Estrategias para evaluar comportamientos similares al autismo en ratones

Resumen

Los modelos de roedores son herramientas valiosas para estudiar los comportamientos básicos relacionados con el trastorno del espectro autista (TEA). En este artículo, exponemos dos pruebas de comportamiento para modelar las características principales del TEA en ratones: el autoacicalamiento, que evalúa el comportamiento repetitivo, y la prueba de interacción social de tres cámaras, que documenta las deficiencias sociales.

Resumen

El trastorno del espectro autista (TEA) es una afección neurobiológicamente compleja con una etiología genética heterogénea. Clínicamente, el TEA se diagnostica por deficiencias en la comunicación social y comportamientos restrictivos o repetitivos, como aletear las manos o alinear objetos. Estos patrones de comportamiento se pueden observar de forma fiable en modelos de ratón con mutaciones genéticas relacionadas con el TEA, lo que los convierte en herramientas muy útiles para estudiar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes en el TEA. Comprender cómo los cambios genéticos afectan la neurobiología y los comportamientos observados en el TEA facilitará el desarrollo de nuevos compuestos terapéuticos dirigidos para mejorar las deficiencias conductuales centrales. Nuestro laboratorio ha empleado varios protocolos que abarcan procedimientos de capacitación y pruebas bien descritos que reflejan una amplia gama de déficits conductuales relacionados con el TEA. Aquí, detallamos dos ensayos para estudiar las características principales del TEA en modelos de ratón: el autoaseo (una medida del comportamiento repetitivo) y la prueba de interacción social de tres cámaras (una medida del enfoque de interacción social y la preferencia por la novedad social).

Introducción

El trastorno del espectro autista (TEA) es un trastorno del desarrollo cerebral que manifiesta deficiencias en la comunicación o interacción social y patrones de comportamientos o intereses restringidos y repetitivos ^1,2. En 2022, aproximadamente 1 de cada 100 niños fue diagnosticado con TEA en todo el mundo³. Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC, EE. UU.), la prevalencia de TEA ha aumentado en un 30% desde 2008 y se ha multiplicado por más de 2 desde 2000 ^4,5. Las personas con TEA también pueden presentar comorbilidades, como discapacidad intelectual (DI) (35,2%, CI ≤ 70), trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH) (50%-70%) y otros síndromes genéticos ^2,4,6.

El uso de modelos animales en la investigación de TEA, especialmente en roedores, ha proporcionado información significativa sobre el impacto de varios factores ambientales, como la dieta, los medicamentos, el ejercicio y el enriquecimiento 7,8,9,10, así como mutaciones genéticas como Shank, Fmr1, Mecp2, Pten y el mutante Tsc 11,12,13, sobre los síntomas del TEA. Los modelos de ratón se utilizan comúnmente para investigar el TEA debido a su naturaleza social y a sus características genéticas, bioquímicas y electrofisiológicas compartidas con los humanos. Por ejemplo, mediante la deleción de un gen específico (como Shank3, Fmr1, Cntnap2 y Pten), se pueden recapitular comportamientos sociales aberrantes y repetitivos, lo que proporciona una fuerte validez al estudio 14,15,16. Aquí, proporcionamos protocolos para estudiar los paralelismos entre los modelos genéticos animales y los síntomas del TEA humano¹⁷. Describimos el autoaseo y la prueba de interacción social de tres cámaras, que reflejan dos síntomas centrales en los pacientes con TEA, a saber, patrones de comportamiento restringidos y repetitivos y deficiencias en la interacción social (comunicación), respectivamente.

Con base en el DSM-V (Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales de la Asociación Americana de Psiquiatría,^5ª edición) y la CIE-11 (Clasificación Internacional de Enfermedades, 11ª revisión), los pacientes con TEA se involucran en patrones de comportamiento restringidos, repetitivos y estereotipados, en particular, comportamientos repetitivos no funcionales centrados en el cuerpo (BFRB), como mecerse, estimularse, morderse las uñas, tirarse del cabello, pellizcarse la piel^{o caminar de} puntillas^{. Artículo 19}. En los animales, el comportamiento repetitivo se manifiesta por un autoaseo prolongado y repetitivo. El acicalamiento es una de las actividades innatas más comunes entre los roedores, con aproximadamente el 40% de su tiempo de vigilia dedicado al acicalamiento^20,21. Es instintivo que los ratones se laman la piel o el pelaje para eliminar la suciedad extraña de la superficie del cuerpo, lo que sirve para mantener la limpieza corporal, prevenir lesiones, eliminar parásitos y regular la temperatura. El acicalamiento se clasifica en dos tipos: acicalamiento social (alo-acicalamiento), que implica el acicalamiento por parte de otro ratón, y el autoacicalamiento. El autoaseo muestra un patrón de secuenciación estereotipado y conservado que consta de cuatro etapas (en su mayoría discretas y no secuenciales)^22,23. En la etapa I (accidente cerebrovascular elíptico), los ratones inician el acicalamiento lamiendo primero ambas patas y luego acicalándose alrededor de la nariz con sus patas. En la etapa II (accidente cerebrovascular unilateral), los ratones usan sus patas para limpiarse la cara de manera asimétrica. En la etapa III (accidente cerebrovascular bilateral), los ratones se limpian simétricamente la cabeza y las orejas. En la etapa IV (lamido del cuerpo), los ratones hacen la transición al lamido del cuerpo moviendo la cabeza hacia atrás y pueden extender el acicalamiento a la cola y los genitales. Cuando los ratones se colocan individualmente en una jaula transparente, el comportamiento de autoacicalamiento se puede reconocer y observar fácilmente. Los ratones aumentan el comportamiento de autoacicalamiento cuando se enfrentan al estrés, el dolor o la interrupción social, lo que hace que la prueba de autoacicalamiento sea crucial cuando se investigan trastornos neurológicos^. Diferentes modelos de ratón de TEA, incluidos aquellos con mutaciones genéticas (como Fmr1^-/y, Shank3B^-/-, NL1^-/-), intervenciones farmacológicas (como DO34, PolyI:C) y cepas endogámicas específicas (como BTBR y C58/J), han demostrado un comportamiento excesivo y repetitivo de autoacicalamiento 24,25,26,27.

Las alteraciones en el comportamiento social sirven como uno de los criterios para evaluar el TEA. De acuerdo con el DSM-V y la CIE-11, los pacientes con TEA presentan deficiencias persistentes en la comunicación social y la interacción social^{1 8,19}. Estos pueden manifestarse en déficits de comunicación verbal y no verbal (es decir, contacto visual, gestos y expresión facial anormales), falta de compartir intereses y emociones con los demás, desconocimiento de las señales contextuales sociales o dificultades para desarrollar relaciones. En línea con los síntomas de deterioro social, se han diseñado y optimizado diversas tareas conductuales para evaluar las interacciones sociales en ratones, como la prueba de interacción social directa, la prueba de enfoque social de tres cámaras y la prueba de preferencia por la novedad social, y el análisis de vocalizaciones ultrasónicas (USVs)^16,28. La prueba de interacción social de tres cámaras es un experimento ampliamente utilizado para evaluar los comportamientos relacionados con el TEA 17,29,30,31. El aparato consta de tres cámaras conectadas; Las cámaras izquierda y derecha contienen una jaula de alambre que puede estar vacía u ocupada por un ratón, lo que permite que el ratón de prueba interactúe libremente con ambas jaulas. Dos mediciones ayudan a evaluar diferentes aspectos del comportamiento social en el ratón de prueba durante el experimento de tres cámaras. En primer lugar, se puntúa al ratón de prueba por el tiempo que pasa interactuando con la jaula vacía (objeto nuevo) en comparación con una jaula que contiene un ratón nuevo. Esta parte de la tarea proporciona información sobre la sociabilidad del ratón. A continuación, se coloca un ratón desconocido en la jaula de alambre previamente vacía. La diferencia de tiempo en la interacción del ratón de prueba entre el ratón desconocido y el conocido mide la preferencia por la novedad social. En esta parte de la tarea, un ratón de control prefiere interactuar con un ratón desconocido en lugar del ratón encontrado anteriormente, que ya estaba presente en la parte de sociabilidad de la prueba. Los déficits en la interacción social y la disminución de la motivación para interactuar con ratones nuevos se encuentran generalmente en el modelo de ratón con TEA. La prueba de tres cámaras ha demostrado ser robusta desde su invención. Se ha utilizado para estudiar los fenotipos sociales en varios modelos de ratón de TEA, incluidos Fmr1^−/−, Shank3B^−/-, Cntnap2^−/− y la cepa endogámica BTBR^{32,33,34,35,36}.

Las dos pruebas utilizan el comportamiento espontáneo natural de los ratones como herramientas meritorias para estudiar el comportamiento similar al TEA. Dado que se consideran pruebas de bajo estrés, es factible realizar ambas pruebas dentro del mismo grupo de ratones para medir el comportamiento similar al TEA, con la prueba de autoaseo realizándose primero y la prueba de interacción social de tres cámaras en los días siguientes. Los protocolos que proporcionamos presentan una herramienta esencial para la evaluación del comportamiento similar al TEA y el desarrollo de nuevas terapias 29,30,31. En última instancia, contribuirían a mejorar los resultados de las personas afectadas por el TEA.

Protocolo

Todos los procedimientos y experimentos con animales fueron aprobados por las regulaciones del Comité de Cuidado de Animales de las Instalaciones (FACC), que siguen las pautas establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales, el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill y la Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio (OLAW) de los NIH. El número de garantía del Servicio de Salud Pública (PHS) de la Universidad McGill es F-16-00005(A5006-01).

1. Preparación animal

1. Ratones de prueba: Seleccione ratones machos y/o hembras de 2-3 meses (8 a 13 semanas) de edad. Todos los ratones utilizados en los experimentos aquí son de origen C57BL/6J. Para el comportamiento de autoaseo y los ensayos de interacción social de tres cámaras, el rango generalmente aceptable de ratones por grupo sugerido es n = 10-15, con un mínimo de n = 8.
   1. En el caso de los ratones modificados genéticamente, siempre hay que añadir compañeros de camada de tipo salvaje como control. Emparejar el grupo de control con el grupo experimental en términos de antecedentes genéticos, edad, sexo y condiciones de vivienda. Los ratones transgénicos homocigotos utilizados en este estudio son de tamaño normal y no muestran ninguna anormalidad física macroscópica.
      NOTA: En algunos casos más complejos, los investigadores pueden estar interesados en evaluar más de dos genotipos (es decir, tipo salvaje, heterocigoto, homocigoto), investigar los efectos de los medicamentos (es decir, tratamiento, tratamiento del vehículo, no tratamiento) o comparar machos y hembras. Cuando se trabaja con ratones hembra, es crucial tener en cuenta sus ciclos estrales. Si bien los ciclos estrales femeninos no influyen significativamente en los comportamientos de autoaseo, los estudios han indicado que estos ciclos pueden afectar el enfoque social y la preferencia por la novedad social^37,38.
2. Ratones extraños: Use al menos 8 ratones de tipo salvaje para la prueba de tres cámaras. Utilice 2 jaulas, 4 ratones por jaula, que coincidan con la edad, el sexo y los mismos antecedentes genéticos (C57BL/6J) de los ratones de prueba. Asegúrese de que los ratones extraños no hayan tenido interacción previa con los ratones de prueba.
3. Alojamiento: Agrupe a 3-5 ratones por jaula doméstica (jaulas de plástico para ratones de 71/2" de ancho x 111/2" de largo x 5" de alto) y manténgalo en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h. Proporcione a los ratones acceso a comida y agua en la jaula ad libitum.
   NOTA: En las habitaciones de este estudio, las luces se encienden a las 7:00 am.
4. Transfiera los ratones al centro de pruebas de comportamiento animal durante un mínimo de 1 semana antes de los experimentos^39,40.
5. Pruebas de manejo y comportamiento: Realice la prueba a una hora constante del día. Ajuste la hora de inicio en función del ciclo de luz en las habitaciones de la carcasa del ratón. Primero, transfiera los ratones a la sala de pruebas y permita que se habitúen a la sala de pruebas durante un mínimo de 30 minutos bajo una luz tenue antes de comenzar las pruebas de comportamiento.
   NOTA: En este estudio, los experimentos con ratones se realizaron de forma rutinaria entre las 7:00 a.m. y las 3:00 p.m. (en relación con la luz encendida de las 7:00 a.m. y la luz apagada de las 7:00 p.m.). Por lo tanto, el inicio real de la prueba de comportamiento ocurre alrededor de las 8 am.

2. Preparación de la sala y del equipo

1. Prepare una habitación pequeña con áreas totales de piso entre 16 y 36 pies (5 a 12 m²; 6 m² de habitación en este estudio). Mantenga constantes la temperatura, la iluminación (iluminación atenuada ajustable) y los niveles de ruido (idealmente insonorizados) para todos los experimentos.
   1. Si utiliza lámparas de pie (bombillas de 23 W, 120 V), colóquelas en lugares simétricos y a cada lado, al menos a 1 m de distancia del aparato de tres cámaras, para iluminar las dos cámaras laterales por igual.
2. Coloque el aparato sobre una mesa blanca portátil. Para el experimento de auto-aseo, use jaulas limpias y transparentes (jaulas de plástico para ratones de 71/2" de ancho x 111/2" de largo x 5" de alto); Utilice una jaula por ratón de prueba. Llene las jaulas con aproximadamente 1 cm de ropa de cama fresca sin material de anidación. Use el mismo tipo de ropa de cama que en la jaula de la casa (aquí, ropa de cama de mazorca de maíz fresca ([cama de mazorca de maíz de 1/4 de pulgada]).
   NOTA: Las jaulas deben ser del mismo tamaño que las jaulas domésticas, con una tapa de filtro colocada en la parte superior, pero sin una rejilla metálica (que normalmente se usa para sostener biberones y entrega de alimentos).
3. Para el experimento social, utilice un aparato de tres cámaras set⁴¹. Cada cámara mide 20 cm x 40 cm x 22 (h) cm y está rodeada por paredes de plexiglás. Cada cámara lateral es accesible desde el centro por puertas correderas transparentes que se pueden quitar (5 x 8 cm). Utilice dos jaulas de alambre (diámetro: 7 cm, altura: 15 cm; con tapas de cubierta (vacías o con ratones extraños). La jaula está elevada y cerrada por barras lisas de alambre de acero inoxidable (diámetro de la barra: 3 mm, distancia entre barras: 7 mm). No incluya sentarse encima de las jaulas como tiempo de interacción.
   1. Si se incluyen ratones machos y hembras en el experimento, etiquete cada jaula de alambre según su función específica para minimizar la contaminación cruzada.
4. Instale cámaras aéreas o frontales en trípodes para grabaciones de vídeo. Asegúrese de que las cámaras estén completamente cargadas y tengan suficiente almacenamiento.
5. Entre cada experimento de prueba con ratones, limpie a fondo la configuración de tres cámaras y las jaulas de alambre con un agente de limpieza inodoro (aquí, Versa-Clean). Divida el agente de limpieza en agua del grifo en una proporción de 1:40, aplíquelo sobre la superficie sucia y seque las superficies con una toalla de papel antes de la próxima prueba para minimizar el olor residual del ratón anterior.
   NOTA: No se debe usar alcohol etílico (70%) u otros desinfectantes con olores para limpiar el aparato durante las pruebas de interacción social, ya que pueden afectar el comportamiento social de los roedores.
6. Use persianas de privacidad, como tablas de plástico blancas, que se pueden colocar alrededor del aparato para eliminar las señales externas de la habitación.
7. Prepara una pequeña pizarra y un marcador. Registre la información esencial en la pizarra, incluido el número del mouse, el título del experimento, la fecha y la hora del experimento.
   NOTA: La pizarra se presenta a la cámara al final de la grabación para evitar que la persona que anota conozca el número del ratón antes de evaluar el comportamiento del ratón. El estudio se aseguró de que el comportamiento de puntuación individual permaneciera ciego a los grupos experimentales para minimizar el posible sesgo.

3. Manipulación

1. Realizar procedimientos de manejo durante tres días consecutivos antes del inicio de los experimentos conductuales.
2. Lleve a cabo sesiones de manipulación en la misma sala de pruebas a una hora constante, idealmente por la mañana, cuando los ratones están más activos.
3. En cada uno de los 3 días, lleve a los ratones a la sala de pruebas y déjelos sin molestar durante 30 minutos con poca luz para que se aclimaten.
4. Después de un período de aclimatación de 30 minutos, abra la jaula e introduzca una mano enguantada en la jaula. Permita que los ratones exploren la mano durante 1 minuto.
5. Coloque suavemente los ratones en la mano (o use un pequeño tubo de cartón para recogerlos), sosteniéndolos sin apretar. Permita que los ratones exploren la mano y la muñeca durante 1-2 minutos. En los casos en que un mouse esté nervioso o agresivo, colóquelo en la cuadrícula y permita que se componga por sí mismo.
6. Continúe manipulando hasta que el mouse se sienta cómodo permaneciendo en la mano. Cambie siempre los guantes antes de introducir las manos en la siguiente jaula.
7. Después de manipular cada jaula de ratones, colóquelos suavemente en su jaula de casa y luego repita el procedimiento.
8. Póngase guantes nuevos y manipule ratones extraños cuando se hayan manipulado todos los ratones experimentales y de control para evitar afectar a los ratones de prueba con mensajes olflados.
9. Maneja a los ratones extraños de la misma manera.
10. Opcional: Habitúe a los ratones extraños a la jaula de alambre y al aparato de tres cámaras durante 10-15 minutos.
    NOTA: Esta sesión de habituación ayuda a reducir la agitación y los comportamientos aberrantes en los ratones extraños durante la prueba de tres cámaras. Sin embargo, para la prueba de tres cámaras, este estudio solo considera el comportamiento de acercamiento social (olfateo) de la jaula iniciado por el ratón de prueba, ya sea que haya un ratón extraño presente o no. El olfato recíproco por parte del ratón extraño no se puede observar de manera confiable en este ensayo y, por lo tanto, no se cuenta. Debido a esta limitación de la prueba de tres cámaras y para minimizar la contaminación cruzada de señales químicas (como olores), en este caso, los ratones extraños no tenían experiencia previa con la jaula de alambre y el aparato antes del inicio del experimento.

4. Método 1: Autoaseo para el comportamiento repetitivo (Figura 1A)

1. Realice todos los experimentos de comportamiento entre las 7:00 a.m. y las 3:00 p.m.
2. Encienda las luces atenuadas, como se describe anteriormente. Limpia la mesa y prepara la habitación.
3. Prepare cada jaula de prueba con una capa delgada de lecho fresco (como se describe en el paso 2.2).
4. Coloque 1-2 jaulas sobre la mesa, separadas entre sí y del entorno de la habitación por anteojeras de plástico blancas.
5. Coloque una cámara frente a cada jaula para capturar al ratón de prueba.
6. Transfiera todos los ratones a la habitación y cubra las jaulas con una sábana de tela durante el proceso de transferencia para evitar el estrés.
7. Retire la sábana una vez que los ratones estén colocados en la sala de pruebas, dejándolos en la habitación durante al menos 30 minutos con luces tenues antes del inicio del experimento.
8. Al comienzo de la prueba, anote el número de identificación del mouse y la información de la prueba en una pizarra (como se describe en el paso 2.7).
9. Comience a grabar y coloque el mouse de prueba en la jaula de prueba.
10. Sal de la habitación durante la sesión de grabación de 20 minutos.
11. Para cada prueba, considere los primeros 10 minutos como habituación. Utilice los siguientes 10 minutos para observar y puntuar el comportamiento de acicalamiento (consulte la sección 6).
12. Después de 20 minutos, regrese a la habitación. Presente la pizarra a la cámara y detenga la grabación.
13. Vuelva a colocar suavemente el ratón de prueba en la jaula de inicio y repita el experimento.
    NOTA: Contrarreste el orden de las pruebas entre los grupos experimental y de control para reducir las diversas influencias externas.
14. Una vez terminados los experimentos, regrese a los ratones a su habitación.

5. Método 2: Prueba de interacción social de tres cámaras (Figura 2A)

1. Realice todos los experimentos entre las 7:00 a.m. y las 3:00 p.m.
2. Limpie la mesa y encienda las luces (luces tenues).
3. Coloque el instrumento de plexiglás de tres cámaras sobre la mesa rodeada de persianas de privacidad.
4. Coloque una cámara en el techo, asegurándose de que las tres cámaras estén en el marco de grabación de la cámara.
5. Transfiera los ratones de prueba y extraños a la habitación. Cubra las jaulas con una sábana de tela durante el proceso de transferencia y retire la sábana una vez en la habitación.
6. Deje a los ratones en la habitación durante al menos 30 minutos con luz tenue antes del inicio del experimento.
7. Habituación
   1. Mantenga las tres cámaras vacías durante la fase de habituación.
   2. Para comenzar, seleccione un mouse de prueba y escriba el número de identificación en la pizarra.
   3. Luego, coloque suavemente el mouse de prueba en el compartimiento central mientras las puertas correderas aún están cerradas.
   4. Comience a grabar y abra las puertas para permitir que el mouse de prueba explore las tres cámaras vacías.
   5. Salga de la habitación y deje que el ratón de prueba se habitúe al aparato durante 10 minutos.
   6. Después de 10 minutos de habituación completa, regrese a la habitación. Guíe el ratón de prueba suavemente hasta el compartimento central y cierre las puertas correderas.
   7. Muestre la pizarra y detenga la cámara.
8. Enfoque social (nuevo objeto de jaula de alambre frente a nuevo ratón extraño 1)
   1. Coloque dos jaulas de alambre en las cámaras izquierda y derecha. Coloque estas jaulas en diagonal una frente a la otra en las esquinas de cada cámara, asegurando un espacio libre de 5 cm de la pared, permitiendo que el ratón de prueba corra alrededor de las jaulas. Además, asegúrese de que las jaulas no miren directamente hacia las puertas de la cámara.
   2. Elija un ratón extraño e introdúzcalo en una de las jaulas de alambre, mientras no haya ningún ratón en la otra jaula de alambre.
   3. Para iniciar la prueba, presione grabar y retire ambas puertas correderas. Sal de la habitación.
   4. Permita que el ratón de prueba explore una jaula de alambre vacía en una cámara y una jaula que contenga un ratón extraño (nuevo ratón extraño 1 o S1) en la otra cámara durante 10 minutos.
   5. Después de 10 minutos, regrese a la habitación. Muestre la pizarra a la cámara y finalice la grabación.
   6. Vuelva a introducir el ratón en el compartimento central y cierre las puertas de interconexión.
      NOTA: No retire las jaulas de alambre de la instalación después de terminar la prueba de aproximación social para que permanezcan en la misma posición durante toda la tarea.
9. Preferencia por la novedad social (novela ratón extraño 2 frente a ratón novela 1)
   1. Coloque un ratón nuevo, nunca encontrado, en la jaula de alambre previamente vacía (novel stranger mouse 2 o S2).
      NOTA: S2 debe ser de una jaula doméstica diferente a la S1.
   2. Comience a grabar y abra las puertas interconectadas para permitir que el mouse de prueba explore el aparato durante 10 minutos.
   3. Sal de la habitación. El ratón de prueba explorará dos jaulas de alambre: una con el ratón S1 encontrado anteriormente en la etapa de enfoque social y la otra con el ratón S2 recién introducido.
   4. Después de 10 minutos, regrese a la habitación. Muestre la pizarra a la cámara y finalice la grabación.
   5. Devuelve a todos los ratones (ratones extraños de prueba y nuevos) a sus jaulas domésticas.
   6. Limpie a fondo las cámaras y las jaulas de alambre con un desinfectante sin olores. Asegúrese de que el aparato esté seco antes de usarlo para el próximo experimento.
   7. Repita el experimento con todos los ratones de prueba restantes.
      NOTA: Alternar la colocación de las jaulas con ratones S1 y S2 entre las cámaras izquierda y derecha para los diferentes ratones de prueba. El contrapeso evita una preferencia sesgada hacia una cámara particular del aparato.
   8. Después de la prueba, devuelva los ratones a la instalación de alojamiento.
   9. Entre cada parte de la prueba, detenga y reinicie la cámara, lo que da como resultado 3 videos de 10 minutos por mouse de prueba.

6. Puntuación y análisis estadístico

1. Equipamiento necesario
   1. Utilice dos cronómetros y una computadora o computadora portátil con el siguiente software: Microsoft Excel, GraphPad Prism y otros programas estadísticos como SPSS para la puntuación, el trazado de los gráficos y el análisis estadístico.
2. Puntuación de autoaseo
   NOTA: Cuando se coloca un ratón en un entorno cómodo, se puede observar un comportamiento de autoacicalamiento espontáneo de bajo estrés. Por lo general, los ratones inician el acicalamiento lamiendo sus patas alrededor de la nariz y los bigotes (etapa I). A esto le pueden seguir las etapas II y III, en las que el ratón procede a limpiarse toda la cara y la cabeza con las patas. En la etapa IV, el ratón continúa acicalando su cuerpo y lamiendo su cola¹⁴. Dada la poca frecuencia con la que se acicalan las orejas (estadio III) y la cola (estadio IV) en un período de prueba de 10 minutos, y con el objetivo de mejorar la claridad del análisis manual, el comportamiento de autoacicalamiento se clasificó en dos tipos principales: acicalamiento rostal y acicalamiento caudal. El aseo rostral implica actividades como lamer las patas, acicalarse la nariz y lavarse a fondo la cara, las orejas y la cabeza. El acicalamiento caudal incluye lamer la parte del cuerpo que cubre áreas como el vientre, la espalda, las extremidades traseras y el área genital, así como la cola.
   1. Observe cuidadosamente el comportamiento de acicalamiento y registre los combates. Una sesión de aseo individual ocurre cuando el ratón participa en una sola instancia de autoacicalamiento. Considere una sesión de aseo desde el momento en que comienza hasta que se detiene, independientemente de los comportamientos específicos de aseo involucrados.
   2. Si el ratón de prueba hace una pausa en su aseo durante unos segundos sin cambiar de posición, cuéntelo como parte del mismo combate. Sin embargo, si el ratón deja de acicalarse y comienza a explorar, considere que el acicalamiento ha concluido.
   3. Además, solo grabe una sesión de acicalamiento completa cuando el ratón se acicala continuamente de adelante hacia atrás (desde la etapa I hasta la etapa IV).
   4. Documente el tiempo total de acicalamiento, el número de sesiones de acicalamiento y el número de sesiones de acicalamiento completo observadas durante el período de prueba de 10 minutos, marcando las observaciones a intervalos de 2 minutos, 5 minutos y 10 minutos.
3. Test de interacción social de tres cámaras
   El análisis determina el tiempo y la frecuencia de la interacción de olfateo con cada ratón (novela S1 y jaula vacía para el enfoque social, y S1 y novela S2 para la preferencia por la novedad social).
   1. Utilice dos temporizadores para registrar el tiempo de interacción con el ratón en cada jaula y el tiempo total que pasa en cada cámara. Para cada parte de la prueba (enfoque social y preferencia por la novedad social), registre el número de veces que el ratón de prueba entra en cada cámara (entradas totales).
   2. Determine el tiempo en el compartimento (s) por la presencia del cuerpo del ratón de prueba dentro de una de las cámaras (deben entrar cuatro patas).
   3. Registre el tiempo (s) de interacción cuando el ratón de prueba olfatea al nuevo ratón extraño (contacto directo con la cara u olfatea la cola del ratón extraño) u olfatea la jaula vacía. No consideres sentarte en la parte superior de la jaula como una interacción.
   4. Registre a los 2 minutos, 5 minutos y 10 minutos. Realiza un análisis dependiente del tiempo.
   5. Comparar el índice de discriminación de sociabilidad (ID) dentro de los grupos.
      NOTA: DI se calcula como: DI = (tiempo interactuando con el ratón S1 - tiempo interactuando con la jaula vacía)/tiempo total interactuando x 100. Durante la parte de novedad social, los ratones de control interactuarán más con S2 (ratón desconocido) que con S1 (ratón familiar). Se calcula la novedad social (memoria social) DI: DI = (tiempo interactuando con el ratón S2 - tiempo interactuando con el ratón conocido (S1))/ tiempo total de interacción x 100.
4. Análisis estadístico
   1. Utilice una prueba T de estudiante no apareada de dos colas para calcular los valores p con un nivel significativo establecido en p < 0.05 para el tiempo de autoacicalamiento, los episodios y los episodios completos, donde solo hay dos grupos.
   2. Para la prueba de tres cámaras, use una prueba T de Student para calcular la significación estadística de las entradas totales entre dos grupos. Cuando no se cumple la suposición de la misma varianza de los datos entre los grupos (prueba de Levene p < 0,05), se realiza una prueba T de Welch para ajustar la desviación y comparar las medias de los grupos independientes.
      NOTA: La medición de las entradas totales evalúa la actividad general de los ratones. Pueden surgir preocupaciones potenciales (relacionadas con el deterioro motor y los altos niveles de ansiedad de los ratones) si el grupo experimental explora el aparato de tres cámaras significativamente menos que el grupo de control. Para abordar esto, considere evaluar la función motora y el comportamiento similar a la ansiedad con pruebas conductuales similares a las depresivas, ya que la disminución de la exploración podría atribuirse a estas condiciones⁴².
   3. Utilice un ANOVA de vías mixtas para comparar el tiempo en cada cámara y el tiempo de interacción para cada prueba. Dependiendo del número de grupos y factores, utilice un ANOVA mixto de dos vías (2 factores: genotipo y lado de la cámara, o interactuando con jaula vacía y S1, o S1 y S2), o un ANOVA mixto de tres vías (3 factores: genotipo, tratamiento y lado de la cámara, o interactuando con vacío y S1, o S1 y S2). Este análisis es particularmente útil para revelar la interacción social estadísticamente significativa de los ratones entre varios factores.
      NOTA: Estos factores incluyen el efecto principal del genotipo (impacto de los diferentes antecedentes genéticos en los comportamientos sociales), el efecto principal de la interacción con la jaula (olfateo y preferencia por un nuevo ratón extraño frente a una jaula vacía o un ratón encontrado anteriormente), el efecto principal del tratamiento (impacto de varios tratamientos farmacológicos en los comportamientos sociales del ratón) y la interacción genotipo x tratamiento (revelan cómo el tratamiento aplicado afecta al genotipo).
   4. Posteriormente, utilice la prueba post hoc de Bonferroni (nivel de α establecido en 0,05) para evaluar más a fondo la comparación entre diferentes grupos.

Resultados

El objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR) desempeña funciones cruciales en el sistema nervioso central (SNC) al regular la síntesis de proteínas de novo y reprimir la autofagia⁴³. La desregulación de la vía mTOR y la síntesis de proteínas sinápticas se ha implicado en el TEA²⁸. Los estudios de todo el genoma en pacientes con TEA han identificado varias mutaciones genéticas asociadas con TEA, incluidas las que afect...

Discusión

La mayoría de las causas etiológicas, los cambios patológicos y los marcadores biológicos del TEA no se conocen ni están disponibles. El diagnóstico de TEA se basa principalmente en dos conjuntos establecidos de síntomas clínicos: déficits persistentes en la comunicación social y comportamientos repetitivos excesivos 18,19,55. Dado que el TEA es un trastorno del espectro que abarca una...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
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TÅGARP floor lamp and bulbs	IEKA	604.640.49	Bulbs are 23 W 120 V.
Ugo Basile Sociability Apparatus	Stoelting	60450	The Sociability Apparatus (3-chambered social test) is a valuable tool to study social behaviour in mice.
Versa-Clean	Fisherbrand	PVCLN04	Cleaning agent
Whiteboard and  Low Odor Dry Erase Marker	EXPO	NA	Dry erase markers in bold black