تصوير الكالسيوم في الجسم الحي للخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن للحصين في الفئران

Summary

يؤدي التلفيف المسنن للحصين وظائف أساسية ومتميزة في التعلم والذاكرة. يصف هذا البروتوكول مجموعة من الإجراءات القوية والفعالة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي للخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن في الفئران التي تتحرك بحرية.

Abstract

عادة ما تكون هناك حاجة إلى نهج في الوقت الفعلي في دراسات التعلم والذاكرة ، ويوفر تصوير الكالسيوم في الجسم الحي إمكانية التحقيق في النشاط العصبي في المستيقظة أثناء المهام السلوكية. نظرا لأن الحصين يرتبط ارتباطا وثيقا بالذاكرة العرضية والمكانية ، فقد أصبح منطقة دماغية أساسية في أبحاث هذا المجال. في الأبحاث الحديثة ، تمت دراسة خلايا engram وخلايا المكان من خلال تسجيل الأنشطة العصبية في منطقة الحصين CA1 باستخدام المجهر المصغر في الفئران أثناء أداء المهام السلوكية بما في ذلك المجال المفتوح والمسار الخطي. على الرغم من أن التلفيف المسنن هو منطقة مهمة أخرى في الحصين ، إلا أنه نادرا ما تمت دراسته باستخدام التصوير في الجسم الحي نظرا لعمقه الأكبر وصعوبة التصوير. في هذا البروتوكول ، نقدم بالتفصيل عملية تصوير الكالسيوم ، بما في ذلك كيفية حقن الفيروس ، وزرع عدسة GRIN (مؤشر التدرج) ، وإرفاق لوحة قاعدة لتصوير التلفيف المسنن للحصين. كما وصفنا كيفية المعالجة المسبقة لبيانات تصوير الكالسيوم باستخدام MATLAB. بالإضافة إلى ذلك ، قد تستفيد الدراسات التي أجريت على مناطق الدماغ العميقة الأخرى التي تتطلب التصوير من هذه الطريقة.

Introduction

وجدت الدراسات السابقة أن الحصين هو بنية دماغية ضرورية لمعالجة واسترجاع الذكريات ^1,2. منذ خمسينيات القرن العشرين ، كانت الدوائر العصبية للحصين في القوارض محور التركيز في دراسة تكوين الذاكرة وتخزينها واسترجاعها³. تشمل الهياكل التشريحية داخل الحصين المناطق الفرعية للتلفيف المسنن (DG) و CA1 و CA2 و CA3 و CA4 و subiculum⁴. توجد اتصالات ثنائية الاتجاه معقدة بين هذه المناطق الفرعية ، والتي تشكل DG و CA1 و CA3 دائرة ثلاثية المشابك بارزة تتكون من خلايا حبيبية وخلايا هرمية⁵. تتلقى هذه الدائرة مدخلاتها الأولية من القشرة المخية الداخلية (EC) وكانت نمو....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في جامعة فودان (202109004S). جميع المستخدمة في هذه الدراسة كانت C57BL / 6J البالغة من العمر 6 أشهر. تم استخدام كلا الجنسين. تم الاحتفاظ بالفئران في دورة ضوئية مدتها 12 ساعة ، من الساعة 8 صباحا حتى 8 مساء. استخدمنا الإحداثيات التالية لحقن الفيروس في DG: A / P: -2.2 مم ، M / L: 1.5 مم ، D / V: 1.7 مم من سطح الدماغ.

1. حقن الفيروس في التلفيف المسنن

1. ارتد معدات واقية، بما في ذلك القفازات والعباءات المعقمة ذات الاستخدام الواحد.
2. تحضير الأدوات الجراحية المطلوبة ، أنبوبان سعة 5 مل من محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم [معقمة] أو سوائل ....

النتائج

يوضح الشكل 1 الرسم التخطيطي للإجراء التجريبي ، بما في ذلك حقن الفيروس ، وزرع عدسة GRIN ، وتثبيت لوحة القاعدة ، وتصوير الكالسيوم في الجسم الحي عبر منظار صغير ، ومعالجة البيانات. عموما ، يستغرق الإجراء بأكمله 1 شهر. يوضح الشكل 2 أمثلة على إجراءات حقن الفيروس .......

Discussion

وصفنا هنا إجراء لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي في DG للفئران. نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا للباحثين الذين يهدفون إلى دراسة وظائف DG في العمليات المعرفية المختلفة ، لا سيما في الحالات التي تكون فيها مجموعة فرعية محددة وراثيا ذات أهمية. نوضح هنا مزايا بروتوكولنا ، مع التركيز على ب?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 μL universal pipette tips	Transcat Pipettes	1030-260-000-9	For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips)	iSmile	20-0105	For removing the brain tissue
3D printed protective cap	N/A	N/A	To protect the GRIN Lens
75% ethanol	Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd	bwsj-230219105303	For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus	Brain Case	BC-0083	For viral injection
Adobe Illustrator	Adobe	cc 2018 version 22.1	To draw figures
Anesthesia air pump	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-30	For anesthesia
Camera control software	Daheng Imaging	Galaxy Windows SDK_CN (V2)	For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder)	RWD Life Science Co.,Ltd	68214	To hold the GRIN lens
Carprofen	MedChemExpress	53716-49-7	To reduce postoperative pain of the mouse
Coax Cable	Open ephys	CW8251	To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope	Olympus Life Science	FV3000	For observing the brain slices
Cotton swab	Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd	20202140438	For disinfection
Customized headplate	N/A	N/A	For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder	N/A	N/A	To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing)	New Centry Dental	430205	For attaching the miniscope
Depilatory cream	Veet	ASIN : B001DUUPQ0	For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M	RWD Life Science Co.,Ltd	68803	For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone	Huachu Co., Ltd.	N/A	To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope	RWD Life Science Co., Ltd	MZ62-WX	For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-31-6	For anesthesia
GRIN lens	GoFoton	CLHS100GFT003	For GRIN lens implantation
GRIN lens	InFocus Grin Corp	SIH-100-043-550-0D0-NC	For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)	RWD Life Science Co.,Ltd	V100	For anesthesia
Industrial camera	Daheng Imaging	MER-231-41U3M-L, VS-0618H1	For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant	Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd	8861F6DFC92A	For disinfection
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10	For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	For viral injection
MATLAB	MathWorks	R2021b	For analyzing the data
Microdrill	RWD Life Science Co.,Ltd	78001	For craniotomy
Micropipette puller	Narishige International USA	PC-100	For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	For viral injection
Miniscope DAQ Software	Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)	N/A	For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)	Open ephys	V3.3	To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4	Open ephys	V4	For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2)	Open ephys	Variant 2	For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-207	For viral injection
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.	H37022025	To keep the eyes moist
PCR tube	LabServ	309101009	For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad)	Lenovo	20W0-005UCD	To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel	Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd	NA-H115	For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	60902	To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	S2	For unscrew the set screws
Set screw	TBD	2-56 cone point set screw	For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co.,Ltd	R500	For anesthesia
Sterile syringe	Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD	20163140236	For rinse the blood
Surgical scissors	RWD Life Science Co.,Ltd	S14016-13	For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl.	RWD Life Science Co.,Ltd	69027	To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps	RWD Life Science Co.,Ltd	F11020-11	For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable	Open ephys	N/A	To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light	Jinshida	66105854002	To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive)	Loctite	32268	To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump	Kylin-Bell	GL-802B	To remove the blood, saline and the brain tissue