Визуализация кальция in vivo гранулярных клеток зубчатой извилины гиппокампа у мышей

Резюме

Зубчатая извилина гиппокампа выполняет важные и различные функции в обучении и памяти. Этот протокол описывает набор надежных и эффективных процедур визуализации кальция in vivo гранулярных клеток в зубчатой извилине у свободно движущихся мышей.

Аннотация

Подходы в реальном времени, как правило, необходимы при изучении обучения и памяти, а визуализация кальция in vivo дает возможность исследовать активность нейронов у бодрствующих животных во время выполнения поведенческих задач. Поскольку гиппокамп тесно связан с эпизодической и пространственной памятью, он стал важной областью мозга в исследованиях в этой области. В недавних исследованиях энграммные клетки и клетки места изучались путем регистрации нейронной активности в области CA1 гиппокампа с помощью миниатюрного микроскопа у мышей при выполнении поведенческих задач, включая открытое поле и линейную траекторию. Хотя зубчатая извилина является еще одной важной областью в гиппокампе, она редко изучалась с помощью визуализации in vivo из-за ее большей глубины и сложности для визуализации. В этом протоколе мы подробно описываем процесс визуализации кальция, в том числе способы введения вируса, имплантации линзы GRIN (градиентного индекса) и прикрепления опорной пластины для визуализации зубчатой извилины гиппокампа. Далее мы опишем, как предварительно обработать данные визуализации кальция с помощью MATLAB. Кроме того, этот метод может быть полезен для исследований других глубоких областей мозга, требующих визуализации.

Введение

Предыдущие исследования показали, что гиппокамп является структурой мозга, необходимой для обработки и извлечения воспоминаний ^1,2. С 1950-х годов нейронные цепи гиппокампа у грызунов были в центре внимания при изучении формирования, хранения и^{извлечения памяти}. Анатомические структуры в пределах гиппокампа включают субрегионы зубчатой извилины (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 и субикулума⁴. Между этими субобластями существуют сложные двунаправленные связи, из которых DG, CA1 и CA3 образуют заметную трисинаптическую цепь, состоящую из гранулярных клеток и пирамидальных клеток⁵. Эта схема получает первичный вход от энторинальной коры (ЭК) и является классической моделью для изучения синаптической пластичности. Предыдущие исследования функции гиппокампа in vivo в основном были сосредоточены на CA1 ^6,7 из-за его более легкого доступа. В то время как нейроны CA1 играют важную роль в формировании, консолидации и извлечении памяти, особенно в клетках пространственной памяти, другие субрегионы гиппокампа^{также жизненно важны.} В частности, последние исследования выявили функции ДГ в формировании памяти. Сообщалось, что клетки места в DG более стабильны, чем в CA1¹⁰, и их активность отражает контекстно-зависимую информацию¹¹. Кроме того, активно-зависимая маркировка гранулярных клеток DG может быть реактивирована для индуцирования поведения, связанного с^{памятью 12}. Таким образом, чтобы получить более глубокое понимание кодирования информации в DG, крайне важно исследовать деятельность субрегиона DG в то время, когда животное выполняет задачи, зависящие от памяти.

В предыдущих исследованиях активности ДГ в основном использовалась электрофизиология in vivo ¹³. Однако у этого метода есть некоторые недостатки: во-первых, при электрических записях может быть трудно напрямую идентифицировать различные типы клеток, которые генерируют сигнал. Регистрируемые сигналы поступают как от тормозных, так и от возбуждающих клеток. Таким образом, для разделения этих двух типов ячеек требуются дополнительные методы обработки данных. Кроме того, трудно объединить информацию о других типах клеток, такую как подгруппы, специфичные для проекции, или маркировка, зависящая от активности, с электрическими записями. Кроме того, из-за анатомической морфологии ДГ записывающие электроды часто имплантируются в ортогональном направлении, что сильно ограничивает количество нейронов, которые могут быть зарегистрированы. Таким образом, с помощью электрических записей трудно обеспечить мониторинг сотен отдельных нейронов из структуры ДГ у одного и того же животного¹⁴.

Дополнительным методом регистрации активности нейронов при ДГ является использование визуализации кальция in vivo ¹⁵. Ионы кальция имеют основополагающее значение для клеточных сигнальных процессов в организмах, играя решающую роль во многих физиологических функциях, особенно в нервной системе млекопитающих. Когда нейроны активны, внутриклеточная концентрация кальция быстро увеличивается, отражая динамический характер активности нейронов и передачи сигналов. Таким образом, запись изменений внутриклеточного уровня кальция в нейронах в режиме реального времени дает важную информацию о механизмах нейронного кодирования.

Технология визуализации кальция использует специализированные флуоресцентные красители или генетически модифицированные индикаторы кальция (GECI) для мониторинга концентраций ионов кальция в нейронах путем обнаружения изменений в интенсивности флуоресценции, которые затем могут быть зафиксированы с помощью микроскопической^{визуализации}. Как правило, используется семейство генов-индикаторов кальция GCaMP, включающее зеленый флуоресцентный белок (GFP), кальмодулин и полипептидные последовательности M13. GCaMP может излучать зеленую флуоресценцию при связывании с ионами кальция¹⁷, что позволяет регистрировать колебания зеленой флуоресценции с помощью визуализации¹⁸. Кроме того, для получения четких изображений целевой области мозга обычно имплантируется линзы с градиентным индексом (линза GRIN) над исследуемой областью. Линза GRIN позволяет визуализировать глубокую область мозга, к которой невозможно получить доступ непосредственно с поверхности.

Этот метод относительно легко комбинировать с другими генетическими инструментами для маркировки различных типов клеток. Более того, поскольку плоскость визуализации параллельна ориентации клеток в DG, сотни нейронов доступны для визуализации при каждой успешной операции. В этой работе мы представляем полный и подробный протокол хирургического вмешательства для визуализации кальция in vivo в зубчатой извилине у мышей (Рисунок 1). Процедура включает в себя две основные операции. Первый из них заключается в введении вируса AAV-CaMKIIα-GCaMP6f в DG. Вторая операция заключается в имплантации линзы GRIN над местом инъекции вируса. Эти две процедуры проводятся за один и тот же сеанс. После восстановления после этих операций следующим шагом является проверка качества изображения с помощью миниатюрных микроскопов (минископов). Если поле визуализации содержит сотни активных клеток, последующая процедура заключается в прикреплении опорной пластины минископа к черепу мыши с помощью стоматологического цемента; Затем мышь можно использовать для экспериментов по визуализации. Мы также представляем конвейер предварительной обработки на основе MATLAB для оптимизации анализа собранных данных о кальции.

протокол

Все процедуры с животными были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Фуданьском университете (202109004S). Все животные, использованные в этом исследовании, были C57BL/6J в возрасте 6 месяцев; Использовались представители обоих полов. Мышей держали на 12-часовом световом цикле, с 8 утра до 8 вечера. Для инъекции вируса в DG ИСПОЛЬЗОВАЛИСЬ СЛЕДУЮЩИЕ КООРДИНАТЫ: A/P: -2,2 мм, M/L: 1,5 мм, D/V: 1,7 мм от поверхности мозга.

1. Инъекция вируса в зубчатую извилину

1. Носите защитные средства, в том числе одноразовые стерильные перчатки и халаты.
2. Подготовьте необходимые хирургические инструменты, две пробирки по 5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl [стерильной] или искусственной спинномозговой жидкости) и две тупые иглы с люэровским замком 25 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть тщательно стерилизованы перед операцией. Для стерилизации хирургических инструментов мы использовали автоклавирование при высокой температуре (121-134 °C) и давлении (20 фунтов на квадратный дюйм). Кроме того, мы опрыскали поверхности дезинфицирующими средствами на спиртовой основе. Во всех хирургических вмешательствах мы использовали 0,9% стерильный физиологический раствор. Инструменты периодически стерилизовались во время операции с помощью нагретых стеклянных шариков.
3. Приготовьте 10% раствор отбеливателя в воде, чтобы продезинфицировать любые материалы, которые могут контактировать с вирусом.
4. При необходимости разведите вирус AAV-CaMKIIα-GCaMP6f с помощью стерилизованного физиологического раствора и храните его в холодильнике при температуре 4 °C или на льду. Целевой конечный титр вируса составляет 1 × 10¹² ГЦ/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем избегать повторяющихся циклов замораживания-размораживания вируса, чтобы сохранить целостность вируса. С этой целью мы обычно ализируем вирус при поступлении от производителя в небольшие объемы (например, 2 л на пробирку) и храним их в морозильной камере при температуре -80 °C. Вирус следует использовать в день оттаивания и не следует хранить при температуре 4 °C для длительного использования.
5. С помощью съемника микропипетки вытяните микропипетку до тонкого кончика, отрежьте небольшую часть кончика хирургическими ножницами и наполните пробирку минеральным маслом. Убедитесь, что пипетка может нормально всасывать жидкость, а затем установите ее на инжектор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали одноступенчатый метод вытягивания с нагревателем, установленным на ~60% от максимальной мощности. Для этого шага можно использовать другие пуллеры. Общая цель состоит в том, чтобы сделать наконечник ~50-100 мкм в диаметре; слишком маленький диаметр повлияет на текучесть жидкости; Слишком толстый слой может привести к повреждению мозговой ткани мыши.
6. Включите все инструменты, включая аппарат для анестезии мыши, аппарат для поддержания температуры (грелку) и вакуумный насос. Кроме того, измерьте массу тела мышей перед операцией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры мы следили за дыханием мышей визуально и время от времени проверяли температуру тела, чтобы убедиться, что они находятся в хорошем состоянии.
7. Поместите мышь в газовую камеру с 2,5% изофлураном и 1 л кислорода/мин. Следите за состоянием дыхания мыши, чтобы оценить состояние анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания должна составлять около 1 вдоха/с, чтобы поддерживать мышь в хорошем состоянии.
8. Достаньте мышь из газовой камеры и поместите ее на стереотаксический аппарат.
9. Перед началом следующей операции убедитесь, что мышь надлежащим образом обезболивается. Проверьте рефлекс отхода педали, зажав подушечки обеих задних ног. Если мышь реагирует на защемление подушечки стопы, введите дополнительную анестезию и повторно проверьте рефлекс, прежде чем продолжить.
10. Накройте нос мыши маской и установите скорость потока изофлурана на 1,5%. Надежно зафиксируйте головку мыши ушными планками (рис. 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не закрепить ушные планки на мыши слишком плотно, так как это может легко повлиять на дыхание мыши и в некоторых случаях привести к смерти.
11. Обрежьте макушку головы мыши хирургическими ножницами и используйте крем для депиляции, чтобы удалить остатки волос, пока кожа полностью не обнажится. Нанесите крем для депиляции на кожу головы мыши, оставьте на 5 минут и с помощью марли сотрите крем.
12. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши.
13. Продезинфицируйте безволосый участок дезинфицирующим средством йодофором и 75% этанолом с помощью ватных палочек.
14. Сделайте непрерывный разрез по средней линии кожи головы с помощью хирургических ножниц (или лезвия скальпеля) и отрежьте часть кожи головы, чтобы обнажить поверхность черепа (рисунок 2B). Промойте поверхность черепа солевым раствором; Затем удалите фасцию и излишки физиологического раствора с помощью вакуумного насоса. Повторяйте этот процесс несколько раз, пока область вокруг раны не перестанет кровоточить. Протрите поверхность черепа ватными палочками, чтобы она оставалась сухой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют и другие способы удаления фасции, такие как протирание ее ватным тампоном или ватным тампоном.
15. Используйте установочную иглу для регулировки поверхности черепа, когда видны брегма и лямбда. Внесите несколько регулировок до тех пор, пока вся головка не будет выровнена (общая погрешность в направлении оси Z составляет менее 0,05 мм).
16. Переместите кончик иглы из брегмы в соответствующее целевое положение. Для определения координат цели используйте брегму в качестве точки отсчета. Отметьте четыре точки для определения периметра места инъекции вируса: A/P: -2,0 мм, M/L: -1,5 мм; А/: -2,5 мм, М/Л: -1,5 мм; А/-2,25 мм, М/Л: -1,0 мм; и A/P -2,25 мм, M/L: -2,0 мм, со стираемым маркером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предусматривает инъекцию вируса и имплантацию линз GRIN в рамках одной операции. В этом протоколе все операции проводились на правом полушарии, но вполне возможно, что можно использовать любое полушарие. В пределах области инъекции, определенной четырьмя упомянутыми выше точками, введите вирус в трех отдельных дозах по 80 нл в разные места. Несмотря на то, что эти три местоположения были выбраны произвольно, мы рекомендуем рассредоточить их для лучшего распространения вируса. Это позволит увеличить количество зараженных клеток.
17. Проведите трепанацию черепа в области с помощью микросверла и установите эти четыре точки в качестве границы. Прекратите сверление, когда видна ткань мозга (рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь сверлить череп медленно. Сверло может нанести вред тканям мозга из-за чрезмерной силы. Медленное сверление также может предотвратить перегрев мозга.
18. Удалите костные остатки и твердую мозговую оболочку с помощью ультратонких щипцов и постоянно промывайте эту область стерильным физиологическим раствором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально, если на этом этапе возникает небольшое кровотечение, так как некоторые капилляры разрываются; Просто продолжайте полоскать солевым раствором, пока кровотечение не прекратится.
19. Используйте панель управления инжектора для выброса минерального масла, чтобы создать необходимое пространство для последующей загрузки вируса. Наполните микропипетку не менее 240 нл разведенного вируса со скоростью 100 нл/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха в пробирке должны выводиться с помощью панели управления, чтобы гарантировать, что микропипетка выдает необходимое количество жидкости. Если объем жидкости по-прежнему неточен после нескольких попыток, рассмотрите возможность замены микропипетки и начала заново. Мы рекомендуем аспирировать вирус в количестве, превышающем фактический объем инъекции; Такой подход предотвращает непреднамеренное введение минерального масла в мозг мыши.
20. Переместите микропипетку над областью трепанации черепа; затем медленно переместите его вниз в ткань мозга к целевой оси Z D/V: на 1,70 мм ниже поверхности мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во многих справочных атласах поверхность черепа используется как D/V 0. По нашему опыту, использование координат с поверхности мозга дало более надежное нацеливание для DG.
21. С помощью панели управления настройте инжектор на впрыскивание 80 нл вируса со скоростью потока 1 нл/с (рис. 2D). Нажмите кнопку INJECT на панели управления, чтобы внедрить вирус. Затем выберите два других положения в пределах трепанации черепа и повторите предыдущую операцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая инъекция занимает ~2 минуты. После окончания инъекции подождите еще 8-10 минут, прежде чем переходить в другое положение. При возникновении кровотечения во время удаления следует незамедлительно промыться физиологическим раствором.
22. Медленно извлеките микропипетку из мозга (рисунок 2E).

2. Имплантация линзы GRIN в зубчатую извилину

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг сразу после завершения инъекции вируса 240 нл.

1. Продезинфицируйте линзу GRIN диаметром 1 мм в 75% этаноле в течение 20 минут; Перед имплантацией тщательно промойте его физиологическим раствором.
2. Расширьте трепанацию черепа с помощью микросверла, чтобы увеличить отверстие в направлении A/P примерно до 1 мм. Очистите от мусора солевым раствором.
3. Зажмите линзу GRIN на месте держателем и убедитесь, что она имеет достаточную длину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель легко приклеить к линзе GRIN при фиксации ее на черепе с помощью УФ-смолы на последующих этапах. Однако этого можно избежать, если длина экспонирования объектива адекватна.
4. С помощью держателя переместите линзу GRIN над областью трепанации черепа. Установите положение оси Z в нулевое положение, когда нижняя часть линзы GRIN касается поверхности мозговой ткани. Затем снимите держатель объектива GRIN и отложите его в сторону.
5. Прикрепите тупую иглу люэровского замка 25 G к всасывающей трубке вакуумного насоса и отрегулируйте давление до 0,04 МПа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если этот шаг выполняется впервые, давление может быть соответствующим образом снижено для медленной аспирации мозговой ткани.
6. Отсосите мозговую ткань, вращая кончик тупой иглы близко над мозговой тканью, и мягко надавите на мозговую ткань, чтобы облегчить аспирацию. Промывайте солевым раствором (хранить при температуре 4 °C) непрерывно во время отсасывания, чтобы сохранить четкий обзор мозга. Внимательно рассмотрите особенности тканей, чтобы контролировать глубину аспирации: кортикальная ткань бледно-розовая, мозолистое тело под ней выглядит как белая волокнистая ткань, а слой CA1 гиппокампа темно-красный и серый. Прекратите отсасывание, когда поверхность ткани станет гладкой и обнажится большая площадь CA1 (рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для успеха всей процедуры и часто является самой сложной частью. Мы предоставили список распространенных проблем, чтобы помочь читателям устранить неполадки на этом этапе (Таблица 1). Кроме того, мы рекомендуем постоянно промывать рану холодным физиологическим раствором, так как это может в некоторой степени уменьшить кровотечение.
   1. Если игла засорилась; Приложите заблокированную иглу к шприцу и промойте закупорку. Попробуйте поменять иглу, если это не помогло.
   2. Если кровотечение постоянное, оно может блокировать обзор тканей мозга. Если это произошло, дождитесь сворачивания крови, после чего промойте ее солевым раствором.
7. Переместите держатель над просверленным отверстием. Установите ось Z в положение 0, когда линза GRIN соприкасается с поверхностью мозговой ткани. Если диаметр линзы GRIN превышает диаметр отверстия, используйте микросверло для расширения отверстия. Затем повторите эту процедуру.
8. Вставьте линзу GRIN в отверстие по D/V: -1,32 мм. Дайте держателю постоять 5-10 минут. Подняв держатель, промойте отверстие солевым раствором. Повторите этот шаг 3 раза (рисунок 4A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кровотечение из мозговой ткани во время этого этапа является нормальным явлением. После повторных полосканий солевым раствором в лунке больше не должно быть крови. Этот этап сильно влияет на качество изображения, и если кровь не очистить, это может привести к тому, что поле визуализации станет черным.
9. Используйте физиологический раствор для тщательной очистки черепа, а затем дайте черепу высохнуть, прежде чем наносить УФ-смолу.
10. С помощью иглы нанесите УФ-смолу вокруг линзы ГРИН. Освещайте эту область ультрафиолетовым светом в течение 15 с и следите за тем, чтобы УФ-смола стала твердой (Рисунок 4B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите УФ-смолу понемногу и повторяйте эту операцию несколько раз, пока область вокруг линзы GRIN не будет покрыта. Будьте осторожны, чтобы не прикрепить линзу GRIN к держателю при использовании ультрафиолетового света для освещения.
11. Осторожно снимите держатель с линзы GRIN. Покройте весь открытый череп ультрафиолетовой смолой и поместите оголовную пластину на череп в соответствующем положении. Освещайте весь череп и головную убору ультрафиолетовым светом в течение 15 секунд (рис. 4C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оголовье является компонентом для надежного удержания головы мыши на месте при креплении опорной пластины (см. Дополнительный файл 1 для дизайна). Закрепите оголовье как можно надежнее; Оторвавшаяся оголовье приведет к провалу всей операции. По нашему опыту, тщательное нанесение УФ-смолы должно обеспечить надежное крепление. Если требуется более прочное крепление, можно рассмотреть возможность установки винтов с черепом.
12. Накройте открытую линзу GRIN защитным колпачком, напечатанным на 3D-принтере (см. Дополнительный файл 2 для дизайна). Закрепите колпачок на оголовке с помощью винтов M1.6 (Рисунок 4D).
13. Внутрибрюшинно вводят дексаметазон (растворенный в 0,9% физрастворе, 2 мг/кг) после операции для профилактики послеоперационного воспаления. Кроме того, вводите подкожные инъекции карпрофена (растворенного в 0,9% физиологическом растворе, 5 мг/кг) для уменьшения послеоперационной боли.
14. Поместите мышей обратно в клетку и переложите их в термоодеяло, чтобы облегчить их восстановление. Затем перенесите мышей в домик для экспериментальных животных после того, как они смогут свободно передвигаться.
    Примечание: Чтобы избежать повреждения опорной пластины в результате драки, мыши, перенесшие операцию, могут содержаться индивидуально или с минимальным количеством сожителей. Мы рекомендуем не более трех мышей в клетке после операции.
15. Продезинфицируйте рабочие поверхности с помощью 10% раствора отбеливателя. Снимите одноразовые средства индивидуальной защиты (СИЗ) и утилизируйте их в пакетах для биологически опасных веществ.
16. Наблюдайте за мышами ежедневно в течение 3 дней после операции. Записывайте вес тела мышей и наблюдайте за их состоянием заживления ран и локомоцией. Обеспечить ежедневные внутрибрюшинные инъекции растворов дексаметазона и карпрофена (в той же дозировке, что и в пункте 2.13) в течение 3 дней. При необходимости обеспечьте влажный корм или лечение, чтобы облегчить восстановление.

3. Проверьте качество поля визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь восстанавливается через 2-3 недели после операции перед первым сеансом визуализации кальция in vivo . Целью этого шага является проверка качества операции и восстановления мыши. Если в поле визуализации можно наблюдать активность одиночных клеток и мышь находится в хорошем состоянии, прикрепите опорную пластину к черепу мыши. Мышь следует усыпить при вывихе шейки матки, если качество визуализации или состояние здоровья не являются адекватными.

1. Подключите блок сбора данных минископа к компьютеру с помощью кабеля USB 3.0. Затем подключите коаксиальный кабель к коробке через разъем To Scope (SMA).
2. Включите программное обеспечение для управления минископом. В разделе «Программное обеспечение» нажмите «Выбрать файл конфигурации» | Файлы конфигурации пользователя V4 plus для просмотра изображений в реальном времени.
3. Используйте специальный держатель для удержания мыши на беговом колесе, зажав оголовье. Держите минископ держателем минископа (изготовленным с помощью 3D-печати; дизайн см. в Дополнительном файле 3 ) и используйте стереотаксический инструмент, чтобы переместить минископ над головой мыши (рис. 4E).
4. Снимите колпачок с помощью отвертки. Аккуратно протрите поверхность линзы GRIN 75% этанолом. Расположите минископ прямо над экспонированной линзой GRIN и сделайте нижнюю поверхность эндоскопа параллельной поверхности линзы. Найдите наилучшую фокальную плоскость, медленно опуская минископ вниз к линзе GRIN.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установите фокальную плоскость на 0, затем отрегулируйте положение минископа; Это дает больше возможностей для регулировки фокуса. Выберите фокальную плоскость с четкой визуализацией наибольшего количества ячеек.
5. В программном обеспечении управления минископом отрегулируйте мощность светодиодного света до оптимального уровня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения за активностью отдельных клеток поле визуализации не должно быть ни переэкспонированным, ни слишком темным. Интенсивность светодиода обычно находится в пределах 10%.
6. Если виден сосудистый кровоток, а клетки многочисленны и равномерно распределены по всему полю визуализации, переходите к следующему разделу эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важно иметь возможность наблюдать активность отдельных клеток. Это может повлиять на результаты анализа данных. Как правило, региональную активность (сгустки флуоресцентных колебаний) трудно интерпретировать. Это может быть признаком того, что нейроны-мишени находятся вне фокуса линзы GRIN. Мышь не будет использоваться в последующих экспериментах, если окажется, что поле визуализации черное, клетки проявляют регионарную активность или количество клеток недостаточно.
7. Отсоедините кабель от минископа.

4. Прикрепите опорную пластину минископа к черепу мыши.

1. Прикрепите опорную пластину к минископу и снова отрегулируйте положение минископа, чтобы получить поле зрения с хорошим качеством изображения.
2. Смешайте материалы основы зубных протезов в миске для смешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы смесь не текла слишком свободно и не была слишком твердой. Слишком большая текучесть, как правило, покрывает поверхность линзы GRIN, вызывая потерю поля изображения. Если материал основания протеза слишком прочный, он не сможет плотно закрыть зазор между опорной пластиной и оголовком.
3. Осторожно следите за тем, чтобы не изменить положение минископа при нанесении первого слоя материала основания протеза вокруг опорной пластины минископа. Подождите, пока первый слой цемента затвердеет, прежде чем наносить второй слой цемента от опорной плиты к оголовку. После затвердевания всех материалов основания зубного протеза ослабьте установочный винт и отсоедините минископ от опорной пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании материалов основы для зубных протезов обратите внимание на поле визуализации в программном обеспечении и внесите необходимые корректировки до того, как цемент затвердеет.
4. Осторожно снимите удерживающий кронштейн с минископа.
5. Вставьте крышку опорной пластины в опорную пластину, чтобы защитить открытую линзу GRIN, и затяните установочный винт (Рисунок 4F).
6. Поместите мышь обратно в домашнюю клетку. Дайте мыши несколько дней на восстановление перед проведением поведенческих экспериментов.

5. Сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация кальция in vivo может быть выполнена одновременно с любыми поведенческими тестами. В этом протоколе мы используем линейную дорожку в качестве примера. Эта линейная дорожка имеет длину 1,5 м и с обоих концов имеет воду, которая служит наградой для мышей. Мыши могут носить миниатюрный микроскоп (минископ) и бегать взад и вперед по дорожке в течение 20 минут. За это время мыши обычно могут провести ~60 испытаний.

1. Подключите блок сбора данных минископа к компьютеру с помощью кабеля USB 3.0. Затем подключите коаксиальный кабель к коробке через разъем To Scope (SMA).
2. Включите программное обеспечение для управления минископом. В программном обеспечении для управления минископом нажмите «Выбрать файл конфигурации» | Файлы конфигурации пользователя V4 plus для просмотра изображений в реальном времени.
3. Подключите промышленную камеру к компьютеру с помощью кабеля USB 3.0.
4. Включите программное обеспечение для управления камерой. В программе нажмите «Открыть оборудование» и выберите файл для импорта параметров сбора данных. Выберите формат видео как «Несжатое видео» в контейнере AVI. Нажмите кнопку « Пуск », чтобы просмотреть изображения в реальном времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить размер файла поведенческой записи, поле зрения должно исключать любые ненужные области за пределами дорожки.
5. Используйте специальный держатель для удержания мыши на беговом колесе, зажав оголовье.
6. Ослабьте установочный винт с помощью отвертки, снимите крышку опорной пластины и очистите поверхность линзы GRIN 75% этанолом.
7. Установите минископ на основание. Закрепите минископ на его основании на голове мыши.
8. Найдите наилучшую фокальную плоскость, проведя пальцем по кнопке фокальной плоскости.
9. Плавно перемещайте мышь с бегового колеса на линейную дорожку.
10. Нажмите и удерживайте кнопку «Запись », чтобы начать запись с помощью минископа. Затем нажмите кнопку « Начать сбор», чтобы начать запись с камеры. Запись за 20 мин.
11. Сохраняйте данные визуализации кальция in vivo , поведенческие данные и данные Arduino отдельно. Назовите эти файлы датой, номером сеанса и номером мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исследования, в которых используется минископ, как правило, имеют долгосрочный период сбора данных на одном экспериментальном животном. Четкое именование файлов может помочь в процедуре обработки данных.
12. Отсоедините минископ от основания.
13. Закройте программное обеспечение для управления камерой, программное обеспечение для управления минископом и компьютер.
14. Отсоедините коаксиальный кабель от осциллографа To Scope (SMA) и кабель USB 3.0 от камеры.
15. Открутите установочный винт в основании, установите крышку опорной плиты обратно и затяните винт.
16. Поместите мышь обратно в домашнюю клетку.

6. Обработка данных

1. Загрузите записанные данные визуализации кальция в MATLAB.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы признаем, что анализ данных должен быть адаптирован к плану эксперимента. Здесь мы предоставляем конвейер предварительной обработки, который преобразует необработанное изображение кальция в следы активности отдельных клеток. Мы считаем эту процедуру относительно универсальной и полезной для пользователей. Все скрипты, описанные в этом разделе, можно найти в Дополнительном файле 4.
2. Преобразуйте данные изображения из формата AVI в формат HDF5 (.h5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанный вывод минископа генерирует файлы AVI со сжатием. Размер несжатых файлов обычно составляет десятки гигабайт. Формат файлов HDF5 обеспечивает виртуальный и частичный доступ, который можно легко визуализировать и использовать для последующего анализа.
3. Применение коррекции нежесткого движения (NoRMCorre)¹⁹.
4. Уменьшите дискретизацию фильма с коррекцией движения в случае, если на компьютере ограничена оперативная память для последующих шагов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные данные, собранные с помощью минископа, имеют размер 600 x 600. Используя пространственную даун-сэмплинг, мы можем уменьшить размер видео до 200 x 200. Этот метод значительно снижает требования к хранению данных и позволяет быстрее обрабатывать данные.
5. Примените EXTRACT к данным с пониженной дискретизацией для идентификации сигналов одиночных ячеек, следуя инструкциям по коду EXTRACT в онлайн-репозитории²⁰ (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public).

Результаты

На рисунке 1 показана схема экспериментальной процедуры, включая инъекцию вируса, имплантацию линзы GRIN, прикрепление опорной пластины, визуализацию кальция in vivo с помощью минископа и обработку данных. Как правило, вся процедура занимает 1 месяц. На рисун?...

Обсуждение

Здесь мы описали процедуру визуализации кальция in vivo в ДГ мышей. Мы считаем, что этот протокол будет полезен исследователям, стремящимся изучать функции ДГ в различных когнитивных процессах, особенно в тех случаях, когда представляет интерес генетически идентифицированная субпоп...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 μL universal pipette tips	Transcat Pipettes	1030-260-000-9	For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips)	iSmile	20-0105	For removing the brain tissue
3D printed protective cap	N/A	N/A	To protect the GRIN Lens
75% ethanol	Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd	bwsj-230219105303	For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus	Brain Case	BC-0083	For viral injection
Adobe Illustrator	Adobe	cc 2018 version 22.1	To draw figures
Anesthesia air pump	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-30	For anesthesia
Camera control software	Daheng Imaging	Galaxy Windows SDK_CN (V2)	For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder)	RWD Life Science Co.,Ltd	68214	To hold the GRIN lens
Carprofen	MedChemExpress	53716-49-7	To reduce postoperative pain of the mouse
Coax Cable	Open ephys	CW8251	To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope	Olympus Life Science	FV3000	For observing the brain slices
Cotton swab	Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd	20202140438	For disinfection
Customized headplate	N/A	N/A	For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder	N/A	N/A	To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing)	New Centry Dental	430205	For attaching the miniscope
Depilatory cream	Veet	ASIN : B001DUUPQ0	For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M	RWD Life Science Co.,Ltd	68803	For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone	Huachu Co., Ltd.	N/A	To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope	RWD Life Science Co., Ltd	MZ62-WX	For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-31-6	For anesthesia
GRIN lens	GoFoton	CLHS100GFT003	For GRIN lens implantation
GRIN lens	InFocus Grin Corp	SIH-100-043-550-0D0-NC	For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)	RWD Life Science Co.,Ltd	V100	For anesthesia
Industrial camera	Daheng Imaging	MER-231-41U3M-L, VS-0618H1	For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant	Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd	8861F6DFC92A	For disinfection
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10	For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	For viral injection
MATLAB	MathWorks	R2021b	For analyzing the data
Microdrill	RWD Life Science Co.,Ltd	78001	For craniotomy
Micropipette puller	Narishige International USA	PC-100	For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	For viral injection
Miniscope DAQ Software	Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)	N/A	For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)	Open ephys	V3.3	To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4	Open ephys	V4	For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2)	Open ephys	Variant 2	For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-207	For viral injection
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.	H37022025	To keep the eyes moist
PCR tube	LabServ	309101009	For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad)	Lenovo	20W0-005UCD	To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel	Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd	NA-H115	For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	60902	To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	S2	For unscrew the set screws
Set screw	TBD	2-56 cone point set screw	For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co.,Ltd	R500	For anesthesia
Sterile syringe	Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD	20163140236	For rinse the blood
Surgical scissors	RWD Life Science Co.,Ltd	S14016-13	For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl.	RWD Life Science Co.,Ltd	69027	To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps	RWD Life Science Co.,Ltd	F11020-11	For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable	Open ephys	N/A	To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light	Jinshida	66105854002	To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive)	Loctite	32268	To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump	Kylin-Bell	GL-802B	To remove the blood, saline and the brain tissue