Стратегии оценки аутистического поведения у мышей

Резюме

Модели грызунов являются ценными инструментами для изучения основных поведенческих особенностей, связанных с расстройствами аутистического спектра (РАС). В этой статье мы подробно рассказываем о двух поведенческих тестах для моделирования основных особенностей РАС у мышей: самогруминге, который оценивает повторяющееся поведение, и трехкамерном тесте социального взаимодействия, который документирует социальные нарушения.

Аннотация

Расстройство аутистического спектра (РАС) – это нейробиологически сложное заболевание с гетерогенной генетической этиологией. Клинически РАС диагностируется по нарушениям социальной коммуникации и ограничительному или повторяющемуся поведению, такому как взмахи руками или выстраивание предметов. Эти поведенческие паттерны можно надежно наблюдать на мышиных моделях с генетическими мутациями, связанными с РАС, что делает их очень полезными инструментами для изучения основных клеточных и молекулярных механизмов при РАС. Понимание того, как генетические изменения влияют на нейробиологию и поведение, наблюдаемое при РАС, будет способствовать разработке новых таргетных терапевтических соединений для улучшения основных поведенческих нарушений. Наша лаборатория использовала несколько протоколов, включающих в себя хорошо описанные процедуры обучения и тестирования, которые отражают широкий спектр поведенческих дефицитов, связанных с РАС. Здесь мы подробно описываем два теста для изучения основных особенностей РАС на мышиных моделях: самогруминг (мера повторяющегося поведения) и трехкамерный тест социального взаимодействия (мера подхода к социальному взаимодействию и предпочтения социальной новизны).

Введение

Расстройство аутистического спектра (РАС) — это расстройство развития мозга, которое проявляется нарушениями социальной коммуникации или взаимодействия и ограниченными, повторяющимися моделями поведения или интересов ^1,2. В 2022 году примерно у 1 из 100 детей во всем мире было диагностировано РАС³. По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC, США), распространенность РАС увеличилась на 30% с 2008 года и выросла более чем в 2 раза с 2000 года в ^4,5 раза. У людей с РАС также могут наблюдаться сопутствующие заболевания, такие как умственная отсталость (ИД) (35,2%, IQ ≤ 70), синдром дефицита внимания/гиперактивности (СДВГ) (50%-70%) и другие генетические синдромы ^2,4,6.

Использование животных моделей в исследованиях РАС, особенно на грызунах, дало значительное представление о влиянии различных факторов окружающей среды, включая диету, лекарства, физические упражнения и обогащение 7,8,9,10, а также генетические мутации, такие как Shank, Fmr1, Mecp2, Pten и мутант Tsc 11,12,13, о симптомах РАС. Мышиные модели обычно используются для исследования РАС из-за их социальной природы и общих генетических, биохимических и электрофизиологических особенностей с людьми. Например, путем делеции определенного гена (такого как Shank3, Fmr1, Cntnap2 и Pten) можно повторить аберрантное социальное и повторяющееся поведение, что обеспечивает высокую валидность исследования 14,15,16. Здесь мы приводим протоколы для изучения параллелей между генетическими моделями животных^{и симптомами} РАС у человека. Мы описываем тест на самоухаживание и трехкамерный тест на социальное взаимодействие, которые отражают два основных симптома у пациентов с РАС, а именно ограниченные, повторяющиеся модели поведения и нарушения социального взаимодействия (коммуникации) соответственно.

Основываясь на DSM-V (Диагностическое и статистическое руководство по психическим расстройствам Американской психиатрической ассоциации,^5-е издание) и МКБ-11 (Международная классификация болезней 11-го пересмотра), пациенты с РАС участвуют в ограниченных, повторяющихся и стереотипных моделях поведения, в частности, в нефункциональном повторяющемся поведении, ориентированном на тело (BFRB), таком как раскачивание, стимминг, грызение ногтей, выдергивание волос, ковыряние кожи^{или ходьба} на цыпочках^{. 19}. У животных повторяющееся поведение проявляется длительным и повторяющимся самоухаживанием. Груминг является одним из наиболее распространенных врожденных занятий среди грызунов, примерно 40% времени их бодрствования тратится на груминг^. Мыши инстинктивно вылизывают свою кожу или шерсть, чтобы удалить инородную грязь с поверхности тела, которая служит для поддержания чистоты тела, предотвращения травм, удаления паразитов и регулирования температуры. Груминг подразделяется на два типа: социальный груминг (алло-груминг), включающий груминг другой мышью, и самогруминг. Самогруминг представляет собой стереотипную и консервативную последовательность, состоящую из четырех этапов (в основном дискретных и непоследовательных)^22,23. На стадии I (эллиптический удар) мыши начинают груминг, сначала облизывая обе лапы, а затем ухаживая за носом лапами. На стадии II (односторонний инсульт) мыши используют лапы, чтобы асимметрично вытирать морду. На стадии III (Билатеральный инсульт) мыши симметрично протирают голову и уши. На стадии IV (Облизывание тела) мыши переходят к облизыванию тела, откидывая голову назад, и могут расширить уход за хвостом и гениталиями. Когда мышей по отдельности помещают в прозрачную клетку, поведение по вылизыванию можно легко распознать и наблюдать. Мыши увеличивают самоухаживание при столкновении со стрессом, болью или социальными потрясениями, что делает тест на самоуход решающим при исследовании неврологических^{расстройств.} Различные мышиные модели РАС, в том числе с генетическими мутациями (такими как Fmr1^−/y, Shank3B^−/-, NL1^−/−), фармакологическими вмешательствами (такими как DO34, PolyI:C) и специфическими инбредными штаммами (такими как BTBR и C58/J), продемонстрировали чрезмерное повторяющееся поведение по уходу за собой 24,25,26,27.

Изменения в социальном поведении служат одним из критериев оценки РАС. Согласно DSM-V и МКБ-11, у пациентов с РАС^{наблюдаются} стойкие нарушения социальной коммуникации и социального взаимодействия1 ^8,19. Они могут проявляться в дефиците вербальной и невербальной коммуникации (т.е. в ненормальном зрительном контакте, жестах и выражении лица), отсутствии интереса и эмоций с другими, неосознавании социальных контекстуальных сигналов или трудностях в развитии отношений. В соответствии с симптомами социальных нарушений, были разработаны и оптимизированы различные поведенческие задачи для оценки социальных взаимодействий у мышей, такие как тест прямого социального взаимодействия, трехкамерный социальный подход и тест предпочтения социальной новизны, а также анализ ультразвуковых вокализаций (USV)^16,28. Трехкамерный тест социального взаимодействия является широко используемым экспериментом для оценки поведения, связанного с РАС 17,29,30,31. Аппарат состоит из трех соединенных камер; Левая и правая камеры содержат проволочную клетку, которая может быть либо пустой, либо занятой мышью, что позволяет тестовой мыши свободно взаимодействовать с обеими клетками. Два измерения помогают оценить различные аспекты социального поведения у тестовой мыши во время трехкамерного эксперимента. Во-первых, тестовая мышь оценивается за время, затраченное на взаимодействие с пустой клеткой (новым объектом) по сравнению с клеткой, в которой находится новая мышь. Эта часть задания дает представление о общительности мыши. Далее незнакомая мышь помещается в ранее пустую проволочную клетку. Разница во времени взаимодействия тестовой мыши между незнакомой и знакомой мышью измеряет предпочтение социальной новизны. В этой части задания управляющая мышь предпочитает взаимодействовать с незнакомой, а не с ранее встреченной мышью, которая уже присутствовала в части теста на общительность. Дефицит социального взаимодействия и снижение мотивации к взаимодействию с новыми мышами обычно обнаруживаются в мышиной модели РАС. Трехкамерный тест доказал свою надежность с момента своего изобретения. Он был использован для изучения социальных фенотипов в различных моделях РАС у мышей, включая Fmr1^−/−, Shank3B^−/-, Cntnap2^−/− и инбредный штамм BTBR 32,33,34,35,36.

В этих двух тестах используется естественное, спонтанное поведение мышей в качестве полезного инструмента для изучения поведения, подобного РАС. Поскольку они считаются тестами с низким уровнем стресса, целесообразно проводить оба теста в одной и той же группе мышей для измерения поведения, подобного РАС, при этом сначала проводится тест на самоуход, а в последующие дни — трехкамерный тест на социальное взаимодействие. Протоколы, которые мы предоставляем, представляют собой важный инструмент для оценки РАС-подобного поведения и разработки новых методов лечения 29,30,31. В конечном счете, они будут способствовать улучшению результатов для людей, страдающих аутизмом.

протокол

Все процедуры и эксперименты с участием животных были одобрены правилами Комитета по уходу за животными (FACC), которые следуют рекомендациям, установленным Канадским советом по уходу за животными, Комитетом по уходу за животными Университета Макгилла и Управлением по защите лабораторных животных NIH (OLAW). Страховой номер Службы общественного здравоохранения (PHS) для Университета Макгилла: F-16-00005 (A5006-01).

1. Подготовка животных

1. Тестовые мыши: Выберите самцов и/или самок мышей в возрасте 2-3 месяцев (от 8 до 13 недель). Все мыши, использованные в экспериментах здесь, относятся к C57BL/6J. Для самогруминга и трехкамерного анализа социального взаимодействия общеприемлемый диапазон мышей в каждой предложенной группе составляет n = 10-15, при минимуме n = 8.
   1. Для генетически модифицированных мышей всегда добавляйте однопометников дикого типа в качестве контроля. Сопоставить контрольную группу с экспериментальной по генетическому фону, возрасту, полу и жилищным условиям. Гомозиготные трансгенные мыши, использованные в этом исследовании, имеют нормальный размер и не проявляют каких-либо грубых физических аномалий.
      Примечание: В некоторых более сложных случаях исследователи могут быть заинтересованы в оценке более двух генотипов (т.е. дикого типа, гетерозиготного, гомозиготного), изучении эффектов лекарств (т.е. лечения, лечения носителей, нелечения) или сравнении самцов и самок. При работе с самками мышей крайне важно учитывать их эстральные циклы. В то время как женские эстральные циклы не оказывают существенного влияния на поведение по уходу за собой, исследования показали, что эти циклы могут влиять на социальный подход и предпочтение^{социальной новизны.}
2. Незнакомые мыши: Используйте не менее 8 мышей дикого типа для трехкамерного теста. Используйте 2 клетки, по 4 мыши в каждой, соответствующего возраста, пола и с тем же генетическим фоном (C57BL/6J) тестовых мышей. Убедитесь, что незнакомые мыши ранее не взаимодействовали с подопытными мышами.
3. Содержание: Групповой домик для 3-5 мышей в каждой домашней клетке (71/2" Ш x 111/2" Д x 5" В мышиные пластиковые клетки) и содержание в 12-часовом цикле свет/темнота. Обеспечьте мышам доступ к пище и воде в клетке ad libitum.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В жилых комнатах в этом кабинете свет включается в 7:00 утра.
4. Перевод мышей в центр поведенческих испытаний на животных минимум за 1 неделю до экспериментов^39,40.
5. Хендлинг и поведенческое тестирование: Проводите тест в одно и то же время суток. Корректируйте время запуска в зависимости от светового цикла в помещениях корпуса мыши. Во-первых, переведите мышей в комнату для тестирования и дайте им привыкнуть к комнате для тестирования в течение как минимум 30 минут при приглушенном освещении, прежде чем начинать поведенческие тесты.
   Примечание: В этом исследовании эксперименты на мышах обычно проводились между 7:00 утра и 3:00 вечера (относительно 7:00 утра при включенном свете и 7:00 вечера выключенном). Следовательно, фактическое начало поведенческого теста происходит около 8 часов утра.

2. Подготовка помещения и оборудования

1. Подготовьте небольшую комнату с общей площадью пола от 16 до 36 футов (5-12^м2; комната 6^м2 в этом исследовании). Поддерживайте постоянную температуру, освещение (регулируемое приглушенное освещение) и уровень шума (в идеале звукоизоляцию) для всех экспериментов.
   1. При использовании напольных фонарей (лампы мощностью 23 Вт, 120 В) размещайте их в симметричных местах и с каждой стороны, на расстоянии не менее 1 м от трехкамерного аппарата, чтобы равномерно освещать две боковые камеры.
2. Поставьте аппарат на переносной белый стол. Для эксперимента по самостоятельному уходу используйте чистые, прозрачные клетки (71/2" Ш x 111/2" Д x 5" В пластиковые клетки для мышей); Используйте одну клетку для каждой тестовой мыши. Наполните клетки примерно 1 см свежей подстилкой без материала для гнездования. Используйте тот же тип подстилки, что и в домашней клетке (здесь свежая подстилка из кукурузных початков ([подстилка из кукурузных початков]).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть того же размера, что и домашние клетки, с крышкой фильтра, размещенной сверху, но без металлической сетки (которая обычно используется для хранения бутылок и доставки еды).
3. Для проведения социального эксперимента используют трехкамерный аппарат⁴¹ комплекта. Каждая камера имеет размеры 20 см x 40 см x 22 (h) см и окружена стенами из плексигласа. Доступ к каждой боковой камере осуществляется из центра с помощью прозрачных раздвижных дверей, которые можно снять (5 х 8 см). Используйте две проволочные клетки (диаметр: 7 см, высота: 15 см; с крышками-крышками (пустыми или держащими незнакомых мышей). Каркас приподнят и огорожен гладкими проволочными стержнями из нержавеющей стали (диаметр стержня: 3 мм, расстояние между стержнями: 7 мм). Не включайте сидение на клетках в качестве времени взаимодействия.
   1. Если в эксперимент включены и самцы, и самки мышей, пометьте каждую клетку в соответствии с ее специальной функцией, чтобы свести к минимуму перекрестное загрязнение.
4. Установите верхнюю или фронтальную камеру на штативы для записи видео. Убедитесь, что камеры полностью заряжены и имеют достаточно места для хранения.
5. Между каждым экспериментом с тестовыми мышами тщательно очищайте трехкамерную установку и проволочные клетки чистящим средством без запаха (в данном случае Versa-Clean). Разведите чистящее средство в водопроводной воде в соотношении 1:40, нанесите его на загрязненную поверхность и высушите поверхности бумажным полотенцем перед следующим тестом, чтобы свести к минимуму остатки одоранта от предыдущей мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этиловый спирт (70%) или другие дезинфицирующие средства с запахами не следует использовать для очистки устройства во время тестов на социальное взаимодействие, так как они могут повлиять на социальное поведение грызунов.
6. Используйте жалюзи для уединения, такие как белые пластиковые доски, которые можно разместить вокруг устройства, чтобы устранить внешние сигналы комнаты.
7. Подготовьте небольшую доску и маркер. Запишите на доске важную информацию, в том числе номер мыши, название эксперимента, дату и время эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Доска подносится к камере в конце записи, чтобы человек, производящий оценку, не мог узнать номер мыши до того, как оценит поведение мыши. Исследование показало, что индивидуальное поведение при оценке оставалось слепым для экспериментальных групп, чтобы свести к минимуму потенциальную систематическую ошибку.

3. Обращение

1. Выполняйте процедуры обработки в течение трех дней подряд до начала поведенческих экспериментов.
2. Проводите сеансы обработки в одной и той же комнате для тестирования в одно и то же время, в идеале утром, когда мыши более активны.
3. В каждый из 3 дней приносите мышей в комнату для тестирования и оставляйте их в покое на 30 минут при тусклом свете для акклиматизации.
4. После 30-минутного периода акклиматизации откройте клетку и введите в клетку руку в перчатке. Дайте мышам исследовать руку в течение 1 минуты.
5. Аккуратно зачерпните мышей на руке (или возьмите их с помощью небольшой картонной трубки), держа их свободно. Дайте мышам исследовать кисть и запястье в течение 1-2 минут. В случаях, когда мышь прыгает или агрессивна, поместите ее на сетку и дайте ей скомпоновать самостоятельно.
6. Продолжайте работу до тех пор, пока мышь не станет удобно лежать на руке. Всегда меняйте перчатки перед тем, как вводить руки в следующую клетку.
7. После обработки каждой клетки с мышами аккуратно поместите их в их домашнюю клетку, а затем повторите процедуру.
8. Надевайте новые перчатки и берите в руки незнакомых мышей, когда все экспериментальные и контрольные мыши будут обработаны, чтобы не воздействовать на тестовых мышей ароматическими сообщениями.
9. Обращайтесь и с незнакомыми мышами таким же образом.
10. Дополнительно: Приучайте незнакомых мышей к проволочной клетке и трехкамерному аппарату в течение 10-15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот сеанс привыкания помогает уменьшить возбуждение и отклонение от нормы поведения у незнакомых мышей во время трехкамерного теста. Однако для трехкамерного теста в этом исследовании учитывается только поведение социального подхода (обнюхивание) клетки, инициированное тестовой мышью, независимо от того, присутствует ли там незнакомая мышь или нет. Ответное обнюхивание чужой мышью не является достоверно наблюдаемым в этом анализе и, следовательно, не учитывается. Из-за этого ограничения трехкамерного теста и для минимизации перекрестного загрязнения химических сигналов (таких как запахи) в этом случае незнакомые мыши не имели предварительного опыта работы с проволочной клеткой и устройством до начала эксперимента.

4. Метод 1: Самоухаживание за повторяющимся поведением (Рисунок 1А)

1. Проводите все поведенческие эксперименты с 7:00 до 15:00.
2. Включите приглушенный свет, как описано выше. Уберите со стола и наведите порядок в комнате.
3. Подготовьте каждую испытательную клетку тонким слоем свежей подстилки (как описано в пункте 2.2).
4. Поставьте на стол 1-2 клетки, отделенные друг от друга и комнатной обстановки белыми пластиковыми шорами.
5. Поместите камеру перед каждой клеткой, чтобы запечатлеть тестовую мышь.
6. Перенесите всех мышей в помещение и накройте клетки тканевым листом во время процесса переноса, чтобы избежать стресса.
7. После того, как мыши будут помещены в испытательную комнату, снимите лист, оставив их в комнате не менее чем на 30 минут с приглушенным светом до начала эксперимента.
8. В начале теста запишите идентификационный номер мыши и информацию о тестировании на доске (как описано в шаге 2.7).
9. Начните запись и поместите тестовую мышь в тестовую клетку.
10. Покиньте комнату во время 20-минутной сессии записи.
11. Для каждого теста рассматривайте первые 10 минут как привыкание. Используйте следующие 10 минут, чтобы понаблюдать за поведением груминга и оценить его (см. раздел 6).
12. Через 20 минут вернитесь в номер. Поднесите доску к камере и остановите запись.
13. Аккуратно поместите тестовую мышь обратно в домашнюю клетку и повторите эксперимент.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновешивайте порядок испытаний между экспериментальной и контрольной группами, чтобы уменьшить различные внешние воздействия.
14. После завершения экспериментов верните мышей в их комнату.

5. Метод 2: Трехкамерный тест социального взаимодействия (Рисунок 2А)

1. Проводите все эксперименты с 7:00 до 15:00.
2. Уберите со стола и включите свет (приглушенный свет).
3. Поместите трехкамерный инструмент из плексигласа на стол в окружении жалюзи для уединения.
4. Поместите одну камеру над головой, убедившись, что все три камеры находятся в кадре записи камеры.
5. Перенесите тестовых и незнакомых мышей в комнату. Накройте клетки тканевым листом во время процесса переноса и снимите простыню в комнате.
6. Перед началом эксперимента оставьте мышей в комнате не менее чем на 30 минут при приглушенном освещении.
7. Привыкание
   1. Держите три камеры пустыми во время фазы привыкания.
   2. Для начала выберите тестовую мышь и напишите идентификационный номер на доске.
   3. Затем аккуратно поместите тестовую мышь в центральное отделение, пока раздвижные дверцы все еще закрыты.
   4. Начните запись и откройте дверцы, чтобы тестовая мышь могла исследовать три пустые камеры.
   5. Выйдите из комнаты и дайте тестовой мыши привыкнуть к устройству в течение 10 минут.
   6. После 10 минут привыкания вернитесь в комнату. Осторожно подведите тестовую мышь к центральному отсеку и закройте раздвижные дверцы.
   7. Отобразите доску и остановите камеру.
8. Социальный подход (новый объект в проволочной клетке против новой мыши-незнакомца 1)
   1. Расположите две проволочные клетки в левой и правой камерах. Расположите эти клетки по диагонали друг к другу в углах каждой камеры, обеспечив зазор в 5 см от стены, что позволит тестовой мыши бегать по клеткам. Кроме того, следите за тем, чтобы клетки не были обращены непосредственно к дверям камеры.
   2. Выберите одну чужую мышь и поместите ее в одну из проволочных клеток, в то время как в другой проволочной клетке нет мыши.
   3. Чтобы начать тест, нажмите кнопку «Запись» и снимите обе раздвижные двери. Выйдите из комнаты.
   4. Дайте тестовой мыши исследовать пустую проволочную клетку в одной камере и клетку, содержащую незнакомую мышь (новую незнакомую мышь 1 или S1) в другой камере в течение 10 минут.
   5. Через 10 минут вернитесь в комнату. Покажите доску на камере и завершите запись.
   6. Снова поместите мышь в центральное отделение и закройте соединительные дверцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимайте проволочные клетки с установки после завершения теста социального подхода, чтобы они оставались в одном и том же положении в течение всего задания.
9. Предпочтение социальной новизны (новая незнакомая мышь 2 против новой мыши 1)
   1. Поместите новую, никогда не встречавшуюся мышь в ранее пустую проволочную клетку (новую незнакомую мышь 2 или S2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: S2 должен быть из другой домашней клетки, чем S1.
   2. Начните запись и откройте соединенные между собой дверцы, чтобы тестовая мышь могла исследовать устройство в течение 10 минут.
   3. Выйдите из комнаты. Тестовая мышь будет исследовать две проволочные клетки: одну с ранее встреченной мышью S1 на этапе социального подхода, а другую с недавно представленной мышью S2.
   4. Через 10 минут вернитесь в комнату. Покажите доску на камеру и завершите запись.
   5. Верните всех мышей (подопытных и новых незнакомых мышей) в их домашние клетки.
   6. Тщательно очистите камеры и проволочные клетки дезинфицирующим средством без запаха. Убедитесь, что аппарат высушен, прежде чем использовать его для следующего эксперимента.
   7. Повторите эксперимент для всех оставшихся тестовых мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чередуйте размещение клеток с мышами S1 и S2 между левой и правой камерами для разных тестовых мышей. Противовес предотвращает смещение предпочтения в сторону той или иной камеры аппарата.
   8. После тестирования верните мышей в жилищный объект.
   9. Между каждой частью теста останавливайте и перезапускайте камеру, в результате чего видео будет показано 3 раза по 10 минут на тестовую мышь.

6. Скоринг и статистический анализ

1. Необходимое оборудование
   1. Используйте два секундомера и компьютер или ноутбук со следующим программным обеспечением: Microsoft Excel, GraphPad Prism и другими статистическими программами, такими как SPSS, для подсчета очков, построения графиков и статистического анализа.
2. Самостоятельная оценка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда мышь помещена в комфортную среду, можно наблюдать спонтанное поведение самовылизывания без стресса. Как правило, мыши начинают груминг, облизывая лапами вокруг носа и усов (стадия I). За этим могут последовать стадии II и III, когда мышь начинает вытирать лапами всю морду и голову. На стадии IV мышь продолжает ухаживать за своим телом и облизывать хвост¹⁴. Учитывая нечастотность груминга ушей (стадия III) и хвоста (стадия IV) в течение 10-минутного тестового периода, а также с целью повышения ясности ручного анализа, поведение самогруминга было разделено на два основных типа: ростальский груминг и каудальный груминг. Ростральный груминг включает в себя такие действия, как облизывание лап, уход за носом и тщательное мытье лица, ушей и головы. Каудальный груминг включает в себя вылизывание части тела, охватывающей такие области, как живот, спина, задние конечности и область гениталий, а также хвост.
   1. Внимательно наблюдайте за поведением груминга и записывайте схватки. Индивидуальный сеанс груминга происходит, когда мышь участвует в одном случае самостоятельного груминга. Рассматривайте сеанс груминга с момента его начала и до его окончания, независимо от конкретного поведения груминга.
   2. Если тестовая мышь приостанавливает свой уход на несколько секунд, не меняя положение, засчитайте это как часть того же боя. Однако, если мышь прекращает груминг и начинает исследовать, считайте, что схватка по грумингу завершена.
   3. Кроме того, записывайте полный сеанс груминга только в том случае, если мышь непрерывно вылизывает мышь спереди назад (от стадии I до стадии IV).
   4. Задокументируйте общее время груминга, количество подходов груминга и количество полных подходов груминга, наблюдаемых в течение 10-минутного периода тестирования, отмечая наблюдения с интервалами 2 минуты, 5 минут и 10 минут.
3. Трехкамерный тест на социальное взаимодействие
   В результате анализа определяется время и частота взаимодействия с каждой мышью (новелла S1 и пустая клетка для социального подхода, а S1 и новелла S2 для предпочтения социальной новизны).
   1. Используйте два таймера, чтобы записать время взаимодействия с мышью в каждой клетке и общее время, проведенное в каждой камере. Для каждой части теста (социальный подход и предпочтение социальной новизны) запишите, сколько раз тестовая мышь входит в каждую камеру (общее количество входов).
   2. Время нахождения в отсеке (отсеках) определяют по нахождению тела тестовой мыши в пределах одной из камер (в нее должны войти четыре лапы).
   3. Запишите время (ы) взаимодействия, когда тестовая мышь обнюхивает новую незнакомую мышь (прямой контакт лицом или обнюхивание хвоста незнакомой мыши) или обнюхивает пустую клетку. Не рассматривайте сидение на вершине клетки как взаимодействие.
   4. Записывайте через 2 минуты, 5 минут и 10 минут. Проведите анализ, зависящий от времени.
   5. Сравните индекс дискриминации в общительности (DI) внутри групп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DI рассчитывается следующим образом: DI = (время взаимодействия с мышью S1 - время взаимодействия с пустой клеткой)/общее время взаимодействия x 100. Во время части социальной новизны управляющие мыши будут больше взаимодействовать с S2 (незнакомой мышью), чем с S1 (знакомой мышью). Социальная новизна (социальная память) DI вычисляется: DI = (время взаимодействия с мышью S2 - время взаимодействия со знакомой мышью (S1))) / общее время взаимодействия x 100.
4. Статистический анализ
   1. Используйте Т-критерий Стьюдента с двусторонним непарным уравнением для вычисления p-значений со значимым уровнем, установленным на уровне p < 0,05 для времени самостоятельного груминга, боев и полных боев, где есть только две группы.
   2. Для трехкамерного теста используйте Т-критерий Студента для вычисления статистической значимости общего числа записей между двумя группами. Если предположение о равной дисперсии данных между группами не выполняется (критерий Левена p < 0,05), выполните Т-критерий Уэлча, чтобы скорректировать отклонение и сравнить средние независимые группы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение общего количества записей позволяет оценить общую активность мышей. Потенциальные опасения (связанные с двигательными нарушениями и высоким уровнем тревожности мышей) могут возникнуть, если экспериментальная группа исследует трехкамерный аппарат значительно меньше, чем контрольная группа. Чтобы решить эту проблему, рассмотрите возможность оценки двигательной функции и тревожного поведения с помощью поведенческих тестов, подобных депрессии, поскольку снижение исследования может быть связано с^{этими состояниями}.
   3. Используйте смешанный ANOVA для сравнения времени в каждой камере и времени взаимодействия для каждого теста. В зависимости от количества групп и факторов используют смешанный двухфакторный ANOVA (2 фактора: генотип и сторона камеры, или взаимодействие с пустой клеткой и S1, или S1 и S2), или смешанный трехфакторный ANOVA (3 фактора: генотип, лечение и сторона камеры, или взаимодействие с пустым и S1, или S1 и S2). Этот анализ особенно полезен для выявления статистически значимого социального взаимодействия мышей между различными факторами.
      Примечание: Эти факторы включают в себя основной эффект генотипа (влияние различных генетических особенностей на социальное поведение), основной эффект взаимодействия с клеткой (обнюхивание и предпочтение новой незнакомой мыши по сравнению с пустой клеткой или ранее встреченной мышью), основной эффект лечения (влияние различных лекарственных препаратов на социальное поведение мышей) и взаимодействие с генотипом x (показать, как применяемое лечение влияет на генотип).
   4. Затем используйте апостериорный тест Бонферрони (α-уровень, установленный на 0,05) для дальнейшей оценки сравнения между различными группами.

Результаты

Мишень рапамицина (mTOR) у млекопитающих играет важнейшую роль в центральной нервной системе (ЦНС), регулируя синтез белка de novo и подавляя аутофагию⁴³. Нарушение регуляции пути mTOR и синтеза синаптических белков было связано с РАС²⁸. Полноген?...

Обсуждение

Большинство этиологических причин, патологических изменений и биологических маркеров РАС неизвестны или недоступны. Диагноз РАС в первую очередь основан на двух установленных наборах клинических симптомов: стойком дефиците социальной коммуникации и чрезмерном по?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4'' Teklad Corncob Bedding	Harlan, TEKLAD	7092-7097	The raw stock for corncob bedding products  is 100% corncob. No other components or additives are used.
HD Video Recording Cameratraditional Video Camera	Sony	HDRCX405	50 Mbps XAVC S1 1920 x 1080 at 60P, AVCHD and MP4 codecs. 30x Optical / 60x Clear Image Zoom to get closer to the action. 26.8 mm wide angle ZEISS Lens.
Nitrile Powder Free Examination Gloves	Aurelia, Transform	ASTM D6319-00	Tested for use with Chemotherapy drugs per ASTM D6978
Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	AN75PLF	AN75 Mouse 7½” W x 11½” L x 5” H
TÅGARP floor lamp and bulbs	IEKA	604.640.49	Bulbs are 23 W 120 V.
Ugo Basile Sociability Apparatus	Stoelting	60450	The Sociability Apparatus (3-chambered social test) is a valuable tool to study social behaviour in mice.
Versa-Clean	Fisherbrand	PVCLN04	Cleaning agent
Whiteboard and  Low Odor Dry Erase Marker	EXPO	NA	Dry erase markers in bold black