생쥐의 자폐증과 유사한 행동을 평가하기 위한 전략

요약

설치류 모델은 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 관련된 핵심 행동을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 기사에서는 생쥐에서 ASD의 핵심 기능을 모델링하기 위한 두 가지 행동 테스트, 즉 반복적인 행동을 평가하는 셀프 그루밍(self-grooming)과 사회적 장애를 문서화하는 3개의 챔버 사회적 상호 작용 테스트(three-chamber social interaction test)에 대해 설명합니다.

초록

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 이질적인 유전적 병인을 가진 신경생물학적으로 복잡한 상태입니다. 임상적으로 ASD는 사회적 의사소통 장애와 손을 펄럭이거나 물건을 정렬하는 것과 같은 제한적이거나 반복적인 행동으로 진단됩니다. 이러한 행동 패턴은 ASD 관련 유전적 돌연변이가 있는 마우스 모델에서 안정적으로 관찰될 수 있으므로 ASD의 기본 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다. 유전적 변화가 ASD에서 관찰되는 신경생물학 및 행동에 어떤 영향을 미치는지 이해하면 핵심 행동 장애를 개선하기 위한 새로운 표적 치료 화합물의 개발을 촉진할 수 있습니다. 우리 연구실은 ASD와 관련된 광범위한 행동 결함을 반영하는 잘 설명된 교육 및 테스트 절차를 포괄하는 여러 프로토콜을 채택했습니다. 여기에서는 마우스 모델에서 ASD의 핵심 기능을 연구하기 위한 두 가지 분석법, 즉 self-grooming(반복적인 행동의 척도)과 three-chamber social interaction test(사회적 상호 작용 접근 방식 및 사회적 새로움에 대한 선호의 척도)에 대해 자세히 설명합니다.

서문

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 의사소통 또는 상호작용 장애와 제한적이고 반복적인 행동 또는 관심 패턴을 나타내는 발달 뇌 장애입니다 ^1,2. 2022년 전 세계적으로 아동 100명 중 약 1명이 ASD 진단을 받았습니다³. 미국 질병통제예방센터(CDC)에 따르면 ASD 유병률은 2008년 이후 30% 증가했으며 2000년 이후 2배 이상 증가했습니다 ^4,5. ASD를 앓고 있는 개인은 지적 장애(ID)(35.2%, IQ ≤ 70), 주의력 결핍/과잉 행동 장애(ADHD)(50%-70%) 및 기타 유전 증후군과 같은 동반 질환을 보일 수도 있습니다 ^2,4,6.

ASD 연구에서 동물 모델, 특히 설치류를 사용하면 식단, 약물, 운동 및 농축 ^7,8,9,10을 포함한 다양한 환경 요인과 Shank, Fmr1, Mecp2, Pten 및 Tsc 돌연변이 11,12,13와 같은 유전적 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다, ASD 증상에. 마우스 모델은 사회적 특성과 인간과 유전적, 생화학적, 전기생리학적 특징을 공유하기 때문에 ASD를 조사하는 데 일반적으로 사용됩니다. 예를 들어, 특정 유전자(예: Shank3, Fmr1, Cntnap2 및 Pten)를 삭제함으로써 비정상적인 사회적 및 반복적 행동을 재현할 수 있으며, 이는 연구의 강력한 타당성을 제공합니다 14,15,16. 여기에서는 동물 유전자 모델과 인간 ASD 증상¹⁷ 간의 유사점을 연구하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 ASD 환자의 두 가지 핵심 증상, 즉 제한적이고 반복적인 행동 패턴과 사회적 상호 작용(의사 소통) 장애를 각각 반영하는 셀프 그루밍 테스트와 3실 사회적 상호 작용 테스트에 대해 설명합니다.

DSM-V(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders of the American Psychiatric Association 5^판) 및 ICD-11(International Classification of Diseases 11th Revision)에 따르면, ASD 환자는 제한적이고 반복적이며 정형화된 행동 패턴, 특히 흔들기, 자극하기, 손톱 물어뜯기, 머리카락 잡아당기기, 피부 따기, 발가락 걷기와 같은 비기능적 신체 중심 반복 행동(BFRB)에 참여한다^{18, 19}. 동물의 경우, 반복적인 행동은 장기적이고 반복적인 자기 그루밍으로 나타납니다. 그루밍은 설치류에서 가장 흔한 타고난 활동 중 하나이며, 깨어 있는 시간의 약 40%가 그루밍에 소비됩니다^20,21. 생쥐가 피부나 털을 핥아 신체 표면의 이물질을 제거하는 것은 본능적이며, 이는 신체의 청결을 유지하고 부상을 방지하며 기생충을 제거하고 온도를 조절하는 역할을 합니다. 그루밍은 두 가지 유형으로 분류됩니다 : 사회적 그루밍 (allo-grooming), 다른 마우스에 의한 그루밍, 자체 그루밍. 셀프 그루밍(self-grooming)은 4단계(대부분 불연속적이고 비순차적)로 구성된 정형화되고 보존된 염기서열 분석 패턴을 보여줍니다^22,23. I단계(타원형 뇌졸중)에서 생쥐는 먼저 양쪽 발을 핥은 다음 발로 코 주위를 손질하여 그루밍을 시작합니다. II단계(편측성 뇌졸중)에서 생쥐는 발을 사용하여 얼굴을 비대칭으로 닦습니다. III단계(양측 뇌졸중)에서 생쥐는 머리와 귀를 대칭으로 닦습니다. IV 단계(몸 핥기)에서 생쥐는 머리를 뒤로 움직여 몸 핥기로 전환하고 꼬리와 생식기까지 그루밍을 확장할 수 있습니다. 생쥐를 개별적으로 투명한 케이지에 넣으면 자체 그루밍 행동을 쉽게 인식하고 관찰할 수 있습니다. 생쥐는 스트레스, 통증 또는 사회적 혼란에 직면했을 때 자기 그루밍 행동을 증가시키기 때문에 신경 장애를 연구할 때 자기 그루밍 테스트가 매우 중요하다²². 유전적 돌연변이(예: Fmr1^−/y, Shank3B^−/-, NL1^−/-), 약리학적 중재(예: DO34, PolyI:C) 및 특정 근친 균주(예: BTBR 및 C58/J)를 포함한 다양한 ASD 마우스 모델은 과도한 반복적인 자기 그루밍 행동을 보여주었습니다 24,25,26,27.

사회적 행동의 변화는 ASD를 평가하는 기준 중 하나입니다. DSM-V와 ICD-11에 따르면, ASD 환자는 지속적인 사회적 의사소통 및 사회적 상호작용 장애를 보인다^{1 8,19}. 이는 언어적 및 비언어적 의사소통 결핍(예: 비정상적인 눈맞춤, 몸짓, 얼굴 표정), 관심과 감정을 다른 사람과 공유하지 못함, 사회적 맥락적 단서를 인식하지 못하거나 관계를 발전시키는 데 어려움이 있는 것으로 나타날 수 있습니다. 사회적 장애 증상에 따라 직접적인 사회적 상호 작용 테스트, 3 챔버 사회적 접근 및 사회적 신규성에 대한 선호도 테스트, 초음파 발성 (USV) 분석과 같은 마우스의 사회적 상호 작용을 평가하기 위해 다양한 행동 작업이 설계되고 최적화되었습니다 ^{16 , 28}. 3-챔버 사회적 상호작용 검사는 ASD 관련 행동을 평가하기 위해 광범위하게 사용되는 실험입니다 ^17,29,30,31. 상기 장치는 3개의 연결된 챔버로 구성되고; 왼쪽 및 오른쪽 챔버에는 비어 있거나 마우스가 차지할 수 있는 와이어 케이지가 있어 테스트 마우스가 두 케이지와 자유롭게 상호 작용할 수 있습니다. 두 가지 측정은 3 챔버 실험 동안 테스트 마우스의 사회적 행동의 다양한 측면을 평가하는 데 도움이 됩니다. 먼저, 테스트 마우스는 새로운 마우스가 포함된 케이지와 비교하여 빈 케이지(새로운 개체)와 상호 작용하는 데 소요된 시간에 대해 점수가 매겨집니다. 작업의 이 부분은 마우스의 사교성에 대한 통찰력을 제공합니다. 다음으로, 익숙하지 않은 마우스를 이전에 비어 있던 와이어 케이지에 넣습니다. 낯선 마우스와 친숙한 마우스 간의 테스트 마우스 상호 작용의 시간 차이는 사회적 새로움에 대한 선호도를 측정합니다. 작업의 이 부분에서 제어 마우스는 테스트의 사교성 부분에 이미 존재했던 이전에 만난 마우스보다 익숙하지 않은 마우스와 상호 작용하는 것을 선호합니다. 사회적 상호작용의 결핍과 새로운 마우스와의 상호작용에 대한 동기 감소는 일반적으로 ASD의 마우스 모델에서 발견됩니다. 3 챔버 테스트는 발명 이후 견고 함이 입증되었습니다. Fmr1^−/−, Shank3B^−/-, Cntnap2^−/− 및 BTBR 근 친 균주^{32,33,34,35,36}을 포함한 ASD의 다양한 마우스 모델에서 사회적 표현형을 연구하는 데 사용되었습니다.

두 가지 테스트는 ASD와 같은 행동을 연구하기 위한 유용한 도구로 생쥐의 자연적으로 발생하는 자발적인 행동을 활용합니다. 스트레스가 적은 테스트로 간주되기 때문에 ASD와 유사한 행동을 측정하기 위해 동일한 마우스 그룹 내에서 두 테스트를 모두 수행하는 것이 가능하며, 셀프 그루밍 테스트를 먼저 수행하고 다음 날에 3개의 챔버 사회적 상호 작용 테스트를 수행합니다. 우리가 제공하는 프로토콜은 ASD와 유사한 행동을 평가하고 새로운 치료법을 개발하기 위한 필수 도구입니다 29,30,31. 궁극적으로, 그들은 ASD의 영향을 받는 개인의 결과를 개선하는 데 기여할 것입니다.

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프로토콜

동물 피험자와 관련된 모든 절차와 실험은 캐나다 동물 관리 위원회(Canadian Council on Animal Care), 맥길 대학 동물 관리 위원회(McGill University Animal Care Committee) 및 NIH 실험실 동물 복지 사무국(OLAW)에서 제정한 지침을 따르는 시설 동물 관리 위원회(FACC) 규정에 의해 승인되었습니다. McGill University의 공중 보건 서비스(PHS) 보증 번호는 F-16-00005(A5006-01)입니다.

1. 동물 준비

1. 테스트 마우스: 2-3개월(8-13주) 생후 수컷 및/또는 암컷 마우스를 선택합니다. 여기 실험에 사용된 모든 마우스는 C57BL/6J 배경의 마우스입니다. 자가 그루밍 행동 및 3-챔버 사회적 상호 작용 분석의 경우, 제안된 그룹당 일반적으로 허용되는 마우스 범위는 n = 10-15이며 최소 n = 8입니다.
   1. 유전자 변형 마우스의 경우 항상 야생형 리터메이트를 대조군으로 추가하십시오. 유전적 배경, 연령, 성별 및 주거 조건 측면에서 대조군을 실험군과 일치시킵니다. 이 연구에 사용된 동형접합 형질전환 마우스는 크기가 정상이며 심각한 신체적 이상을 나타내지 않습니다.
      참고: 좀 더 복잡한 사례의 경우, 연구자들은 두 가지 이상의 유전자형(즉, 야생형, 이형접합적, 동형접합적)을 평가하거나, 약물의 효과를 조사하거나(즉, 치료, 차량 치료, 비치료), 남성과 여성을 비교하는 데 관심이 있을 수 있습니다. 암컷 마우스로 작업할 때는 발정 주기를 고려하는 것이 중요합니다. 여성의 발정 주기는 자기 그루밍 행동에 큰 영향을 미치지 않지만, 연구에 따르면 이러한 주기가 사회적 접근과 사회적 새로움에 대한 선호에 영향을 미칠 수 있다고 한다 ^37,38.
2. 낯선 쥐: 3 챔버 테스트에 최소 8마리의 야생형 마우스를 사용합니다. 2개의 케이지, 케이지당 4마리의 마우스, 일치하는 연령, 성별 및 테스트 마우스와 동일한 유전적 배경(C57BL/6J)을 사용합니다. 낯선 마우스가 테스트 마우스와 사전에 상호 작용하지 않았는지 확인합니다.
3. 하우징 : 그룹 하우스 가정용 케이지 당 3-5 마우스 (71/2 "W x 111/2"L x 5 "H 마우스 플라스틱 케이지) 및 12 시간 라이트 / 다크 사이클로 유지. 쥐가 케이지 내에서 음식과 물에 접근할 수 있도록 합니다.
   참고: 이 연구실의 기숙사에서는 오전 7:00에 조명이 켜집니다.
4. 실험^39,40 전에 최소 1주일 동안 마우스를 동물 행동 테스트 시설로 옮깁니다.
5. 취급 및 행동 테스트: 하루 중 일정한 시간에 테스트를 수행합니다. 마우스 하우징 룸의 조명 주기에 따라 시작 시간을 조정합니다. 먼저, 쥐를 시험장으로 옮기고 행동 테스트를 시작하기 전에 어두운 조명 아래에서 최소 30분 동안 시험장에 익숙해지도록 합니다.
   참고: 이 연구에서 마우스 실험은 오전 7:00-오후 3:00 사이에 일상적으로 수행되었습니다(오전 7:00 불이 켜지고 오후 7:00 불이 꺼지는 것과 관련하여). 따라서 행동 테스트의 실제 시작은 오전 8시경에 이루어집니다.

2. 객실 및 장비 준비

1. 전체 바닥 면적이 16-36피트(이 연구에서는 5-12m², 6m² 방) 사이인 작은 방을 준비합니다. 모든 실험에 대해 일관된 온도, 조명(조정 가능한 희미한 조명) 및 소음 수준(이상적으로는 방음)을 유지합니다.
   1. 스탠딩 램프(전구 23W, 120V)를 사용하는 경우 대칭적인 위치와 3챔버 장치에서 최소 1m 떨어진 각 측면에 배치하여 두 측면 챔버를 동일하게 비춥니다.
2. 휴대용 흰색 테이블 위에 기기를 놓으십시오. 자가 손질 실험의 경우 깨끗하고 투명한 케이지(71/2" W x 111/2" L x 5" H 마우스 플라스틱 케이지)를 사용합니다. 테스트 마우스당 하나의 케이지를 사용하십시오. 중첩 재료 없이 약 1cm의 새 침구로 케이지를 채웁니다. 가정용 케이지와 동일한 유형의 침구를 사용하십시오(여기서는 신선한 옥수수 속대 침구([1/4" 옥수수 속대 침구]).
   참고: 케이지는 가정용 케이지와 크기가 같아야 하며 상단에 필터 뚜껑이 있어야 하지만 금속 그리드(일반적으로 병과 음식 배달을 보관하는 데 사용됨)가 없어야 합니다.
3. 사회 실험을 위해, 3-챔버 장치 세트⁽⁴¹)를 사용한다. 각 챔버는 20cm x 40cm x 22(h)cm이며 플렉시글라스 벽으로 둘러싸여 있습니다. 각 측면 챔버는 제거할 수 있는 투명 슬라이딩 도어(5 x 8cm)를 통해 중앙에서 접근할 수 있습니다. 두 개의 철사 케이지 (직경 : 7cm, 높이 : 15cm, 덮개 뚜껑 포함) (비어 있거나 낯선 마우스를 들고있는)를 사용하십시오. 케이지는 높은 곳에 있으며 부드러운 스테인리스 스틸 와이어 바(바 직경: 3mm, 바 간격: 7mm)로 둘러싸여 있습니다. 상호 작용 시간으로 케이지 위에 앉는 것을 포함하지 마십시오.
   1. 수컷과 암컷 마우스가 모두 실험에 포함된 경우 교차 오염을 최소화하기 위해 각 와이어 케이지에 전용 기능에 대해 레이블을 지정합니다.
4. 비디오 녹화를 위해 삼각대에 머리 위 또는 전면 카메라를 설정합니다. 카메라가 완전히 충전되어 있고 충분한 저장 공간이 있는지 확인하십시오.
5. 각 테스트 마우스 실험 사이에 3 챔버 설정과 와이어 케이지를 무취 세척제(여기서는 Versa-Clean)로 철저히 청소하십시오. 세척제를 수돗물에 1:40의 비율로 희석하여 더러워진 표면에 바르고 다음 테스트 전에 종이 타월로 표면을 건조시켜 이전 마우스의 잔류 냄새를 최소화합니다.
   알림: 에틸 알코올(70%) 또는 냄새가 나는 기타 소독제는 설치류의 사회적 행동에 영향을 미칠 수 있으므로 사회적 상호 작용 테스트 중에 장치를 청소하는 데 사용해서는 안 됩니다.
6. 외부 실내 신호를 제거하기 위해 장치 주위에 배치할 수 있는 흰색 플라스틱 보드와 같은 프라이버시 블라인드를 사용하십시오.
7. 작은 화이트보드와 마커를 준비합니다. 마우스 번호, 실험 제목, 날짜, 실험 시간 등 필수 정보를 화이트보드에 기록합니다.
   참고: 화이트보드는 기록이 끝날 때 채점자가 마우스의 동작을 평가하기 전에 마우스의 번호를 알 수 없도록 카메라에 표시됩니다. 이 연구는 잠재적 편향을 최소화하기 위해 개별 채점 행동이 실험 그룹에 대해 맹목적으로 유지되도록 했습니다.

3. 취급

1. 행동 실험을 시작하기 전에 3일 연속으로 처리 절차를 수행합니다.
2. 동일한 검사실에서 일관된 시간에, 이상적으로는 마우스가 더 활동적인 아침에 처리 세션을 수행합니다.
3. 3일마다 쥐를 시험장으로 데려와 적응할 수 있도록 30분 동안 어두운 조명 아래 그대로 두십시오.
4. 30분의 순응 시간이 지난 후 케이지를 열고 장갑을 낀 손을 케이지에 넣습니다. 생쥐가 1분 동안 손을 탐색하도록 합니다.
5. 쥐를 손에 부드럽게 떠서 (또는 작은 판지 튜브를 사용하여 집어 올리십시오) 느슨하게 잡습니다. 쥐가 1-2분 동안 손과 손목을 탐색하도록 합니다. 마우스가 불안정하거나 공격적인 경우 마우스를 그리드에 배치하고 스스로 구성되도록 합니다.
6. 마우스가 손에 편안하게 닿을 때까지 계속 다루십시오. 다음 케이지에 손을 넣기 전에 항상 장갑을 교체하십시오.
7. 각 생쥐 케이지를 다룬 후 가정용 케이지에 부드럽게 넣은 다음 절차를 반복합니다.
8. 새 장갑을 끼고 모든 실험 및 대조 마우스를 처리했을 때 낯선 마우스를 다루어 향기로운 메시지로 테스트 마우스에 영향을 미치지 않도록 하십시오.
9. 낯선 쥐도 같은 방법으로 다루십시오.
10. 선택 사항 : 낯선 마우스를 와이어 케이지와 3 챔버 장치에 10-15 분 동안 익숙화시킵니다.
    참고: 이 습관화 세션은 3챔버 테스트 동안 낯선 쥐의 동요와 비정상적인 행동을 줄이는 데 도움이 됩니다. 그러나 3챔버 테스트의 경우 본 연구는 낯선 마우스의 존재 여부에 관계없이 테스트 마우스가 시작한 케이지의 사회적 접근 행동(스니핑)만 고려합니다. 낯선 쥐에 의한 왕복 스니핑은 이 분석에서 안정적으로 관찰할 수 없으므로 계산되지 않습니다. 3 챔버 테스트의 이러한 제한으로 인해 화학 신호 (예 : 냄새)의 교차 오염을 최소화하기 위해이 경우 낯선 마우스는 실험을 시작하기 전에 와이어 케이지와 장치에 대한 사전 경험이 없었습니다.

4. 방법 1: 반복적인 행동을 위한 셀프 그루밍(그림 1A)

1. 오전 7:00-오후 3:00 사이에 모든 행동 실험을 수행합니다.
2. 위에서 설명한 대로 흐리게 표시된 조명을 켭니다. 테이블을 청소하고 방을 설정하십시오.
3. 신선한 침구의 얇은 층으로 각 테스트 케이지를 준비합니다(2.2단계 설명 참조).
4. 테이블 위에 1-2개의 케이지를 놓고 흰색 플라스틱 블라인더로 서로 및 실내 환경과 분리합니다.
5. 각 케이지 앞에 카메라를 배치하여 테스트 마우스를 캡처합니다.
6. 모든 마우스를 실내로 옮기고 스트레스를 피하기 위해 이송 과정에서 케이지를 천 시트로 덮습니다.
7. 쥐를 실험실에 넣으면 시트를 제거하고 실험을 시작하기 전에 어두운 조명으로 최소 30분 동안 방에 두십시오.
8. 테스트를 시작할 때 마우스 식별 번호와 테스트 정보를 화이트보드에 기록합니다(2.7단계 참조).
9. 기록을 시작하고 테스트 마우스를 테스트 케이지에 넣습니다.
10. 20분 녹음 세션 동안 방을 나갑니다.
11. 각 테스트에 대해 처음 10분을 습관화로 간주합니다. 다음 10분 동안 그루밍 행동을 관찰하고 점수를 매긴다(섹션 6 참조).
12. 20분 후 방으로 돌아갑니다. 화이트보드를 카메라에 대고 녹화를 중지합니다.
13. 테스트 마우스를 가정용 케이지에 부드럽게 다시 넣고 실험을 반복합니다.
    참고: 다양한 외부 영향을 줄이기 위해 실험 그룹과 통제 그룹 간의 테스트 순서의 균형을 맞춥니다.
14. 실험이 끝나면 쥐를 수용실로 되돌려 보냅니다.

5. 방법 2: 3챔버 사회적 상호작용 테스트(그림 2A)

1. 오전 7:00-오후 3:00 사이에 모든 실험을 수행합니다.
2. 테이블을 청소하고 조명(희미한 조명)을 켭니다.
3. 프라이버시 블라인드로 둘러싸인 테이블 위에 3 챔버 플렉시 글라스 기기를 놓습니다.
4. 하나의 카메라를 머리 위에 놓고 세 개의 챔버가 모두 카메라의 녹화 프레임에 있는지 확인합니다.
5. 테스트와 낯선 마우스를 방으로 옮깁니다. 전사 과정에서 케이지를 천 시트로 덮고 방에서 시트를 한 번 제거하십시오.
6. 실험을 시작하기 전에 쥐를 어두운 조명으로 최소 30분 동안 방에 두십시오.
7. 습관화
   1. 습관화 단계 동안 세 개의 방을 비워 두십시오.
   2. 시작하려면 테스트 마우스를 선택하고 화이트보드에 식별 번호를 씁니다.
   3. 그런 다음 슬라이딩 도어가 닫혀 있는 동안 테스트 마우스를 중앙 수납부에 부드럽게 놓습니다.
   4. 녹음을 시작하고 문을 열어 실험용 쥐가 세 개의 빈 방을 탐험할 수 있게 하세요.
   5. 방을 나와 테스트 마우스가 10분 동안 장치에 익숙해지도록 합니다.
   6. 10분 동안 습관화한 후 방으로 돌아갑니다. 테스트 마우스를 중앙 수납부로 부드럽게 안내하고 슬라이딩 도어를 닫습니다.
   7. 화이트보드를 표시하고 카메라를 중지합니다.
8. 사회적 접근 (소설 철사 케이지 개체 대 소설 낯선 쥐 1)
   1. 왼쪽 및 오른쪽 챔버에 두 개의 와이어 케이지를 배치합니다. 이러한 케이지를 각 챔버의 모서리에 대각선으로 서로 마주 보고 배치하여 벽에서 5cm의 간격을 확보하여 테스트 마우스가 케이지 주위를 달릴 수 있도록 합니다. 또한 케이지가 챔버 도어를 직접 향하지 않도록 하십시오.
   2. 낯선 마우스 하나를 선택하여 와이어 케이지 중 하나에 삽입하고 다른 와이어 케이지에는 마우스가 없습니다.
   3. 테스트를 시작하려면 녹음을 누르고 두 슬라이딩 도어를 모두 제거합니다. 방을 나갑니다.
   4. 테스트 마우스가 한 챔버의 빈 철사 케이지와 다른 챔버의 낯선 마우스(새로운 낯선 마우스 1 또는 S1)가 있는 케이지를 10분 동안 탐색하도록 합니다.
   5. 10분 후 방으로 돌아갑니다. 화이트보드를 카메라에 표시하고 녹화를 종료합니다.
   6. 마우스를 중앙 수납부에 다시 끼우고 상호 연결된 도어를 닫습니다.
      알림: 사회적 접근 테스트를 마친 후 설정에서 와이어 케이지를 제거하지 마십시오.전체 작업 동안 동일한 위치를 유지하도록 합니다.
9. 사회적 참신함에 대한 선호(소설 낯선 사람 마우스 2 대 소설 마우스 1)
   1. 한 번도 본 적이 없는 새 마우스를 이전에 비어 있는 철사 케이지(소설 낯선 마우스 2 또는 S2)에 놓습니다.
      참고: S2는 S1과 다른 홈 케이지에서 가져와야 합니다.
   2. 녹음을 시작하고 상호 연결된 도어를 열어 테스트 마우스가 10분 동안 장치를 탐색할 수 있도록 합니다.
   3. 방을 나갑니다. 테스트 마우스는 두 개의 와이어 케이지를 탐색합니다: 하나는 사회적 접근 단계에서 이전에 만난 S1 마우스이고 다른 하나는 새로 도입된 S2 마우스입니다.
   4. 10분 후 방으로 돌아갑니다. 화이트보드를 카메라에 표시하고 녹화를 마칩니다.
   5. 모든 생쥐(테스트 생쥐 및 새로운 낯선 생쥐)를 집 우리로 되돌립니다.
   6. 챔버와 와이어 케이지를 무취 소독제로 철저히 청소하십시오. 다음 실험에 사용하기 전에 장치가 건조되었는지 확인하십시오.
   7. 나머지 모든 테스트 마우스에 대해 실험을 반복합니다.
      참고: 다른 테스트 마우스에 대해 왼쪽과 오른쪽 챔버 사이에 S1 및 S2 마우스가 있는 케이지 배치를 번갈아 가며 배치합니다. 평형은 장치의 특정 챔버에 대한 편향된 선호를 방지합니다.
   8. 실험이 끝나면 쥐를 사육 시설로 되돌려 보냅니다.
   9. 테스트의 각 부분 사이에 카메라를 중지했다가 다시 시작하면 테스트 마우스당 3회 10분 비디오가 생성됩니다.

6. 채점 및 통계 분석

1. 필요한 장비
   1. 점수 매기기, 그래프 그리기 및 통계 분석을 위해 Microsoft Excel, GraphPad Prism 및 SPSS와 같은 기타 통계 프로그램이 설치된 두 개의 스톱워치와 컴퓨터 또는 노트북을 사용합니다.
2. 셀프 그루밍 점수 매기기
   알림: 마우스를 편안한 환경에 두면 스트레스가 적은 자발적인 자기 그루밍 행동을 관찰할 수 있습니다. 일반적으로 생쥐는 코와 수염 주위의 발을 핥아 그루밍을 시작합니다(1단계). 그 다음에는 II와 III단계가 뒤따를 수 있는데, 여기서 쥐는 발로 얼굴과 머리 전체를 닦습니다. IV단계에서 생쥐는 몸을 손질하고 꼬리를 핥는 일을 계속한다¹⁴. 10분의 테스트 기간 내에 귀(3단계)와 꼬리(IV단계)를 손질하는 빈도가 낮고 수동 분석의 명확성을 높이기 위해 자가 그루밍 행동은 로스트 그루밍과 꼬리 그루밍의 두 가지 기본 유형으로 분류되었습니다. 로스트랄 그루밍에는 발 핥기, 코 그루밍, 얼굴, 귀, 머리의 꼼꼼한 씻기와 같은 활동이 포함됩니다. 꼬리 그루밍에는 꼬리뿐만 아니라 배, 등, 뒷다리, 생식기 부위와 같은 부위를 덮고 있는 신체 부위를 핥는 것이 포함됩니다.
   1. 그루밍 행동을 주의 깊게 관찰하고 시합을 기록하십시오. 개별 그루밍 세션은 마우스가 자체 그루밍의 단일 인스턴스에 참여할 때 발생합니다. 그루밍 세션이 시작되는 순간부터 멈출 때까지, 관련된 특정 그루밍 행동에 관계없이 그루밍 세션을 고려하십시오.
   2. 테스트 마우스가 위치를 변경하지 않고 몇 초 동안 그루밍을 일시 중지하면 동일한 시합의 일부로 간주합니다. 그러나 쥐가 그루밍을 멈추고 탐색을 시작한다면 그루밍 시합이 끝났다고 생각하십시오.
   3. 또한 마우스가 앞에서 뒤로(스테이지 I에서 스테이지 IV까지) 지속적으로 그루밍할 때만 전체 그루밍 세션을 기록합니다.
   4. 10분 테스트 기간 동안 관찰된 총 그루밍 시간, 그루밍 횟수 및 전체 그루밍 횟수를 문서화하고 2분, 5분, 10분 간격으로 관찰 결과를 표시합니다.
3. 3 챔버 사회적 상호 작용 테스트
   이 분석은 각 마우스와의 스니핑 상호 작용 시간과 빈도를 결정합니다(사회적 접근의 경우 novel S1 및 empty cage, 사회적 참신함에 대한 선호의 경우 S1 및 novel S2).
   1. 두 개의 타이머를 사용하여 각 케이지에서 마우스와의 상호 작용 시간과 각 챔버에서 보낸 총 시간을 기록합니다. 테스트의 각 부분(사회적 접근 방식 및 사회적 참신함에 대한 선호)에 대해 테스트 마우스가 각 챔버에 들어간 횟수(총 항목)를 기록합니다.
   2. 챔버 중 하나 내에 테스트 마우스의 시체가 있는지 여부에 따라 구획(s)의 시간을 결정합니다(네 개의 발이 들어가야 함).
   3. 테스트 마우스가 새로운 낯선 마우스의 냄새를 맡거나(직접 얼굴 접촉 또는 낯선 마우스의 꼬리 냄새를 맡음) 빈 케이지의 냄새를 맡을 때의 상호 작용 시간을 기록합니다. 케이지 꼭대기에 앉는 것을 상호 작용으로 간주하지 마십시오.
   4. 2분, 5분, 10분으로 녹화합니다. 시간 종속 분석을 수행합니다.
   5. 그룹 내의 사회성 차별 지수(DI)를 비교합니다.
      참고: DI는 DI = (S1 마우스와 상호 작용하는 시간 - 빈 케이지와 상호 작용하는 시간)/총 상호 작용 시간 x 100으로 계산됩니다. 사회적 참신함 부분에서 대조군 마우스는 S1(친숙한 마우스)보다 S2(익숙하지 않은 마우스)와 더 많이 상호 작용합니다. 사회적 참신함(사회적 기억) DI가 계산됩니다: DI = (S2 마우스와 상호 작용하는 시간 - 익숙한 마우스와 상호 작용하는 시간(S1))/ 총 상호 작용 시간 x 100.
4. 통계 분석
   1. 쌍을 이루지 않은 양측 학생의 T-검정을 사용하여 자가 그루밍 시간, 시합 및 전체 시합(두 그룹만 있는 경우)에 대해 p < 0.05의 유의미한 수준으로 설정된 p-값을 계산합니다.
   2. 3-챔버 테스트의 경우 학생의 T-테스트를 사용하여 두 그룹 간의 총 항목에 대한 통계적 유의성을 계산합니다. 그룹 간 데이터의 등분산에 대한 가정이 충족되지 않는 경우(Levene의 검정 p < 0.05) Welch의 T-검정을 수행하여 편차를 조정하고 독립 그룹의 평균을 비교합니다.
      참고: 총 항목을 측정하면 마우스의 전반적인 활동을 평가할 수 있습니다. 잠재적인 우려 사항(생쥐의 운동 장애 및 높은 불안 수준과 관련된)은 실험 그룹이 대조군보다 현저히 적은 3개의 챔버 장치를 탐색하는 경우 발생할 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 이러한 조건으로 인해 탐색 감소가 발생할 수 있으므로 운동 기능과 불안 유사 행동 테스트를 통해 평가하는 것이 좋습니다⁴².
   3. 혼합 방식 분산분석(mixed-way ANOVA)을 사용하여 각 챔버의 시간과 각 테스트의 상호 작용 시간을 비교합니다. 그룹 및 요인의 수에 따라 혼합 양방향 분산 분석(2가지 요인: 유전자형 및 챔버 측면, 빈 케이지와 S1 또는 S1 및 S2와 상호 작용) 또는 혼합 3원 분산 분석(3가지 요인: 유전자형, 처리 및 챔버 측면, 빈 및 S1 또는 S1 및 S2와 상호 작용)을 사용합니다. 이 분석은 다양한 요인 간에 마우스의 통계적으로 유의미한 사회적 상호 작용을 밝히는 데 특히 유용합니다.
      참고: 이러한 요인에는 유전자형의 주요 효과(다양한 유전적 배경이 사회적 행동에 미치는 영향), 케이지와의 상호 작용의 주요 효과(빈 케이지 또는 이전에 만난 마우스보다 새로운 낯선 마우스에 대한 냄새 맡기 및 선호), 치료의 주요 효과(다양한 약물 치료가 마우스의 사회적 행동에 미치는 영향) 및 유전자형 x 치료 상호 작용(적용된 처리가 유전자형에 미치는 영향 밝힘).
   4. 그런 다음 Bonferroni의 사후 테스트(α 수준 0.05로 설정)를 사용하여 서로 다른 그룹 간의 비교를 추가로 평가합니다.

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결과

포유류의 표적인 라파마이신(mTOR)은 새로운 단백질 합성을 조절하고 자가포식을 억제함으로써 중추신경계(CNS)에서 중요한 역할을 합니다⁴³. mTOR 경로의 조절 장애와 시냅스 단백질 합성은 ASD²⁸과 관련이 있습니다. ASD 환자에 대한 게놈 차원의 연구는 염색체 10번 염색체의 포스파타제 및 텐신 상동체(PTEN), 결절성 경화증 복합체(TSC...

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토론

ASD의 대부분의 병인학적 원인, 병리학적 변화 및 생물학적 지표는 알려져 있지 않거나 사용할 수 없습니다. ASD 진단은 주로 사회적 의사소통의 지속적인 결핍과 과도한 반복 행동이라는 두 가지 확립된 임상 증상에 기초합니다 18,19,55. ASD는 광범위한 증상을 포괄하는 스펙트럼 장애라는 점을 감안할 ?...

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자료

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1/4'' Teklad Corncob Bedding	Harlan, TEKLAD	7092-7097	The raw stock for corncob bedding products  is 100% corncob. No other components or additives are used.
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