Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi

Özet

Hipokampusun dentat girusu, öğrenme ve hafızada temel ve farklı işlevleri yerine getirir. Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde dentat girustaki granül hücrelerinin in vivo kalsiyum görüntülemesi için bir dizi sağlam ve verimli prosedürü tanımlar.

Özet

Gerçek zamanlı yaklaşımlara tipik olarak öğrenme ve hafıza çalışmalarında ihtiyaç duyulur ve in vivo kalsiyum görüntüleme, davranış görevleri sırasında uyanık hayvanlarda nöronal aktiviteyi araştırma imkanı sağlar. Hipokampus, epizodik ve uzamsal hafıza ile yakından ilişkili olduğundan, bu alanın araştırmalarında önemli bir beyin bölgesi haline gelmiştir. Son araştırmalarda, engram hücreleri ve yer hücreleri, açık alan ve doğrusal iz dahil olmak üzere davranışsal görevleri yerine getirirken farelerde minyatür mikroskop kullanılarak hipokampal CA1 bölgesindeki nöral aktiviteler kaydedilerek incelenmiştir. Dentat girus, hipokampustaki bir diğer önemli bölge olmasına rağmen, daha derin olması ve görüntüleme zorluğu nedeniyle nadiren in vivo görüntüleme ile çalışılmıştır. Bu protokolde, virüsün nasıl enjekte edileceği, bir GRIN (Gradyan indeksi) lensinin nasıl implante edileceği ve hipokampusun dentat girusunun görüntülenmesi için bir taban plakasının nasıl takılacağı dahil olmak üzere bir kalsiyum görüntüleme sürecini ayrıntılı olarak sunuyoruz. Kalsiyum görüntüleme verilerinin MATLAB kullanılarak nasıl ön işleneceğini daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ek olarak, görüntüleme gerektiren diğer derin beyin bölgelerinin çalışmaları bu yöntemden fayda sağlayabilir.

Giriş

Önceki çalışmalar, hipokampusun anıları işlemek ve geri almak için gerekli bir beyin yapısı olduğunu buldu ^1,2. 1950'lerden bu yana, kemirgenlerdeki hipokampusun nöral devreleri, hafıza oluşumu, depolanması ve geri çağrılması çalışmalarında odak noktası olmuştur³. Hipokampus içindeki anatomik yapılar, dentat girus (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 ve subiculum^4'ün alt bölgelerini içerir. Bu alt bölgeler arasında karmaşık çift yönlü bağlantılar bulunur ve bunlardan DG, CA1 ve CA3, granül hücreler ve piramidal hücrelerden oluşan belirgin bir trisinaptik devre oluşturur

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Fudan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (202109004S). Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar 6 aylık C57BL / 6J; Her iki cinsiyet de kullanıldı. Fareler, sabah 8'den akşam 8'e kadar 12 saatlik bir ışık döngüsünde tutuldu. Virüs enjeksiyonu için aşağıdaki koordinatları kullandık: A/P: -2.2 mm, M/L: 1.5 mm, D/V: beyin yüzeyinden 1.7 mm.

1. Dentat girusa virüs enjeksiyonu

1. Tek kullanımlık steril eldivenler ve önlükler de dahil olmak üzere koruyucu ekipman giyin.
2. Gerekli cerrahi aletleri, iki tüp 5 mL salin (% 0.9 NaCl [steril] veya yapay b....

Tartışmalar

Burada, farelerin DG'sinde in vivo kalsiyum görüntüleme için bir prosedür tanımladık. Bu protokolün, özellikle genetik olarak tanımlanmış bir alt popülasyonun ilgi çekici olduğu durumlarda, çeşitli bilişsel süreçlerde DG işlevlerini incelemeyi amaçlayan araştırmacılar için yararlı olacağına inanıyoruz. Burada, cerrahideki bazı önemli noktaları vurgulayarak protokolümüzün avantajlarını açıklıyoruz ve bu yöntemin sınırlamalarını tartışıyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 μL universal pipette tips	Transcat Pipettes	1030-260-000-9	For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips)	iSmile	20-0105	For removing the brain tissue
3D printed protective cap	N/A	N/A	To protect the GRIN Lens
75% ethanol	Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd	bwsj-230219105303	For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus	Brain Case	BC-0083	For viral injection
Adobe Illustrator	Adobe	cc 2018 version 22.1	To draw figures
Anesthesia air pump	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-30	For anesthesia
Camera control software	Daheng Imaging	Galaxy Windows SDK_CN (V2)	For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder)	RWD Life Science Co.,Ltd	68214	To hold the GRIN lens
Carprofen	MedChemExpress	53716-49-7	To reduce postoperative pain of the mouse
Coax Cable	Open ephys	CW8251	To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope	Olympus Life Science	FV3000	For observing the brain slices
Cotton swab	Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd	20202140438	For disinfection
Customized headplate	N/A	N/A	For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder	N/A	N/A	To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing)	New Centry Dental	430205	For attaching the miniscope
Depilatory cream	Veet	ASIN : B001DUUPQ0	For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M	RWD Life Science Co.,Ltd	68803	For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone	Huachu Co., Ltd.	N/A	To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope	RWD Life Science Co., Ltd	MZ62-WX	For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-31-6	For anesthesia
GRIN lens	GoFoton	CLHS100GFT003	For GRIN lens implantation
GRIN lens	InFocus Grin Corp	SIH-100-043-550-0D0-NC	For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)	RWD Life Science Co.,Ltd	V100	For anesthesia
Industrial camera	Daheng Imaging	MER-231-41U3M-L, VS-0618H1	For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant	Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd	8861F6DFC92A	For disinfection
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10	For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	For viral injection
MATLAB	MathWorks	R2021b	For analyzing the data
Microdrill	RWD Life Science Co.,Ltd	78001	For craniotomy
Micropipette puller	Narishige International USA	PC-100	For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	For viral injection
Miniscope DAQ Software	Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)	N/A	For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)	Open ephys	V3.3	To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4	Open ephys	V4	For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2)	Open ephys	Variant 2	For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-207	For viral injection
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.	H37022025	To keep the eyes moist
PCR tube	LabServ	309101009	For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad)	Lenovo	20W0-005UCD	To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel	Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd	NA-H115	For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	60902	To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	S2	For unscrew the set screws
Set screw	TBD	2-56 cone point set screw	For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co.,Ltd	R500	For anesthesia
Sterile syringe	Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD	20163140236	For rinse the blood
Surgical scissors	RWD Life Science Co.,Ltd	S14016-13	For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl.	RWD Life Science Co.,Ltd	69027	To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps	RWD Life Science Co.,Ltd	F11020-11	For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable	Open ephys	N/A	To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light	Jinshida	66105854002	To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive)	Loctite	32268	To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump	Kylin-Bell	GL-802B	To remove the blood, saline and the brain tissue