小鼠社会行为的不同方面。首先，根据与空笼子（新物体）与包含新老鼠的笼子交互所花费的时间对测试鼠标进行评分。这部分任务提供了对鼠标社交性的洞察。接下来，将不熟悉的鼠标放入先前空的 wire 笼中。测试鼠标在不熟悉的鼠标和熟悉的鼠标之间交互的时间差衡量了对社交新奇性的偏好。在这部分任务中，控制鼠标更喜欢与不熟悉的鼠标交互，而不是之前遇到的鼠标，后者已经存在于测试的社交性部分。社交互动缺陷和与新型小鼠互动的积极性降低通常存在于 ASD 小鼠模型中。自发明以来，三室测试已被证明是稳健的。它已被用于研究各种 ASD 小鼠模型中的社会表型，包括 Fmr1 - / - 、Shank3B - / - 、Cntnap2 - / - 和 BTBR 近交系 32,33,34,35,36。

这两项测试利用小鼠自然发生的自发行为作为研究 ASD 样行为的有用工具。由于它们被认为是低压力测试，因此在同一组小鼠中进行这两种测试以测量 ASD 样行为是可行的，首先进行自我梳理测试，随后几天进行三室社交互动测试。我们提供的协议为评估 ASD 样行为和开发新疗法提供了重要工具 29,30,31。最终，它们将有助于改善受 ASD 影响的个体的预后。

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研究方案

所有涉及动物受试者的程序和实验均已获得设施动物护理委员会 （FACC） 法规的批准，该法规遵循加拿大动物护理委员会、麦吉尔大学动物护理委员会和 NIH 实验动物福利办公室 （OLAW） 制定的指导方针。麦吉尔大学的公共卫生服务 （PHS） 保证编号为 F-16-00005（A5006-01）。

1. 动物准备

  1. 测试小鼠:选择 2-3 个月（8 至 13 周）龄的雄性和/或雌性小鼠。此处实验中使用的所有小鼠均来自 C57BL/6J 背景。对于自我梳理行为和三室社交互动测定，建议的每组小鼠的普遍可接受范围为 n = 10-15，最小为 n = 8。
    1. 对于转基因小鼠，始终添加野生型同窝小鼠作为对照。在遗传背景、年龄、性别和住房条件方面将对照组与实验组相匹配。本研究中使用的纯合转基因小鼠大小正常，未表现出任何明显的身体异常。
      注意:在一些更复杂的情况下，研究人员可能有兴趣评估两种以上的基因型（即野生型、杂合子、纯合子），研究药物的效果（即治疗、载体治疗、非治疗）或比较雄性和雌性。在与雌性小鼠一起工作时，考虑它们的发情周期至关重要。虽然女性发情周期不会显着影响自我梳理行为，但研究表明，这些周期会影响社交方式和对社会新奇事物的偏好37,38。
  2. 陌生小鼠:至少使用 8 只野生型小鼠进行三室测试。使用 2 个笼子，每个笼子 4 只小鼠，匹配测试小鼠的年龄、性别和相同的遗传背景 （C57BL/6J）。确保陌生小鼠之前没有与测试小鼠互动。
  3. 住房:每个家笼 3-5 只小鼠（71/2" W x 111/2" L x 5" H 小鼠塑料笼），并保持 12 小时的光照/黑暗循环。随意为小鼠提供 笼子中的食物和水。
    注意:在本研究的住房房间里，灯在早上 7:00 打开。
  4. 在实验39,40 之前，将小鼠转移到动物行为测试设施中至少 1 周。
  5. 处理和行为测试:在一天中的一致时间进行测试。根据鼠标外壳室中的光照周期调整开始时间。首先，将小鼠转移到测试室，让它们在昏暗的灯光下适应测试室至少 30 分钟，然后再开始行为测试。
    注意:在这项研究中，小鼠实验通常在上午 7:00 至下午 3:00 之间进行（相对于上午 7:00 开灯和晚上 7:00 关灯）。因此，行为测试的实际开始发生在上午 8 点左右。

2. 房间和设备准备

  1. 准备一个总建筑面积在 16-36 英尺之间的小房间（5-12 m2;本研究中为 6 m2 房间）。在所有实验中保持一致的温度、照明（可调节的调光照明）和噪音水平（最好是隔音的）。
    1. 如果使用立式灯（灯泡 23 W，120 V），请将它们放置在对称的位置，并放置在距离三腔设备至少 1 m 的每一侧，以均匀地照亮两个侧腔。
  2. 将设备放在便携式白色桌子上。对于自我梳理实验，使用干净、透明的笼子（71/2" W x 111/2" L x 5" H 小鼠塑料笼）;每只测试鼠标使用一个笼子。用大约 1 厘米的新鲜垫料填充笼子，不要筑巢材料。使用与家笼中相同类型的床上用品（这里是新鲜的玉米芯床上用品（[1/4" 玉米芯床上用品]）。
    注意:笼子的大小应与家用笼子相同，顶部放置一个过滤盖，但没有金属网格（通常用于存放瓶子和送餐）。
  3. 对于社会实验，使用三室装置集41。每个腔室尺寸为 20 厘米 x 40 厘米 x 22 厘米（高），周围环绕着Plexiglas 墙。每个侧室都可以通过可拆卸的透明滑动门（5 x 8 cm）从中心进入。使用两个金属丝笼（直径:7 厘米，高度:15 厘米;带盖（空的或抱着陌生的老鼠）。笼子升高并由光滑的不锈钢丝杆封闭（杆直径:3 mm，杆间距:7 mm）。不要将坐在笼子顶部作为交互时间。
    1. 如果实验中包括雄性和雌性小鼠，则标记每个金属丝笼的专用功能，以尽量减少交叉污染。
  4. 在三脚架上设置顶置或前置摄像头以进行视频录制。确保相机已充满电并有足够的存储空间。
  5. 在每次测试小鼠实验之间，用无味清洁剂彻底清洁三室装置和线笼（此处为 Versa-Clean）。将清洁剂以 1:40 的比例稀释在自来水中，涂抹在脏污的表面，并在下次测试前用纸巾擦干表面，以减少上次鼠标残留的气味。
    注意: 在社交互动测试期间，不应使用乙醇 （70%） 或其他有异味的消毒剂清洁设备，因为它们可能会影响啮齿动物的社交行为。
  6. 使用隐私百叶窗，例如白色塑料板，这些百叶窗可以放置在设备周围，以消除外部房间提示。
  7. 准备一个小白板和一个记号笔。在白板上记录基本信息，包括鼠标编号、实验标题、实验日期和时间。
    注意:在录制结束时向摄像机展示白板，以防止评分人员在评估鼠标的行为之前知道鼠标的编号。该研究确保个体评分行为对实验组保持盲目，以尽量减少潜在偏倚。

3. 处理

  1. 在行为实验开始前连续三天执行处理程序。
  2. 在同一个测试室中在同一时间进行处理会议，最好是在小鼠更活跃的早晨。
  3. 在 3 天中的每一天，将小鼠带到测试室，并在昏暗的光线下不受干扰地放置 30 分钟以适应环境。
  4. 30 分钟的适应期后，打开笼子，将戴手套的手伸入笼子。让小鼠探索手部 1 分钟。
  5. 轻轻地将老鼠舀到手上（或用小纸板管捡起），松散地握住它们。让小鼠探索手和手腕 1-2 分钟。在鼠标跳跃或激进的情况下，将其放在网格上并让它自行组合。
  6. 继续处理，直到鼠标舒适地停留在手上。在将手引入下一个笼子之前，请务必更换手套。
  7. 处理完每个笼子的老鼠后，轻轻地将它们放入家笼中，然后重复该过程。
  8. 当所有实验和对照小鼠都已处理完毕后，戴上新手套并处理陌生小鼠，以避免影响带有香味信息的测试小鼠。
  9. 以同样的方式处理陌生的老鼠。
  10. 可选:让陌生小鼠习惯于铁丝笼和三室装置 10-15 分钟。
    注意:这种习惯化会议有助于减少三室测试期间陌生小鼠的激动和异常行为。然而，对于三室测试，本研究只考虑测试小鼠发起的笼子的社交接近行为（嗅探），无论是否存在陌生小鼠。在该测定中无法可靠地观察到陌生小鼠的往复嗅探，因此不计算在内。由于三室测试的这一限制，并且为了尽量减少化学信号（如气味）的交叉污染，在这种情况下，陌生小鼠在实验开始前没有使用金属丝笼和设备的经验。

4. 方法 1:针对重复行为进行自我梳理（图 1A）

  1. 在上午 7:00 至下午 3:00 之间进行所有行为实验。
  2. 如上所述，打开调暗的灯。清洁桌子并布置房间。
  3. 为每个测试笼准备一层薄薄的新鲜垫料（如步骤 2.2 中所述）。
  4. 在桌子上放 1-2 个笼子，用白色塑料遮罩将彼此和房间环境隔开。
  5. 在每个笼子前面放置一个摄像头以捕获测试鼠标。
  6. 将所有小鼠转移到房间中，并在转移过程中用布片覆盖笼子，以避免压力。
  7. 将小鼠放入测试室后取下片材，在实验开始前将它们留在房间内至少 30 分钟，灯光调暗。
  8. 在测试开始时，在白板上写下鼠标标识号和测试信息（如步骤 2.7 中所述）。
  9. 开始录制并将测试鼠标放入测试笼中。
  10. 在 20 分钟的录制过程中离开房间。
  11. 对于每项测试，将前 10 分钟视为习惯。利用以下 10 分钟时间观察梳理行为并对其进行评分（请参阅第 6 节）。
  12. 20 分钟后，返回房间。将白板呈现给摄像头并停止录制。
  13. 轻轻地将测试鼠标放回家笼中并重复实验。
    注意:平衡实验组和对照组之间的测试顺序，以减少各种外部影响。
  14. 实验完成后，将小鼠送回它们的饲养室。

5. 方法 2:三室社交互动测试（图 2A）

  1. 在上午 7:00 至下午 3:00 之间进行所有实验。
  2. 清洁桌子并打开灯（调暗的灯光）。
  3. 将三腔有机玻璃仪器放在桌子上，周围环绕着隐私百叶窗。
  4. 将一台摄像机放在头顶上，确保所有三个暗室都在摄像机的录制帧中。
  5. 将测试小鼠和陌生小鼠转移到房间内。在转移过程中用布片盖住笼子，并在房间内取下布片。
  6. 在实验开始前，将小鼠留在房间中至少 30 分钟，并调暗灯光。
  7. 习惯
    1. 在习惯阶段保持三个房间空着。
    2. 首先，选择一个测试鼠标并在白板上写下标识号。
    3. 然后，在滑动门仍处于关闭状态时，轻轻地将测试鼠标放入中央隔间中。
    4. 开始录制并打开门，让测试鼠标探索三个空腔室。
    5. 离开房间，让测试鼠标适应该设备 10 分钟。
    6. 10 分钟适应完成后，返回房间。将测试鼠标轻轻引导至中央隔间并关闭滑动门。
    7. 显示白板并停止相机。
  8. 社交方法（新型铁丝笼对象与新型陌生小鼠 1）
    1. 在左右腔室中放置两个线笼。将这些笼子彼此对对线放置在每个腔室的角落中，确保与墙壁有 5 厘米的间隙，让测试鼠标可以在笼子周围跑动。此外，请确保笼子不直接面向腔室门。
    2. 选择一只陌生的老鼠并将其引入其中一个铁丝笼中，而另一个铁丝笼中没有老鼠。
    3. 要开始测试，请按 record（录制）并移除两个滑动门。离开房间。
    4. 让测试鼠标在一个腔室中探索空的线笼，在另一个腔室中探索包含陌生小鼠（新型陌生小鼠 1 或 S1）的笼子 10 分钟。
    5. 10 分钟后，返回房间。将白板显示到摄像头并结束录制。
    6. 将鼠标重新插入中央隔间并关闭互连门。
      注意: 完成社交方法测试后，请勿从设置中取出铁丝笼，以便它们在整个任务中保持在同一位置。
  9. 对社会新奇事物的偏好（新奇老鼠 2 与新老鼠 1）
    1. 将一只从未遇到过的新鼠标放在以前空的线笼上（新奇的陌生老鼠 2 或 S2）。
      注意:S2 必须来自与 S1 不同的主笼。
    2. 开始录制并打开互连的门，让测试鼠标探索设备 10 分钟。
    3. 离开房间。测试鼠标将探索两个铁丝笼:一个是之前在社交接近阶段遇到的 S1 鼠标，另一个是新引入的 S2 鼠标。
    4. 10 分钟后，返回房间。将白板显示到摄像头并结束录制。
    5. 将所有小鼠（测试鼠和新奇小鼠）放回它们的家笼中。
    6. 用无异味消毒剂彻底清洁腔室和金属丝笼。确保在将设备用于下一次实验之前将其干燥。
    7. 对所有剩余的测试小鼠重复实验。
      注意:对于不同的测试小鼠，将笼子与 S1 和 S2 小鼠交替放置在左右腔室之间。平衡可防止对设备的特定腔室的偏向偏好。
    8. 测试后，将小鼠送回饲养设施。
    9. 在测试的每个部分之间，停止并重新启动相机，导致每个测试鼠标产生 3 次 10 分钟的视频。

6. 评分和统计分析

  1. 必要设备
    1. 使用两个秒表和一台装有以下软件的计算机或笔记本电脑:Microsoft Excel、GraphPad Prism 和其他统计程序，例如用于评分、绘制图形和统计分析的 SPSS。
  2. 自我梳理评分
    注意:当鼠标放置在舒适的环境中时，可以观察到低压力的自发自我梳理行为。通常，小鼠通过舔爪子舔鼻子和胡须周围来开始梳理毛发（第一阶段）。接下来可能是第二阶段和第三阶段，老鼠开始用爪子擦拭整个脸和头部。在第 IV 阶段，老鼠继续梳理身体并舔尾巴14。鉴于在 10 分钟的测试期内梳理耳朵（III 期）和尾巴（IV 期）的频率较低，为了提高人工分析的清晰度，自我梳理行为分为两种主要类型:喙部梳理和尾部梳理。嘴部美容包括舔爪、梳鼻和彻底清洗面部、耳朵和头部等活动。尾部梳理包括舔覆盖腹部、背部、后肢和生殖器区域以及尾巴等区域的身体部位。
    1. 仔细观察梳理行为并记录比赛。当鼠标参与单个自我整理实例时，将发生单个整理会话。考虑从开始到停止的梳理会话，无论涉及的具体梳理行为如何。
    2. 如果测试鼠标暂停了几秒钟的梳理而不改变位置，则将其计为同一回合的一部分。但是，如果鼠标停止梳理并开始探索，则认为梳理比赛已经结束。
    3. 此外，仅当鼠标从前到后（从阶段 I 到阶段 IV）连续梳理时，才会记录完整的梳理会话。
    4. 记录在 10 分钟测试期间观察到的总美容时间、美容比赛的次数和完整的美容比赛次数，以 2 分钟、5 分钟和 10 分钟的间隔标记观察结果。
  3. 三室社交互动测试
    该分析确定了与每只小鼠进行嗅探互动的时间和频率（新奇的 S1 和空笼用于社交方法，以及 S1 和新奇的 S2 用于对社交新奇的偏好）。
    1. 使用两个计时器记录每个笼子中与鼠标的交互时间以及在每个腔室中花费的总时间。对于测试的每个部分（社交方法和对社会新奇事物的偏好），记录测试鼠标进入每个腔室的次数（总条目）。
    2. 通过测试鼠标的身体在其中一个腔室内的存在来确定隔间中的时间（必须有四个爪子进入）。
    3. 记录测试鼠标嗅探新奇陌生鼠（直接面部接触或嗅探陌生鼠尾巴）或嗅探空笼时的交互时间。不要把坐在笼子的顶部看作是互动。
    4. 在 2 分钟、5 分钟和 10 分钟时录制。执行瞬态分析。
    5. 比较组内的社交歧视指数 （DI）。
      注意:DI 计算为:DI =（与 S1 小鼠交互的时间 - 与空笼交互的时间）/总交互时间 x 100。在社交新奇部分，对照小鼠与 S2（不熟悉的小鼠）的互动比与 S1（熟悉的小鼠）的互动更多。社交新奇性（社交记忆）DI 的计算公式为:DI = （与 S2 鼠标交互的时间 - 与熟悉的鼠标交互时间 （S1））/总交互时间 x 100。
  4. 统计分析
    1. 使用双尾未配对学生 T 检验来计算 p 值，对于自我梳理时间、比赛和完全比赛，显著水平设置为 p < 0.05，其中只有两组。
    2. 对于三室测试，使用学生的 T 检验来计算两组之间总条目的统计显著性。当不满足组间数据方差相等的假设（Levene 检验 p < 0.05）时，执行 Welch T 检验以调整偏差并比较独立组的均值。
      注意:测量总条目可评估小鼠的整体活动。如果实验组对三室装置的探索明显少于对照组，则可能会出现潜在的担忧（与小鼠的运动障碍和高焦虑水平有关）。为了解决这个问题，考虑使用抑郁样行为测试来评估运动功能和焦虑样行为，因为探索减少可能归因于这些情况42。
    3. 使用混合方式方差分析可比较每个腔室中的时间和每个检验的交互作用时间。根据组和因子的数量，使用混合双因子方差分析（2 个因素:基因型和腔室的侧面，或与空笼和 S1 或 S1 和 S2 相互作用），或混合三向方差分析（3 个因素:基因型、处理和腔室的侧面，或与空和 S1 或 S1 和 S2 相互作用）。该分析对于揭示小鼠在各种因素之间具有统计学意义的社会互动特别有用。
      注:这些因素包括基因型的主要影响（不同遗传背景对社会行为的影响）、与笼子相互作用的主要影响（嗅探和偏好新奇的陌生小鼠而不是空笼子或以前遇到的小鼠）、治疗的主要影响（各种药物治疗对小鼠社交行为的影响）和基因型 x 治疗相互作用（揭示应用的治疗如何影响基因型）。
    4. 随后，使用 Bonferroni 的 事后 检验（α 水平设置为 0.05）进一步评估不同组之间的比较。

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结果

雷帕霉素的哺乳动物靶标 （mTOR） 通过调节从头蛋白质合成和抑制自噬，在中枢神经系统 （CNS） 中发挥关键作用43。mTOR 通路和突触蛋白合成失调与 ASD28 有关。对 ASD 患者的全基因组研究已经确定了各种 ASD 相关基因突变，包括影响参与 mTOR 复合物 1 （mTORC1） 信号传导的蛋白质的突变，例如十号染色体上的磷酸酶和张力蛋白同源...

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讨论

ASD 的大多数病因、病理变化和生物标志物尚不清楚或不可用。ASD 诊断主要基于两组既定的临床症状:社交沟通的持续缺陷和过度重复的行为 18,19,55。鉴于 ASD 是一种涵盖广泛症状的谱系障碍，因此在实验动物中完全重现 ASD 症状具有挑战性。然而，三组标准对于评估 ASD 动物模型的行为至关重要:面部效?...

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披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

我们感谢 Karim Nader 博士（麦吉尔大学心理学系）提供动物行为设施。

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材料

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Whiteboard and  Low Odor Dry Erase MarkerEXPONADry erase markers in bold black

参考文献

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