Estratégias para avaliar comportamentos semelhantes aos autistas em camundongos

Resumo

Modelos de roedores são ferramentas valiosas para estudar comportamentos centrais relacionados ao transtorno do espectro do autismo (TEA). Neste artigo, expomos dois testes comportamentais para modelar as principais características do TEA em camundongos: auto-limpeza, que avalia o comportamento repetitivo, e o teste de interação social de três câmaras, que documenta deficiências sociais.

Resumo

O transtorno do espectro autista (TEA) é uma condição neurobiologicamente complexa com etiologia genética heterogênea. Clinicamente, o TEA é diagnosticado por deficiências na comunicação social e comportamentos restritivos ou repetitivos, como bater as mãos ou alinhar objetos. Esses padrões comportamentais podem ser observados de forma confiável em modelos de camundongos com mutações genéticas ligadas ao TEA, tornando-os ferramentas altamente úteis para estudar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes no TEA. Compreender como as mudanças genéticas afetam a neurobiologia e os comportamentos observados no TEA facilitará o desenvolvimento de novos compostos terapêuticos direcionados para melhorar as deficiências comportamentais centrais. Nosso laboratório empregou vários protocolos que abrangem procedimentos de treinamento e teste bem descritos que refletem uma ampla gama de déficits comportamentais relacionados ao TEA. Aqui, detalhamos dois ensaios para estudar as principais características do TEA em modelos de camundongos: auto-limpeza (uma medida de comportamento repetitivo) e o teste de interação social de três câmaras (uma medida de abordagem de interação social e preferência por novidade social).

Introdução

O transtorno do espectro autista (TEA) é um distúrbio do desenvolvimento cerebral que manifesta deficiências de comunicação ou interação social e padrões restritos e repetitivos de comportamentos ou interesses ^1,2. Em 2022, aproximadamente 1 em cada 100 crianças foi diagnosticada com TEA globalmente³. De acordo com o Centers for Disease Control and Prevention (CDC, EUA), a prevalência de TEA aumentou 30% desde 2008 e aumentou mais de 2 vezes desde 2000 ^4,5. Indivíduos com TEA também podem apresentar comorbidades, como deficiência intelectual (DI) (35,2%, QI ≤ 70), transtorno de déficit de atenção/hiperatividade (TDAH) (50%-70%) e outras síndromes genéticas ^2,4,6.

O uso de modelos animais na pesquisa de TEA, especialmente roedores, forneceu informações significativas sobre o impacto de vários fatores ambientais, incluindo dieta, drogas, exercícios e enriquecimento ^7,8,9,10, bem como mutações genéticas como Shank, Fmr1, Mecp2, Pten e mutante Tsc 11,12,13 , sobre sintomas de TEA. Modelos de camundongos são comumente usados para investigar TEA devido à sua natureza social e características genéticas, bioquímicas e eletrofisiológicas compartilhadas com humanos. Por exemplo, pela deleção de um gene específico (como Shank3, Fmr1, Cntnap2 e Pten), comportamentos sociais e repetitivos aberrantes podem ser recapitulados, fornecendo forte validade do estudo 14,15,16. Aqui, fornecemos protocolos para estudar paralelos entre modelos genéticos animais e sintomas de TEA humano¹⁷. Descrevemos o teste de auto-limpeza e interação social de três câmaras, que refletem dois sintomas centrais em pacientes com TEA, ou seja, padrões restritos e repetitivos de comportamento e deficiências de interação social (comunicação), respectivamente.

Com base no DSM-V (Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais da Associação Americana de Psiquiatria^5ª Edição) e na CID-11 (Classificação Internacional de Doenças 11ª Revisão), os pacientes com TEA se envolvem em padrões de comportamento restritos, repetitivos e estereotipados, em particular, comportamentos repetitivos focados no corpo não funcionais (BFRBs), como balançar, stimming, roer as unhas, puxar o cabelo, cutucar a pele ou andar na ponta dos pés^{18, 19}. Nos animais, o comportamento repetitivo se manifesta por auto-limpeza prolongada e repetitiva. A higiene é uma das atividades inatas mais comuns entre os roedores, com aproximadamente 40% do tempo de vigília gasto na limpeza^20,21. É instintivo que os ratos lambam a pele ou o pelo para remover a sujeira estranha da superfície do corpo, o que serve para manter a limpeza do corpo, prevenir lesões, remover parasitas e regular a temperatura. O aliciamento é categorizado em dois tipos: aliciamento social (alo-aliciamento), envolvendo aliciamento por outro rato, e autoaliciamento. O auto-aliciamento mostra um padrão de sequenciamento estereotipado e conservado que consiste em quatro estágios (principalmente discretos e não sequenciais)^22,23. No estágio I (acidente vascular cerebral elíptico), os camundongos iniciam a limpeza lambendo primeiro as duas patas e depois escovando o nariz com as patas. No estágio II (AVC unilateral), os camundongos usam as patas para limpar o rosto assimetricamente. No estágio III (AVC bilateral), os camundongos limpam simetricamente a cabeça e as orelhas. No estágio IV (Lamber o corpo), os ratos fazem a transição para lamber o corpo movendo a cabeça para trás e podem estender a limpeza para a cauda e os órgãos genitais. Quando os camundongos são colocados individualmente em uma gaiola transparente, o comportamento de autolimpeza pode ser prontamente reconhecido e observado. Os camundongos aumentam o comportamento de autolimpeza quando confrontados com estresse, dor ou perturbação social, tornando o teste de autolimpeza crucial na pesquisa de distúrbios neurológicos²². Diferentes modelos de camundongos de TEA, incluindo aqueles com mutações genéticas (como Fmr1^−/y, Shank3B^−/-, NL1^−/−), intervenções farmacológicas (como DO34, PolyI:C) e cepas endogâmicas específicas (como BTBR e C58/J), demonstraram comportamento repetitivo excessivo de autolimpeza 24,25,26,27.

Alterações no comportamento social servem como um dos critérios para avaliação do TEA. De acordo com o DSM-V e a CID-11, os pacientes com TEA apresentam comprometimentos persistentes na comunicação social e na interação social^{1 8,19}. Eles podem se manifestar em déficits de comunicação verbal e não verbal (ou seja, contato visual, gestos e expressão facial anormais), falta de compartilhamento de interesses e emoções com outras pessoas, desconhecimento de pistas contextuais sociais ou dificuldades no desenvolvimento de relacionamentos. Em consonância com os sintomas de comprometimento social, várias tarefas comportamentais foram projetadas e otimizadas para avaliar as interações sociais em camundongos, como o teste de interação social direta, a abordagem social de três câmaras e o teste de preferência pela novidade social e a análise de vocalizações ultrassônicas (USVs)^16,28. O teste de interação social de três câmaras é um experimento amplamente utilizado para avaliar comportamentos relacionados ao TEA 17,29,30,31. O aparelho é composto por três câmaras conectadas; As câmaras esquerda e direita contêm uma gaiola de arame que pode estar vazia ou ocupada por um mouse, permitindo que o mouse de teste interaja livremente com ambas as gaiolas. Duas medições ajudam a avaliar diferentes aspectos do comportamento social no camundongo de teste durante o experimento de três câmaras. Primeiro, o mouse de teste é pontuado pelo tempo gasto interagindo com a gaiola vazia (novo objeto) versus uma gaiola que contém um novo mouse. Esta parte da tarefa fornece informações sobre a sociabilidade do rato. Em seguida, um mouse desconhecido é colocado na gaiola de arame anteriormente vazia. A diferença de tempo na interação do mouse de teste entre o mouse desconhecido e familiar mede a preferência pela novidade social. Nesta parte da tarefa, um mouse de controle prefere interagir com um desconhecido em vez do mouse encontrado anteriormente, que já estava presente na parte de sociabilidade do teste. Déficits na interação social e diminuição da motivação de interagir com novos camundongos são geralmente encontrados em modelos de camundongos com TEA. O teste de três câmaras provou ser robusto desde a sua invenção. Ele tem sido usado para estudar fenótipos sociais em vários modelos de camundongos de TEA, incluindo Fmr1^−/−, Shank3B^−/-, Cntnap2^−/− e a cepa endogâmica BTBR 32,33,34,35,36.

Os dois testes utilizam o comportamento espontâneo e natural de camundongos como ferramentas meritórias para estudar o comportamento semelhante ao TEA. Por serem considerados testes de baixo estresse, é viável realizar os dois testes dentro do mesmo grupo de camundongos para medir o comportamento semelhante ao TEA, com o teste de autolimpeza sendo realizado primeiro e o teste de interação social de três câmaras nos dias subsequentes. Os protocolos que fornecemos apresentam uma ferramenta essencial para a avaliação do comportamento semelhante ao TEA e o desenvolvimento de novas terapêuticas 29,30,31. Em última análise, eles contribuiriam para melhorar os resultados para indivíduos afetados por TEA.

Protocolo

Todos os procedimentos e experimentos envolvendo animais foram aprovados pelos regulamentos do Comitê de Cuidados com Animais de Instalações (FACC), que seguem as diretrizes estabelecidas pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais, pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade McGill e pelo Escritório de Bem-Estar de Animais de Laboratório (OLAW) do NIH. O número de garantia do Serviço de Saúde Pública (PHS) da Universidade McGill é F-16-00005 (A5006-01).

1. Preparação animal

1. Ratos de teste: Selecione camundongos machos e/ou fêmeas de 2-3 meses (8 a 13 semanas) de idade. Todos os camundongos usados nos experimentos aqui são de origem C57BL / 6J. Para o comportamento de auto-limpeza e os ensaios de interação social de três câmaras, a faixa geralmente aceitável de camundongos por grupo sugerida é n = 10-15, com um mínimo de n = 8.
   1. Para camundongos geneticamente modificados, sempre adicione irmãos de ninhada de tipo selvagem como controle. Combine o grupo de controle com o grupo experimental em termos de antecedentes genéticos, idade, sexo e condições de alojamento. Os camundongos transgênicos homozigotos usados neste estudo são normais em tamanho e não apresentam nenhuma anormalidade física grosseira.
      NOTA: Em alguns casos mais complexos, os pesquisadores podem estar interessados em avaliar mais de dois genótipos (ou seja, tipo selvagem, heterozigoto, homozigoto), investigar os efeitos de drogas (ou seja, tratamento, tratamento com veículo, não tratamento) ou comparar machos e fêmeas. Ao trabalhar com camundongos fêmeas, é crucial levar em consideração seus ciclos estrais. Embora os ciclos estrais femininos não influenciem significativamente os comportamentos de auto-higiene, estudos indicaram que esses ciclos podem afetar a abordagem social e a preferência pela novidade social^37,38.
2. Camundongos estranhos: Use pelo menos 8 camundongos do tipo selvagem para o teste de três câmaras. Use 2 gaiolas, 4 camundongos por gaiola, idade correspondente, sexo e o mesmo histórico genético (C57BL / 6J) dos camundongos de teste. Certifique-se de que os ratos estranhos não tiveram interação anterior com os ratos de teste.
3. Alojamento: Agrupamento: Gaiolas de plástico de camundongo de 3 a 5 "em casa" por gaiola doméstica (71/2" L x 111/2" C x 5" A em gaiolas de plástico de camundongo) e manter em um ciclo claro/escuro de 12 h. Forneça aos ratos acesso a comida e água na gaiola ad libitum.
   NOTA: Nos quartos deste estudo, as luzes acendem às 7h00.
4. Transfira os camundongos para a instalação de testes comportamentais em animais por um período mínimo de 1 semana antes dos experimentos^39,40.
5. Manuseio e teste comportamental: Realize o teste em um horário consistente do dia. Ajuste a hora de início dependendo do ciclo de luz nas salas de alojamento do mouse. Primeiro, transfira os camundongos para a sala de testes e permita que eles se habituem à sala de testes por um mínimo de 30 minutos sob iluminação fraca antes de iniciar os testes comportamentais.
   NOTA: Neste estudo, os experimentos com camundongos foram realizados rotineiramente entre 7:00 e 15:00 (em relação às 7:00 da manhã com luz acesa e 19:00 com luz apagada). Portanto, o início real do teste de comportamento ocorre por volta das 8h.

2. Preparação da sala e do equipamento

1. Prepare uma pequena sala com áreas totais entre 16-36 pés (5-12 m²; sala de 6 m² neste estudo). Mantenha temperatura, iluminação (iluminação escurecida ajustável) e níveis de ruído consistentes (idealmente à prova de som) para todos os experimentos.
   1. Se utilizar lâmpadas de pé (lâmpadas de 23 W, 120 V), coloque-as em locais simétricos e de cada lado, a pelo menos 1 m de distância do aparelho de três câmaras, para iluminar igualmente as duas câmaras laterais.
2. Coloque o aparelho em uma mesa branca portátil. Para o experimento de auto-limpeza, use gaiolas limpas e transparentes (71/2" L x 111/2" C x 5" A gaiolas de plástico para camundongos); Use uma gaiola por mouse de teste. Encha as gaiolas com aproximadamente 1 cm de cama fresca sem material de nidificação. Use o mesmo tipo de cama da gaiola doméstica (aqui, cama de espiga de milho fresca ([1/4 "de cama de espiga de milho]).
   NOTA: As gaiolas devem ser do mesmo tamanho que as gaiolas domésticas, com uma tampa de filtro colocada na parte superior, mas sem uma grade de metal (que normalmente é usada para guardar garrafas e entrega de comida).
3. Para o experimento social, use um aparelho de três câmaras conjunto⁴¹. Cada câmara tem 20 cm x 40 cm x 22 (a) cm e é cercada por paredes de acrílico. Cada câmara lateral é acessível a partir do centro por portas deslizantes transparentes que podem ser removidas (5 x 8 cm). Use duas gaiolas de arame (diâmetro: 7 cm, altura: 15 cm; com tampas de cobertura (ratos vazios ou segurando estranhos). A gaiola é elevada e fechada por barras de arame de aço inoxidável lisas (diâmetro da barra: 3 mm, espaçamento entre barras: 7 mm). Não inclua sentar em cima das gaiolas como tempo de interação.
   1. Se camundongos machos e fêmeas forem incluídos no experimento, rotule cada gaiola de arame por sua função dedicada para minimizar a contaminação cruzada.
4. Configure câmeras aéreas ou frontais em tripés para gravações de vídeo. Certifique-se de que as câmeras estejam totalmente carregadas e tenham armazenamento suficiente.
5. Entre cada experimento com camundongos de teste, limpe bem a configuração de três câmaras e as gaiolas de arame com um agente de limpeza inodoro (aqui, Versa-Clean). Dilua o agente de limpeza em água da torneira na proporção de 1:40, aplique-o na superfície suja e seque as superfícies com uma toalha de papel antes do próximo teste para minimizar o odor residual do mouse anterior.
   NOTA: Álcool etílico (70%) ou outros desinfetantes com odores não devem ser usados para limpar o aparelho durante os testes de interação social, pois podem afetar o comportamento social dos roedores.
6. Use persianas de privacidade, como placas de plástico brancas, que podem ser colocadas ao redor do aparelho para eliminar sinais externos da sala.
7. Prepare um pequeno quadro branco e um marcador. Registre informações essenciais no quadro branco, incluindo o número do mouse, o título do experimento, a data e a hora do experimento.
   NOTA: O quadro branco é apresentado à câmera no final da gravação para evitar que a pessoa que marcou o número do mouse saiba o número do mouse antes de avaliar o comportamento do mouse. O estudo garantiu que o comportamento de pontuação individual permanecesse cego para os grupos experimentais para minimizar possíveis vieses.

3. Manuseio

1. Realize procedimentos de manuseio por três dias consecutivos antes do início dos experimentos comportamentais.
2. Realize sessões de manuseio na mesma sala de testes em um horário consistente, de preferência pela manhã, quando os ratos estão mais ativos.
3. Em cada um dos 3 dias, leve os ratos para a sala de testes e deixe-os intactos por 30 minutos com pouca luz para se aclimatarem.
4. Após um período de aclimatação de 30 minutos, abra a gaiola e introduza uma mão enluvada na gaiola. Deixe os ratos explorarem a mão por 1 min.
5. Delicadamente, coloque os ratos na mão (ou use um pequeno tubo de papelão para pegá-los), segurando-os frouxamente. Permita que os ratos explorem a mão e o pulso por 1-2 min. Nos casos em que um mouse está nervoso ou agressivo, coloque-o na grade e permita que ele se recomponha.
6. Continue manuseando até que o mouse se sinta confortável em ficar na mão. Sempre troque as luvas antes de introduzir as mãos na próxima gaiola.
7. Depois de manusear cada gaiola de camundongos, coloque-os suavemente em sua gaiola doméstica e repita o procedimento.
8. Coloque luvas novas e manuseie ratos estranhos quando todos os ratos experimentais e de controle tiverem sido manuseados para evitar afetar os ratos de teste com mensagens perfumadas.
9. Lide com os ratos estranhos da mesma maneira.
10. Opcional: Habitue os ratos estranhos à gaiola de arame e ao aparelho de três câmaras por 10-15 min.
    NOTA: Esta sessão de habituação ajuda a reduzir a agitação e os comportamentos aberrantes nos camundongos estranhos durante o teste de três câmaras. No entanto, para o teste de três câmaras, este estudo considera apenas o comportamento de abordagem social (sniffing) da gaiola iniciada pelo camundongo de teste, independentemente de um camundongo estranho estar presente ou não. A cheirada recíproca pelo camundongo estranho não é observável de forma confiável neste ensaio e, portanto, não é contada. Devido a essa limitação do teste de três câmaras e para minimizar a contaminação cruzada de sinais químicos (como cheiros), neste caso, os camundongos estranhos não tinham experiência anterior com a gaiola de arame e o aparelho antes do início do experimento.

4. Método 1: Auto-limpeza para comportamento repetitivo (Figura 1A)

1. Realize todos os experimentos comportamentais entre 7h00 e 3h00.
2. Ligue as luzes reduzidas, conforme descrito acima. Limpe a mesa e arrume a sala.
3. Preparar cada gaiola de ensaio com uma fina camada de cama fresca (conforme descrito no passo 2.2).
4. Coloque 1-2 gaiolas sobre a mesa, separadas umas das outras e do ambiente da sala por antolhos de plástico branco.
5. Coloque uma câmera na frente de cada gaiola para capturar o mouse de teste.
6. Transfira todos os ratos para a sala e cubra as gaiolas com uma folha de tecido durante o processo de transferência para evitar estresse.
7. Remova a folha assim que os ratos forem colocados na sala de testes, deixando-os na sala por pelo menos 30 minutos com luzes fracas antes do início do experimento.
8. No início do teste, anote o número de identificação do mouse e as informações de teste em um quadro branco (conforme descrito na etapa 2.7).
9. Comece a gravar e coloque o mouse de teste na gaiola de teste.
10. Saia da sala durante a sessão de gravação de 20 minutos.
11. Para cada teste, considere os primeiros 10 minutos como habituação. Use os 10 minutos a seguir para observar e pontuar o comportamento de limpeza (consulte a seção 6).
12. Após 20 minutos, retorne ao quarto. Apresente o quadro branco para a câmera e pare a gravação.
13. Coloque suavemente o mouse de teste de volta na gaiola inicial e repita o experimento.
    NOTA: Contrabalanceie a ordem dos testes entre os grupos experimental e de controle para reduzir várias influências externas.
14. Após o término dos experimentos, devolva os ratos ao seu alojamento.

5. Método 2: Teste de interação social tricameral (Figura 2A)

1. Realize todos os experimentos entre 7h00 e 3h00.
2. Limpe a mesa e acenda as luzes (luzes esmaecidas).
3. Coloque o instrumento de plexiglass de três câmaras sobre a mesa cercado por persianas de privacidade.
4. Coloque uma câmera acima da cabeça, garantindo que todas as três câmaras estejam no quadro de gravação da câmera.
5. Transfira os ratos de teste e estranhos para a sala. Cubra as gaiolas com um lençol de tecido durante o processo de transferência e remova o lençol uma vez na sala.
6. Deixe os ratos na sala por pelo menos 30 minutos com iluminação fraca antes do início do experimento.
7. Habituation
   1. Mantenha as três câmaras vazias durante a fase de habituação.
   2. Para começar, selecione um mouse de teste e escreva o número de identificação no quadro branco.
   3. Em seguida, coloque suavemente o mouse de teste no compartimento central enquanto as portas deslizantes ainda estão fechadas.
   4. Comece a gravar e abra as portas para permitir que o mouse de teste explore as três câmaras vazias.
   5. Saia da sala e deixe o rato de teste habituar-se ao aparelho durante 10 min.
   6. Após 10 minutos de habituação, volte para a sala. Guie o mouse de teste suavemente para o compartimento central e feche as portas deslizantes.
   7. Exiba o quadro branco e pare a câmera.
8. Abordagem social (novo objeto de gaiola de arame versus novo rato estranho 1)
   1. Posicione duas gaiolas de arame nas câmaras esquerda e direita. Coloque essas gaiolas diagonalmente opostas uma à outra nos cantos de cada câmara, garantindo uma folga de 5 cm da parede, permitindo que o mouse de teste corra ao redor das gaiolas. Além disso, certifique-se de que as gaiolas não estejam voltadas diretamente para as portas da câmara.
   2. Escolha um rato estranho e introduza-o em uma das gaiolas de arame, enquanto nenhum rato está presente na outra gaiola de arame.
   3. Para iniciar o teste, pressione gravar e remova as duas portas deslizantes. Saia da sala.
   4. Permita que o camundongo de teste explore uma gaiola de arame vazia em uma câmara e uma gaiola contendo um camundongo estranho (novo camundongo estranho 1 ou S1) na outra câmara por 10 minutos.
   5. Após 10 min, retorne ao quarto. Exiba o quadro branco para a câmera e encerre a gravação.
   6. Reintroduza o mouse no compartimento central e feche as portas de interconexão.
      NOTA: Não remova as gaiolas de arame da configuração após terminar o teste de aproximação social para que permaneçam na mesma posição durante toda a tarefa.
9. Preferência por novidade social (romance rato estranho 2 versus rato romance 1)
   1. Coloque um rato novo e nunca encontrado na gaiola de arame anteriormente vazia (novo rato estranho 2 ou S2).
      NOTA: S2 deve ser de uma gaiola doméstica diferente da S1.
   2. Comece a gravar e abra as portas interconectadas para permitir que o mouse de teste explore o aparelho por 10 min.
   3. Saia da sala. O mouse de teste explorará duas gaiolas de arame: uma com o mouse S1 encontrado anteriormente do estágio de abordagem social e a outra com o mouse S2 recém-introduzido.
   4. Após 10 min, retorne ao quarto. Exiba o quadro branco para a câmera e conclua a gravação.
   5. Devolva todos os ratos (ratos estranhos de teste e novos) para suas gaiolas domésticas.
   6. Limpe completamente as câmaras e gaiolas de arame com desinfetante sem odor. Certifique-se de que o aparelho esteja seco antes de usá-lo para o próximo experimento.
   7. Repita o experimento para todos os camundongos de teste restantes.
      NOTA: Alterne a colocação das gaiolas com camundongos S1 e S2 entre as câmaras esquerda e direita para os diferentes camundongos de teste. O contrapeso evita uma preferência tendenciosa por uma câmara específica do aparelho.
   8. Após o teste, devolva os ratos ao alojamento.
   9. Entre cada parte do teste, pare e reinicie a câmera, resultando em 3 vezes vídeos de 10 minutos por mouse de teste.

6. Pontuação e análise estatística

1. Equipamento necessário
   1. Use dois cronômetros e um computador ou laptop com o seguinte software: Microsoft Excel, GraphPad Prism e outros programas estatísticos, como SPSS, para pontuação, plotagem de gráficos e análise estatística.
2. Pontuação de auto-limpeza
   NOTA: Quando um mouse é colocado em um ambiente confortável, pode-se observar um comportamento espontâneo de autolimpeza de baixo estresse. Normalmente, os camundongos iniciam a limpeza lambendo as patas ao redor do nariz e dos bigodes (estágio I). Isso pode ser seguido pelos estágios II e III, onde o rato passa a limpar todo o rosto e a cabeça com as patas. No estágio IV, o camundongo continua cuidando de seu corpo e lambendo sua cauda¹⁴. Dada a raridade de escovar suas orelhas (estágio III) e caudas (estágio IV) dentro de um período de teste de 10 minutos, e com o objetivo de aumentar a clareza da análise manual, o comportamento de autolimpeza foi categorizado em dois tipos principais: limpeza rostal e limpeza caudal. A limpeza rostral envolve atividades como lamber as patas, escovar o nariz e lavar bem o rosto, orelhas e cabeça. A limpeza caudal inclui lamber a parte do corpo que cobre áreas como barriga, costas, membros posteriores e área genital, bem como a cauda.
   1. Observe o comportamento de higiene cuidadosamente e registre as lutas. Uma sessão de preparação individual acontece quando o mouse se envolve em uma única instância de autolimpeza. Considere uma sessão de higiene desde o momento em que ela começa até que pare, independentemente dos comportamentos específicos de higiene envolvidos.
   2. Se o mouse de teste pausar sua preparação por alguns segundos sem mudar de posição, conte-o como parte da mesma luta. No entanto, se o rato parar de se preparar e começar a explorar, considere que a luta de limpeza foi concluída.
   3. Além disso, grave apenas uma sessão completa de tosa quando o mouse se preparar continuamente da frente para trás (do estágio I ao estágio IV).
   4. Documente o tempo total de preparação, o número de sessões de preparação e o número de sessões completas de preparação observadas durante o período de teste de 10 minutos, marcando as observações em intervalos de 2 minutos, 5 minutos e 10 minutos.
3. Teste de interação social de três câmaras
   A análise determina o tempo e a frequência da interação de farejamento com cada camundongo (romance S1 e gaiola vazia para abordagem social, e S1 e romance S2 para a preferência por novidade social).
   1. Use dois temporizadores para registrar o tempo de interação com o mouse em cada gaiola e o tempo total gasto em cada câmara. Para cada parte do teste (abordagem social e preferência pela novidade social), registre o número de vezes que o camundongo de teste entra em cada câmara (total de entradas).
   2. Determine o tempo no(s) compartimento(s) pela presença do corpo do camundongo de teste dentro de uma das câmaras (quatro patas devem entrar).
   3. Registre o (s) tempo (s) de interação quando o mouse de teste fareja o novo mouse estranho (contato direto com o rosto ou cheirando a cauda do mouse estranho) ou cheira a gaiola vazia. Não considere sentar no topo da gaiola como interação.
   4. Grave em 2 min, 5 min e 10 min. Faça uma análise dependente do tempo.
   5. Compare o índice de discriminação de sociabilidade (DI) dentro dos grupos.
      NOTA: O DI é calculado como: DI = (tempo de interação com o mouse S1 - tempo de interação com a gaiola vazia)/tempo total de interação x 100. Durante a parte da novidade social, os ratos de controle interagirão mais com S2 (rato desconhecido) do que com S1 (rato familiar). O DI de novidade social (memória social) é calculado: DI = (tempo interagindo com o camundongo S2 - tempo interagindo com o camundongo familiar (S1))/ tempo total de interação x 100.
4. Análise estatística
   1. Use um teste T de Student não pareado bicaudal para calcular os valores de p com um nível significativo definido em p < 0,05 para o tempo de auto-preparação, sessões e sessões completas, onde há apenas dois grupos.
   2. Para o teste de três câmaras, use o teste T de Student para calcular a significância estatística do total de entradas entre dois grupos. Quando a suposição da variância igual dos dados entre os grupos não for atendida (teste de Levene p < 0,05), realizar um teste T de Welch para ajustar o desvio e comparar as médias dos grupos independentes.
      NOTA: A medição do total de entradas avalia a atividade geral dos camundongos. Podem surgir preocupações potenciais (relacionadas ao comprometimento motor e altos níveis de ansiedade de camundongos) se o grupo experimental explorar o aparelho de três câmaras significativamente menos do que o grupo controle. Para resolver isso, considere avaliar a função motora e o comportamento semelhante à ansiedade com testes comportamentais semelhantes aos depressivos, pois a diminuição da exploração pode ser atribuída a essas condições⁴².
   3. Use uma ANOVA de via mista para comparar o tempo em cada câmara e o tempo de interação para cada teste. Dependendo do número de grupos e fatores, use uma ANOVA mista de duas vias (2 fatores: genótipo e lado da câmara, ou interagindo com gaiola vazia e S1, ou S1 e S2), ou uma ANOVA mista de três vias (3 fatores: genótipo, tratamento e lado da câmara, ou interagindo com vazio e S1, ou S1 e S2). Esta análise é particularmente útil para revelar a interação social estatisticamente significativa de camundongos entre vários fatores.
      NOTA: Esses fatores incluem o principal efeito do genótipo (impacto de diferentes origens genéticas nos comportamentos sociais), o principal efeito da interação com a gaiola (cheirar e preferir um novo camundongo estranho versus uma gaiola vazia ou camundongo encontrado anteriormente), o principal efeito do tratamento (impacto de vários tratamentos medicamentosos nos comportamentos sociais do camundongo) e a interação genótipo x tratamento (revelar como o tratamento aplicado afeta o genótipo).
   4. Posteriormente, usar o teste post hoc de Bonferroni (nível α definido em 0,05) para avaliar melhor a comparação entre diferentes grupos.

Resultados

O alvo mamífero da rapamicina (mTOR) desempenha papéis cruciais no sistema nervoso central (SNC), regulando a síntese proteica de novo e reprimindo a autofagia⁴³. A desregulação da via mTOR e da síntese de proteínas sinápticas tem sido implicada no TEA²⁸. Estudos genômicos em pacientes com TEA identificaram várias mutações genéticas associadas ao TEA, incluindo aquelas que afetam proteínas envolvidas na sinalização ...

Discussão

A maioria das causas etiológicas, alterações patológicas e marcadores biológicos de TEA não são conhecidos ou estão disponíveis. O diagnóstico de TEA é baseado principalmente em dois conjuntos estabelecidos de sintomas clínicos: déficits persistentes na comunicação social e comportamentos repetitivos excessivos 18,19,55. Dado que o TEA é um distúrbio do espectro que abrange uma ...

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Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	AN75PLF	AN75 Mouse 7½” W x 11½” L x 5” H
TÅGARP floor lamp and bulbs	IEKA	604.640.49	Bulbs are 23 W 120 V.
Ugo Basile Sociability Apparatus	Stoelting	60450	The Sociability Apparatus (3-chambered social test) is a valuable tool to study social behaviour in mice.
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Whiteboard and  Low Odor Dry Erase Marker	EXPO	NA	Dry erase markers in bold black