تصوير الكالسيوم في الجسم الحي للخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن للحصين في الفئران

Summary

يؤدي التلفيف المسنن للحصين وظائف أساسية ومتميزة في التعلم والذاكرة. يصف هذا البروتوكول مجموعة من الإجراءات القوية والفعالة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي للخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن في الفئران التي تتحرك بحرية.

Abstract

عادة ما تكون هناك حاجة إلى نهج في الوقت الفعلي في دراسات التعلم والذاكرة ، ويوفر تصوير الكالسيوم في الجسم الحي إمكانية التحقيق في النشاط العصبي في المستيقظة أثناء المهام السلوكية. نظرا لأن الحصين يرتبط ارتباطا وثيقا بالذاكرة العرضية والمكانية ، فقد أصبح منطقة دماغية أساسية في أبحاث هذا المجال. في الأبحاث الحديثة ، تمت دراسة خلايا engram وخلايا المكان من خلال تسجيل الأنشطة العصبية في منطقة الحصين CA1 باستخدام المجهر المصغر في الفئران أثناء أداء المهام السلوكية بما في ذلك المجال المفتوح والمسار الخطي. على الرغم من أن التلفيف المسنن هو منطقة مهمة أخرى في الحصين ، إلا أنه نادرا ما تمت دراسته باستخدام التصوير في الجسم الحي نظرا لعمقه الأكبر وصعوبة التصوير. في هذا البروتوكول ، نقدم بالتفصيل عملية تصوير الكالسيوم ، بما في ذلك كيفية حقن الفيروس ، وزرع عدسة GRIN (مؤشر التدرج) ، وإرفاق لوحة قاعدة لتصوير التلفيف المسنن للحصين. كما وصفنا كيفية المعالجة المسبقة لبيانات تصوير الكالسيوم باستخدام MATLAB. بالإضافة إلى ذلك ، قد تستفيد الدراسات التي أجريت على مناطق الدماغ العميقة الأخرى التي تتطلب التصوير من هذه الطريقة.

Introduction

وجدت الدراسات السابقة أن الحصين هو بنية دماغية ضرورية لمعالجة واسترجاع الذكريات ^1,2. منذ خمسينيات القرن العشرين ، كانت الدوائر العصبية للحصين في القوارض محور التركيز في دراسة تكوين الذاكرة وتخزينها واسترجاعها³. تشمل الهياكل التشريحية داخل الحصين المناطق الفرعية للتلفيف المسنن (DG) و CA1 و CA2 و CA3 و CA4 و subiculum⁴. توجد اتصالات ثنائية الاتجاه معقدة بين هذه المناطق الفرعية ، والتي تشكل DG و CA1 و CA3 دائرة ثلاثية المشابك بارزة تتكون من خلايا حبيبية وخلايا هرمية⁵. تتلقى هذه الدائرة مدخلاتها الأولية من القشرة المخية الداخلية (EC) وكانت نموذجا كلاسيكيا لدراسة اللدونة المشبكية. ركزت الأبحاث السابقة في الجسم الحي على وظيفة الحصين في الغالب على CA1 ^6,7 نظرا لسهولة الوصول إليها. بينما تلعب الخلايا العصبية CA1 أدوارا مهمة في تكوين الذاكرة وتوحيدها واسترجاعها ، لا سيما في الخلايا المكانية للذاكرة المكانية ، فإن المناطق الفرعية الأخرى من الحصين حيوية أيضا ^8,9. على وجه الخصوص ، أبرزت الدراسات الحديثة وظائف DG في تكوين الذاكرة. تم الإبلاغ عن أن الخلايا المكانية في DG أكثر استقرارا من تلك الموجودة في CA1¹⁰ ، وتعكس أنشطتها معلومات خاصة بالسياق¹¹. علاوة على ذلك ، يمكن إعادة تنشيط وضع العلامات المعتمدة على النشاط لخلايا حبيبات DG للحث على السلوكيات المتعلقة بالذاكرة¹². لذلك ، للحصول على فهم أعمق لتشفير المعلومات في DG ، من الأهمية بمكان التحقيق في أنشطة المنطقة دون الإقليمية DG أثناء قيام بمهام تعتمد على الذاكرة.

استخدمت الدراسات السابقة لأنشطة DG في الغالب في الفيزيولوجيا الكهربية^{للكائن الحي 13}. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها بعض العيوب: أولا ، في التسجيلات الكهربائية ، قد يكون من الصعب تحديد الأنواع المختلفة من الخلايا التي تولد الإشارة مباشرة. الإشارات المسجلة هي من كل من الخلايا المثبطة والإثارة. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من طرق معالجة البيانات لفصل هذين النوعين من الخلايا. علاوة على ذلك ، من الصعب الجمع بين معلومات نوع الخلية الأخرى ، مثل المجموعات الفرعية الخاصة بالإسقاط أو العلامات المعتمدة على النشاط ، مع التسجيلات الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للتشكل التشريحي ل DG ، غالبا ما يتم زرع أقطاب التسجيل في اتجاه متعامد ، مما يحد بشكل كبير من عدد الخلايا العصبية التي يمكن تسجيلها. وبالتالي ، من الصعب على التسجيلات الكهربائية تحقيق مراقبة مئات الخلايا العصبية الفردية من بنية DG في نفس¹⁴.

تقنية تكميلية لتسجيل أنشطة الخلايا العصبية في DG هي استخدامها في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ¹⁵. أيونات الكالسيوم أساسية لعمليات الإشارات الخلوية في الكائنات الحية ، وتلعب دورا حاسما في العديد من الوظائف الفسيولوجية ، خاصة داخل الجهاز العصبي للثدييات. عندما تكون الخلايا العصبية نشطة ، يزداد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا بسرعة ، مما يعكس الطبيعة الديناميكية للنشاط العصبي ونقل الإشارات. لذلك ، فإن تسجيل التغيرات في الوقت الفعلي في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية يوفر رؤى مهمة حول آليات الترميز العصبي.

تستخدم تقنية تصوير الكالسيوم أصباغ الفلورسنت المتخصصة أو مؤشرات الكالسيوم المعدلة وراثيا (GECIs) لمراقبة تركيزات أيونات الكالسيوم في الخلايا العصبية عن طريق اكتشاف التغيرات في شدة التألق ، والتي يمكن التقاطها بعد ذلك من خلال التصوير المجهري¹⁶. بشكل عام ، يتم استخدام عائلة GCaMP لجينات مؤشر الكالسيوم ، والتي تضم بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، والكالمودولين ، وتسلسل عديد الببتيد M13. يمكن أن ينبعث GCaMP من مضان أخضر عندما يرتبط بأيونات الكالسيوم¹⁷ ، مما يسمح بتسجيل التقلبات في التألق الأخضر عبر التصوير¹⁸. بالإضافة إلى ذلك ، للحصول على صور واضحة لمنطقة الدماغ المستهدفة ، عادة ما يتم زرع عدسة مؤشر التدرج (عدسة GRIN) فوق المنطقة المعنية. تتيح عدسة GRIN تصوير منطقة الدماغ العميقة التي لا يمكن الوصول إليها مباشرة من السطح.

من السهل نسبيا دمج هذه التقنية مع الأدوات الجينية الأخرى لتسمية أنواع الخلايا المختلفة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن مستوى التصوير مواز لاتجاه الخلايا في DG ، يمكن الوصول إلى مئات الخلايا العصبية للتصوير مع كل عملية جراحية ناجحة. في هذا العمل ، نقدم بروتوكول جراحة كامل ومفصل لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي في التلفيف المسنن في الفئران (الشكل 1). يتضمن الإجراء عمليتين رئيسيتين. الأول هو حقن فيروس AAV-CaMKIIα-GCaMP6f في DG. العملية الثانية هي زرع عدسة GRIN فوق موقع حقن الفيروس. يتم إجراء هذين الإجراءين في نفس الجلسة. بعد التعافي من هذه العمليات الجراحية ، فإن الخطوة التالية هي التحقق من جودة التصوير باستخدام المجاهر المصغرة (المناظير الصغيرة). إذا كان مجال التصوير يحتوي على مئات الخلايا النشطة ، فإن الإجراء اللاحق هو إرفاق لوحة قاعدة المنظار الصغير على جمجمة الفأر باستخدام الأسمنت السني. يمكن بعد ذلك استخدام الماوس لتجارب التصوير. نقدم أيضا خط أنابيب المعالجة المسبقة المستند إلى MATLAB لتبسيط تحليل بيانات الكالسيوم التي تم جمعها.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في جامعة فودان (202109004S). جميع المستخدمة في هذه الدراسة كانت C57BL / 6J البالغة من العمر 6 أشهر. تم استخدام كلا الجنسين. تم الاحتفاظ بالفئران في دورة ضوئية مدتها 12 ساعة ، من الساعة 8 صباحا حتى 8 مساء. استخدمنا الإحداثيات التالية لحقن الفيروس في DG: A / P: -2.2 مم ، M / L: 1.5 مم ، D / V: 1.7 مم من سطح الدماغ.

1. حقن الفيروس في التلفيف المسنن

1. ارتد معدات واقية، بما في ذلك القفازات والعباءات المعقمة ذات الاستخدام الواحد.
2. تحضير الأدوات الجراحية المطلوبة ، أنبوبان سعة 5 مل من محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم [معقمة] أو سوائل نخاعية اصطناعية) وإبرين حادين بقفل 25 جرام.
   ملاحظة: يجب تعقيم جميع الأدوات الجراحية جيدا قبل العملية. استخدمنا التعقيم في درجة حرارة عالية (121-134 درجة مئوية) والضغط (20 رطل / بوصة مربعة) لتعقيم الأدوات الجراحية. علاوة على ذلك ، قمنا برش الأسطح بمطهرات كحولية. في جميع العمليات الجراحية ، استخدمنا محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪. تم تعقيم الأدوات بشكل متقطع أثناء الجراحة باستخدام حبات زجاجية ساخنة.
3. قم بإعداد محلول مبيض بنسبة 10٪ في الماء لتطهير أي إمدادات قد تتلامس مع الفيروس.
4. قم بتخفيف فيروس AAV-CaMKIIα-GCaMP6f إذا لزم الأمر ، باستخدام محلول ملحي معقم ، وقم بتخزينه في الثلاجة 4 درجات مئوية أو على الثلج. العيار النهائي المستهدف للفيروس هو 1 × 10¹² GC / mL.
   ملاحظة: نوصي بتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة للفيروس للحفاظ على سلامة الفيروس. تحقيقا لهذه الغاية ، نقوم عموما بتحويل الفيروس عند استلامه من الشركة المصنعة إلى أحجام صغيرة (على سبيل المثال ، 2 ميكرولتر لكل أنبوب) ونحتفظ بها في مجمد -80 درجة مئوية. يجب استخدام الفيروس في يوم الذوبان ويجب عدم تخزينه عند 4 درجات مئوية للاستخدام على المدى الطويل.
5. استخدم مجتذب micropipette لسحب الماصة الدقيقة إلى طرف ناعم ، وقم بقص جزء صغير من الطرف بالمقص الجراحي ، واملأ الأنبوب بالزيت المعدني. تأكد من أن الماصة يمكنها امتصاص السائل بشكل طبيعي ثم قم بتثبيته على الحاقن.
   ملاحظة: استخدمنا طريقة سحب من خطوة واحدة مع ضبط السخان على ~ 60٪ من الطاقة القصوى. يمكن استخدام ساحبات أخرى لهذه الخطوة. الهدف العام هو جعل الطرف ~ 50-100 ميكرومتر في القطر ؛ سيؤثر القطر الصغير جدا على تدفق السائل ؛ سميكة جدا قد تسبب ضررا لأنسجة المخ من الماوس.
6. قم بتشغيل جميع الأدوات ، بما في ذلك آلة تخدير الماوس ، وآلة صيانة درجة الحرارة (وسادة التدفئة) ، ومضخة التفريغ. بالإضافة إلى ذلك ، قم بقياس وزن جسم الفئران قبل الجراحة.
   ملاحظة: أثناء الإجراء ، راقبنا تنفس الماوس بصريا وفحصنا أحيانا درجة حرارة الجسم للتأكد من أنها في حالة جيدة.
7. ضع الماوس في غرفة الغاز مع 2.5٪ إيزوفلوران و 1 لتر من الأكسجين / دقيقة. مراقبة ظروف التنفس للفأر لقياس حالة التخدير.
   ملاحظة: يجب أن يكون معدل التنفس حوالي 1 نفس / ثانية للحفاظ على صحة الماوس في صحة جيدة.
8. أخرج الماوس من غرفة الغاز وضعه على جهاز التجسيم.
9. تأكد من تخدير الماوس بشكل كاف قبل بدء العملية التالية. اختبر منعكس سحب الدواسة عن طريق الضغط على وسادات القدم لكلا القدمين الخلفيتين. إذا استجاب الماوس لقرصة وسادة القدم ، فقم بتطبيق تخدير إضافي وأعد اختبار المنعكس قبل المتابعة.
10. قم بتغطية أنف الماوس بقناع واضبط معدل تدفق الأيزوفلوران على 1.5٪. ثبت رأس الماوس بإحكام بقضبان الأذن (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: احرص على عدم تثبيت قضبان الأذن بإحكام شديد على الماوس لأن ذلك قد يؤثر بسهولة على تنفس الماوس وفي بعض الحالات يسبب الوفاة.
11. قم بقص الجزء العلوي من رأس الفأر بالمقص الجراحي ، واستخدم كريم مزيل الشعر لإزالة أي شعر متبقي حتى ينكشف الجلد تماما. ضع كريم مزيل الشعر على فروة رأس الفأر ، واتركه لمدة 5 دقائق تقريبا ، واستخدم الشاش لمسح الكريم.
12. ضع مرهم العيون على عيون الماوس.
13. تطهير المنطقة الخالية من الشعر بمطهر اليودوفور و 75٪ إيثانول باستخدام مسحات القطن.
14. قم بعمل شق مستمر على طول خط الوسط لفروة الرأس باستخدام مقص جراحي (أو شفرة مشرط) ، واقطع جزءا من فروة الرأس لكشف سطح الجمجمة (الشكل 2 ب). شطف سطح الجمجمة بالمحلول الملحي. ثم قم بإزالة اللفافة والمحلول الملحي المفرط باستخدام مضخة تفريغ. كرر هذه العملية عدة مرات حتى تتوقف المنطقة المحيطة بالجرح عن النزيف. امسح سطح الجمجمة بمسحات قطنية لإبقائها جافة.
    ملاحظة: هناك طرق أخرى لإزالة اللفافة ، مثل مسحها باستخدام كرة قطنية أو قطعة قطن.
15. استخدم إبرة تحديد الموقع لضبط سطح الجمجمة عندما تكون البريغما واللامدا مرئية. قم بإجراء عدة تعديلات حتى يتم تسوية الرأس بالكامل (الخطأ بالكامل في اتجاه المحور Z أقل من 0.05 مم).
16. حرك طرف الإبرة من البريغما إلى الموضع المستهدف المناسب. بالنسبة للإحداثيات المستهدفة ، استخدم bregma كنقطة مرجعية. حدد النقاط الأربع لتحديد محيط موقع حقن الفيروس: A / P: -2.0 مم ، M / L: -1.5 مم ؛ A / P: -2.5 مم ، M / L: -1.5 مم ؛ A / P -2.25 مم ، M / L: -1.0 مم ؛ و A / P -2.25 مم ، M / L: -2.0 مم ، مع علامة قابلة للمسح.
    ملاحظة: يقوم هذا البروتوكول بحقن الفيروس وزرع عدسة GRIN في نفس الجراحة. في هذا البروتوكول ، تم إجراء جميع العمليات الجراحية في نصف الكرة الأيمن ، ولكن من المتصور أنه يمكن استخدام أي من نصفي الكرة الأرضية. داخل منطقة الحقن المحددة بالنقاط الأربع المذكورة أعلاه ، قم بحقن الفيروس في ثلاث جرعات منفصلة 80 nL في مواقع مختلفة. على الرغم من أن المواقع الثلاثة تم اختيارها بشكل تعسفي ، إلا أننا نوصي بتفريقها لتحسين انتشار الفيروس. سيؤدي ذلك إلى زيادة عدد الخلايا المصابة.
17. جعل حج القحف في المنطقة مع microdrill وتعيين هذه النقاط الأربع كحدود. توقف عن الحفر عندما تكون أنسجة المخ مرئية (الشكل 2C).
    ملاحظة: حاول حفر الجمجمة ببطء. قد تضر مثقاب الحفر أنسجة المخ بسبب القوة المفرطة. يمكن أن يمنع الحفر البطيء أيضا ارتفاع درجة حرارة الدماغ.
18. قم بإزالة بقايا العظام والجافية باستخدام ملقط فائق الدقة وشطف هذه المنطقة باستمرار بمحلول ملحي معقم.
    ملاحظة: من الطبيعي أن تحدث كمية صغيرة من النزيف خلال هذه الخطوة ، حيث تمزق بعض الشعيرات الدموية. فقط استمر في الشطف بالمحلول الملحي حتى لا يكون هناك المزيد من النزيف.
19. استخدم لوحة التحكم الخاصة بالحاقن لإخراج بعض الزيوت المعدنية لتوليد المساحة المطلوبة للتحميل اللاحق للفيروس. املأ الماصة الدقيقة بما لا يقل عن 240 nL من الفيروس المخفف بسرعة 100 nL / s.
    ملاحظة: يجب تفريغ فقاعات الهواء في الأنبوب باستخدام لوحة التحكم لضمان أن الماصة الدقيقة توزع الكمية المناسبة من السائل. إذا كان حجم السائل لا يزال غير دقيق بعد عدة محاولات ، ففكر في تبديل الماصة الدقيقة والبدء من جديد. نوصي باستنشاق بعض الفيروسات الإضافية من حجم الحقن الفعلي ؛ هذا النهج يمنع الحقن غير المقصود للزيوت المعدنية في دماغ الفأر.
20. تحريك micropipette فوق منطقة حج القحف. ثم حركه ببطء إلى أنسجة المخ إلى المحور Z المستهدف ل D / V: 1.70 مم تحت سطح الدماغ.
    ملاحظة: يستخدم العديد من أطلس المراجع سطح الجمجمة ك D / V 0. في تجربتنا ، أدى استخدام الإحداثيات من سطح الدماغ إلى استهداف أكثر موثوقية ل DG.
21. استخدم لوحة التحكم لضبط الحاقن لحقن 80 nL من الفيروس بمعدل تدفق 1 nL / s (الشكل 2D). انقر فوق الزر INJECT في لوحة التحكم لحقن الفيروس. بعد ذلك ، حدد موقعين آخرين داخل حج القحف وكرر العملية السابقة.
    ملاحظة: كل حقنة تستغرق ~ 2 دقيقة. بعد الانتهاء من الحقن ، انتظر لمدة 8-10 دقائق إضافية قبل الانتقال إلى وضع آخر. عندما يحدث النزيف أثناء الإزالة ، اغسل على الفور بالمحلول الملحي.
22. قم بإزالة الماصة الدقيقة من الدماغ ببطء (الشكل 2E).

2. زرع عدسة GRIN في التلفيف المسنن

ملاحظة: نفذ هذه الخطوة مباشرة بعد الانتهاء من الحقن الفيروسي 240 nL.

1. تطهير عدسة GRIN بقطر 1 مم في 75٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة ؛ شطفه بشكل صحيح مع المياه المالحة قبل الزرع.
2. قم بتوسيع حج القحف باستخدام المثقاب الدقيق لزيادة الفتحة في اتجاه A / P إلى 1 مم تقريبا. مسح الحطام بالمحلول الملحي.
3. ثبت عدسة GRIN في مكانها بحامل وتأكد من كشف الطول المناسب.
   ملاحظة: من السهل لصق الحامل بعدسة GRIN عند تثبيته على الجمجمة باستخدام راتنج الأشعة فوق البنفسجية في الخطوات اللاحقة. ومع ذلك ، يمكن تجنب ذلك إذا كان الطول المكشوف للعدسة مناسبا.
4. استخدم الحامل لتحريك عدسة GRIN فوق منطقة حج القحف. اضبط موضع المحور Z على الصفر عندما يلامس الجزء السفلي من عدسة GRIN سطح أنسجة المخ. ثم قم بإزالة حامل عدسة GRIN وضعه جانبا.
5. قم بتوصيل الإبرة الحادة ذات القفل اللوير 25 جيجا بأنبوب شفط مضخة التفريغ واضبط الضغط على 0.04 ميجا باسكال.
   ملاحظة: إذا تم تنفيذ هذه الخطوة لأول مرة ، يمكن تقليل الضغط بشكل مناسب لشفط أنسجة المخ ببطء.
6. شفط أنسجة المخ عن طريق تدوير طرف الإبرة الحادة عن كثب فوق أنسجة المخ والضغط برفق على أنسجة المخ لتسهيل الشفط. يشطف بمحلول ملحي (يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية) باستمرار أثناء الشفط للحفاظ على رؤية واضحة للدماغ. راقب ميزات الأنسجة عن كثب لمراقبة عمق الشفط: النسيج القشري وردي شاحب ، ويظهر الجسم الثفني تحته كنسيج ليفي أبيض ، وطبقة الحصين CA1 حمراء داكنة ورمادية. أوقف الشفط عندما يصبح سطح الأنسجة أملسا وتتعرض مساحة كبيرة من CA1 (الشكل 3).
   ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لنجاح الإجراء بأكمله وغالبا ما تكون الجزء الأكثر صعوبة. لقد قدمنا قائمة بالمشكلات الشائعة لمساعدة القراء على استكشاف هذه الخطوة وإصلاحها (الجدول 1). علاوة على ذلك ، نوصي بشطف الجرح باستمرار بمحلول ملحي بارد ، لأن هذا يمكن أن يقلل من النزيف إلى حد ما.
   1. إذا انسدادت الإبرة. نعلق الإبرة المسدودة إلى حقنة وغسل الانسداد. حاول تغيير الإبرة إذا لم ينجح ذلك.
   2. إذا كان النزيف مستمرا ، فقد يحجب رؤية أنسجة المخ. إذا حدث هذا ، انتظر حتى يتجلط الدم ، ثم اشطفه بالمحلول الملحي.
7. حرك الحامل فوق الفتحة المحفورة. اضبط المحور Z على 0 عندما تلامس عدسة GRIN سطح أنسجة المخ. إذا تجاوزت عدسة GRIN قطر الفتحة ، فاستخدم المثقاب الصغير لتوسيع الفتحة. ثم كرر هذا الإجراء.
8. أدخل عدسة GRIN في الفتحة الموجودة في D / V: -1.32 مم. دع الحامل يقف لمدة 5-10 دقائق. بعد رفع الحامل ، اشطف الحفرة بالمحلول الملحي. كرر هذه الخطوة 3x (الشكل 4 أ).
   ملاحظة: من الطبيعي أن تنزف أنسجة المخ خلال هذه الخطوة. بعد شطف المحلول الملحي المتكرر ، يجب ألا يكون هناك المزيد من الدم في الحفرة. تتأثر جودة التصوير بشكل كبير بهذه الخطوة ، وإذا لم يتم تنظيف الدم ، فقد يتسبب ذلك في أن يكون مجال التصوير أسود.
9. استخدم محلول ملحي لتنظيف الجمجمة جيدا ثم اترك الجمجمة تجف قبل وضع راتنج الأشعة فوق البنفسجية.
10. استخدم إبرة لوضع راتنج الأشعة فوق البنفسجية حول عدسة GRIN. قم بإضاءة هذه المنطقة بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية وتأكد من أن راتنج الأشعة فوق البنفسجية يصبح صلبا (الشكل 4 ب).
    ملاحظة: ضع راتنج الأشعة فوق البنفسجية قليلا في كل مرة وكرر هذه العملية عدة مرات حتى يتم تغطية المنطقة المحيطة بعدسة GRIN. احرص على عدم تثبيت عدسة GRIN على الحامل عند استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية للإضاءة.
11. أخرج الحامل من عدسة GRIN بعناية. قم بتغطية الجمجمة المكشوفة بالكامل براتنج الأشعة فوق البنفسجية وضع لوح الرأس على الجمجمة في الموضع المناسب. قم بإضاءة الجمجمة ولوحة الرأس بالكامل بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية (الشكل 4C).
    ملاحظة: لوح الرأس عبارة عن مكون لتثبيت رأس الماوس بإحكام في مكانه عند توصيل الصفيحة الأساسية (انظر الملف التكميلي 1 للتصميم). تأمين صفيحة الرأس بأكبر قدر ممكن من الإحكام ؛ سيؤدي فصل صفيحة الرأس إلى فشل الجراحة بأكملها. في تجربتنا ، يجب أن يكون التطبيق الشامل لراتنج الأشعة فوق البنفسجية قادرا على توفير مرفق ثابت. إذا كانت هناك حاجة إلى مرفق أقوى ، يمكن للمرء أن يفكر في تثبيت مسامير الجمجمة.
12. قم بتغطية عدسة GRIN المكشوفة بغطاء واقي مطبوع 3D (انظر الملف التكميلي 2 للتصميم). ثبت الغطاء على لوح الرأس باستخدام مسامير M1.6 (الشكل 4D).
13. حقن ديكساميثازون داخل الصفاق (مذاب في محلول ملحي 0.9٪، 2 ملغ/كغ) بعد العملية لمنع الالتهاب بعد العملية الجراحية. بالإضافة إلى ذلك، يجب تطبيق حقن كاربروفين تحت الجلد (يذوب في محلول ملحي 0.9٪، 5 ملغ/كغ) لتقليل الألم بعد العملية الجراحية.
14. ضع الفئران مرة أخرى في القفص وانقلها إلى بطانية حرارية لتسهيل شفائها. بعد ذلك ، انقل الفئران إلى بيت التجريبية بعد أن تتمكن من التحرك بحرية.
    ملاحظة: لتجنب تلف الصفيحة الأساسية عن طريق القتال ، يمكن إيواء الفئران التي خضعت للجراحة بشكل فردي أو مع الحد الأدنى من المتعايشين. نوصي بعدم تجاوز ثلاثة فئران في قفص بعد الجراحة.
15. تطهير أسطح العمل باستخدام محلول تبييض 10٪. قم بإزالة معدات الحماية الشخصية التي تستخدم لمرة واحدة (PPE) وتخلص منها في أكياس بيولوجية.
16. مراقبة الفئران يوميا لمدة 3 أيام بعد الجراحة. سجل وزن جسم الفئران ولاحظ حالة التئام الجروح وأنشطة الحركة. توفير الحقن اليومية داخل الصفاق من محاليل ديكساميثازون وكاربروفين (نفس الجرعة كما في الخطوة 2.13) لمدة 3 أيام. توفير الطعام الرطب أو العلاج لتسهيل الشفاء عند الضرورة.

3. تحقق من جودة مجال التصوير

ملاحظة: يتعافى الفأر في غضون 2-3 أسابيع بعد الجراحة قبل أول جلسة تصوير للكالسيوم في الجسم الحي . الغرض من هذه الخطوة هو التحقق من جودة الجراحة واستعادة الماوس. إذا كان من الممكن ملاحظة نشاط الخلية الواحدة في مجال التصوير وكان الماوس في حالة جيدة ، فقم بتثبيت لوحة القاعدة على جمجمة الفأر. يجب القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم إذا كانت جودة التصوير أو الحالة الصحية غير كافية.

1. قم بتوصيل صندوق جمع بيانات miniscope بالكمبيوتر باستخدام كبل USB 3.0. ثم قم بتوصيل كبل Coax بالصندوق عبر موصل To Scope (SMA).
2. قم بتشغيل برنامج التحكم في المنظار المصغر. في البرنامج ، انقر فوق تحديد ملف التكوين | ملفات تكوين المستخدم V4 plus لعرض الصور الحية.
3. استخدم حاملا مخصصا للاحتفاظ بالماوس على عجلة التشغيل عن طريق تثبيت لوح الرأس. امسك المنظار الصغير بحامل المنظار الصغير (المصنوع من الطباعة ثلاثية الأبعاد ؛ انظر الملف التكميلي 3 للتصميم) ، واستخدم أداة مجسمة لتحريك المنظار الصغير فوق رأس الماوس (الشكل 4E).
4. قم بإزالة الغطاء باستخدام مفك البراغي. امسح سطح عدسة GRIN برفق باستخدام 75٪ إيثانول. ضع المنظار المصغر فوق عدسة GRIN المكشوفة مباشرة واجعل السطح السفلي للنطاق موازيا لسطح العدسة. اعثر على أفضل مستوى بؤري عن طريق توجيه المنظار الصغير ببطء نحو عدسة GRIN.
   ملاحظة: اضبط المستوى البؤري على 0 ، ثم اضبط موضع المنظار الصغير ؛ يوفر هذا مساحة أكبر لضبط التركيز. حدد المستوى البؤري مع تصور واضح لأكبر عدد من الخلايا.
5. في برنامج التحكم في miniscope ، اضبط طاقة ضوء LED على المستوى الأمثل.
   ملاحظة: لمراقبة نشاط الخلية الواحدة، يجب ألا يكون مجال التصوير معرضا بشكل مفرط أو مظلما جدا. عادة ما تكون شدة LED في حدود 10٪.
6. إذا كان تدفق الدم الوعائي مرئيا وكانت الخلايا عديدة وموزعة بشكل موحد في جميع أنحاء مجال التصوير ، فانتقل إلى القسم التالي من التجربة.
   ملاحظة: في هذه الخطوة ، من المهم أن تكون قادرا على مراقبة نشاط الخلية الواحدة. هذا يمكن أن يؤثر على نتائج تحليل البيانات. عادة ، يصعب تفسير الأنشطة الإقليمية (نقاط تقلبات الفلورسنت). قد يكون هذا مؤشرا على أن الخلايا العصبية المستهدفة خارج تركيز عدسة GRIN. لن يتم استخدام الماوس في التجارب اللاحقة إذا ظهر أن مجال التصوير أسود ، أو أن الخلايا تظهر نشاطا إقليميا ، أو لا يوجد عدد كاف من الخلايا.
7. افصل الكبل عن المنظار الصغير.

4. قم بتوصيل لوحة قاعدة المنظار الصغير بجمجمة الماوس

1. قم بتوصيل لوحة القاعدة بالمنظار الصغير ، وأعد ضبط مواضع المنظار الصغير للحصول على مجال رؤية بجودة تصوير جيدة.
2. اخلطي مواد قاعدة طقم الأسنان في وعاء الخلط.
   ملاحظة: من المهم ألا يتدفق الخليط بحرية كبيرة ولا يكون صلبا جدا. يميل الكثير من السيولة إلى تغطية سطح عدسة GRIN مما يتسبب في فقدان مجال التصوير. إذا كانت صلبة جدا ، فلن تتمكن المواد الأساسية لأطقم الأسنان من تغطية الفجوة بين لوحة القاعدة ولوحة الرأس بإحكام.
3. احرص على عدم تغيير موضع المنظار الصغير أثناء وضع الطبقة الأولى من مواد قاعدة طقم الأسنان حول لوحة قاعدة المنظار الصغير بعناية. انتظر حتى تصلب الطبقة الأولى من الأسمنت قبل وضع طبقة ثانية من الأسمنت من لوحة القاعدة إلى لوح الرأس. بعد تصلب جميع المواد الأساسية لأطقم الأسنان ، قم بفك المسمار اللولبي وافصل المنظار الصغير عن لوحة القاعدة.
   ملاحظة: عند استخدام مواد قاعدة طقم الأسنان ، انتبه إلى مجال التصوير في البرنامج وقم بإجراء أي تعديلات ضرورية قبل أن يصلب الأسمنت.
4. قم بإزالة ذراع الإمساك من المنظار الصغير برفق.
5. ضع غطاء لوحة القاعدة في لوحة القاعدة لحماية عدسة GRIN المكشوفة وشد المسمار اللولبي (الشكل 4F).
6. ضع الماوس مرة أخرى في قفص المنزل. امنح الفأر عدة أيام للتعافي قبل إجراء التجارب السلوكية.

5. الحصول على البيانات

ملاحظة: يمكن إجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في وقت واحد مع أي اختبارات سلوكية. في هذا البروتوكول ، نستخدم المسار الخطي كمثال. يبلغ طول هذا المسار الخطي 1.5 متر ويحتوي على ماء في كلا الطرفين ، وهو بمثابة مكافأة للفئران. يمكن للفئران ارتداء مجهر مصغر (مجهر صغير) والركض ذهابا وإيابا على طول المسار لمدة 20 دقيقة. خلال هذا الوقت ، تكون الفئران قادرة عادة على تشغيل ~ 60 تجربة.

1. قم بتوصيل صندوق جمع بيانات miniscope بالكمبيوتر باستخدام كبل USB 3.0. ثم قم بتوصيل كبل Coax بالصندوق عبر موصل To Scope (SMA).
2. قم بتشغيل برنامج التحكم في المنظار المصغر. في برنامج التحكم في miniscope ، انقر فوق تحديد ملف التكوين | ملفات تكوين المستخدم V4 plus لعرض الصور الحية.
3. قم بتوصيل الكاميرا الصناعية بالكمبيوتر باستخدام كابل USB 3.0.
4. قم بتشغيل برنامج التحكم في الكاميرا. في البرنامج ، انقر فوق Open Equipment ، وحدد الملف لاستيراد معلمات جمع البيانات. حدد تنسيق الفيديو كفيديو غير مضغوط في حاوية AVI. انقر فوق الزر ابدأ لعرض الصور الحية.
   ملاحظة: لتقليل حجم ملف فيديو التسجيل السلوكي ، يجب أن يستبعد مجال الرؤية أي مناطق غير ضرورية خارج المسار.
5. استخدم حاملا مخصصا للاحتفاظ بالماوس على عجلة التشغيل عن طريق تثبيت لوح الرأس.
6. قم بفك المسمار اللولبي باستخدام مفك البراغي ، وقم بإزالة غطاء لوحة القاعدة ، ونظف سطح عدسة GRIN باستخدام 75٪ من الإيثانول.
7. قم بتركيب المنظار الصغير على قاعدته. اربط المنظار الصغير بقاعدته على رأس الماوس.
8. ابحث عن أفضل مستوى بؤري عن طريق تحريك زر المستوى البؤري.
9. حرك الماوس من عجلة التشغيل إلى المسار الخطي برفق.
10. انقر مع الاستمرار فوق الزر "تسجيل " لبدء التسجيل باستخدام المنظار المصغر. بعد ذلك ، انقر فوق ابدأ التجميع زر لبدء تسجيل الكاميرا. سجل لمدة 20 دقيقة.
11. احفظ بيانات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي والبيانات السلوكية وبيانات Arduino بشكل منفصل. قم بتسمية هذه الملفات بالتاريخ ورقم الجلسة ورقم الماوس.
    ملاحظة: تميل الدراسات التي تستخدم منظارا صغيرا إلى الحصول على فترة طويلة الأجل لجمع البيانات على تجريبي واحد. يمكن أن تساعد تسمية الملفات بوضوح في إجراء معالجة البيانات.
12. افصل المنظار الصغير عن قاعدته.
13. أغلق برنامج التحكم في الكاميرا وبرنامج التحكم في miniscope والكمبيوتر.
14. افصل كبل coax من إلى النطاق (SMA) وكبل USB 3.0 من الكاميرا.
15. قم بفك المسمار اللولبي في القاعدة ، ثم أعد غطاء لوحة القاعدة ، وشد المسمار.
16. ضع الماوس مرة أخرى في قفص المنزل.

6. معالجة البيانات

1. قم بتحميل بيانات تصوير الكالسيوم المسجلة في MATLAB.
   ملاحظة: نحن ندرك أن تحليل البيانات يجب أن يكون مصمما وفقا للتصميم التجريبي. نقدم هنا خط أنابيب للمعالجة المسبقة يحول فيديو تصوير الكالسيوم الخام إلى آثار نشاط من الخلايا الفردية. نعتقد أن هذا الإجراء عالمي نسبيا ومفيد للمستخدمين. يمكن العثور على جميع البرامج النصية الموضحة في هذا القسم في الملف التكميلي 4.
2. قم بتحويل بيانات التصوير من تنسيق AVI إلى تنسيق HDF5 (.h5).
   ملاحظة: يولد الإخراج الأولي للمنظار الصغير ملفات AVI مع الضغط. عادة ما يكون حجم الملفات غير المضغوطة عشرات الجيجابايت. يسمح تنسيق ملف HDF5 بالوصول الافتراضي والجزئي الذي يمكن تصوره ومعالجته بسهولة للتحليل اللاحق.
3. تطبيق تصحيح الحركة غير الجامدة (NoRMCorre)¹⁹.
4. قم بأخذ عينة لأسفل من الفيلم المصحح للحركة في حالة محدودية ذاكرة الوصول العشوائي للكمبيوتر للخطوات اللاحقة.
   ملاحظة: يبلغ حجم البيانات الأصلية التي تم جمعها بواسطة miniscope 600 × 600. باستخدام عينة سفلية مكانية ، يمكننا تقليل حجم الفيديو إلى 200 × 200. تقلل هذه الطريقة بشكل كبير من متطلبات تخزين البيانات وتسمح بمعالجة البيانات بشكل أسرع.
5. قم بتطبيق EXTRACT على البيانات التي تم أخذ عينات منها لتحديد إشارات الخلية الواحدة، باتباع الإرشادات الخاصة برمز EXTRACT في المستودع عبر الإنترنت²⁰ (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public).

النتائج

يوضح الشكل 1 الرسم التخطيطي للإجراء التجريبي ، بما في ذلك حقن الفيروس ، وزرع عدسة GRIN ، وتثبيت لوحة القاعدة ، وتصوير الكالسيوم في الجسم الحي عبر منظار صغير ، ومعالجة البيانات. عموما ، يستغرق الإجراء بأكمله 1 شهر. يوضح الشكل 2 أمثلة على إجراءات حقن الفيروس ...

Discussion

وصفنا هنا إجراء لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي في DG للفئران. نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا للباحثين الذين يهدفون إلى دراسة وظائف DG في العمليات المعرفية المختلفة ، لا سيما في الحالات التي تكون فيها مجموعة فرعية محددة وراثيا ذات أهمية. نوضح هنا مزايا بروتوكولنا ، مع التركيز على ب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 μL universal pipette tips	Transcat Pipettes	1030-260-000-9	For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips)	iSmile	20-0105	For removing the brain tissue
3D printed protective cap	N/A	N/A	To protect the GRIN Lens
75% ethanol	Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd	bwsj-230219105303	For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus	Brain Case	BC-0083	For viral injection
Adobe Illustrator	Adobe	cc 2018 version 22.1	To draw figures
Anesthesia air pump	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-30	For anesthesia
Camera control software	Daheng Imaging	Galaxy Windows SDK_CN (V2)	For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder)	RWD Life Science Co.,Ltd	68214	To hold the GRIN lens
Carprofen	MedChemExpress	53716-49-7	To reduce postoperative pain of the mouse
Coax Cable	Open ephys	CW8251	To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope	Olympus Life Science	FV3000	For observing the brain slices
Cotton swab	Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd	20202140438	For disinfection
Customized headplate	N/A	N/A	For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder	N/A	N/A	To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing)	New Centry Dental	430205	For attaching the miniscope
Depilatory cream	Veet	ASIN : B001DUUPQ0	For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M	RWD Life Science Co.,Ltd	68803	For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone	Huachu Co., Ltd.	N/A	To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope	RWD Life Science Co., Ltd	MZ62-WX	For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-31-6	For anesthesia
GRIN lens	GoFoton	CLHS100GFT003	For GRIN lens implantation
GRIN lens	InFocus Grin Corp	SIH-100-043-550-0D0-NC	For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)	RWD Life Science Co.,Ltd	V100	For anesthesia
Industrial camera	Daheng Imaging	MER-231-41U3M-L, VS-0618H1	For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant	Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd	8861F6DFC92A	For disinfection
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10	For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	For viral injection
MATLAB	MathWorks	R2021b	For analyzing the data
Microdrill	RWD Life Science Co.,Ltd	78001	For craniotomy
Micropipette puller	Narishige International USA	PC-100	For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	For viral injection
Miniscope DAQ Software	Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)	N/A	For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)	Open ephys	V3.3	To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4	Open ephys	V4	For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2)	Open ephys	Variant 2	For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-207	For viral injection
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.	H37022025	To keep the eyes moist
PCR tube	LabServ	309101009	For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad)	Lenovo	20W0-005UCD	To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel	Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd	NA-H115	For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	60902	To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	S2	For unscrew the set screws
Set screw	TBD	2-56 cone point set screw	For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co.,Ltd	R500	For anesthesia
Sterile syringe	Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD	20163140236	For rinse the blood
Surgical scissors	RWD Life Science Co.,Ltd	S14016-13	For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl.	RWD Life Science Co.,Ltd	69027	To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps	RWD Life Science Co.,Ltd	F11020-11	For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable	Open ephys	N/A	To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light	Jinshida	66105854002	To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive)	Loctite	32268	To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump	Kylin-Bell	GL-802B	To remove the blood, saline and the brain tissue