In Vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים

Summary

הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס מבצעת תפקידים חיוניים ומובחנים בלמידה ובזיכרון. פרוטוקול זה מתאר סדרה של הליכים חזקים ויעילים להדמיית סידן in vivo של תאי גרגירים בבליטה המשוננת בעכברים הנעים בחופשיות.

Abstract

גישות בזמן אמת נדרשות בדרך כלל במחקרים של למידה וזיכרון, והדמיית סידן in vivo מספקת את האפשרות לחקור פעילות עצבית אצל בעלי חיים ערים במהלך משימות התנהגות. מאחר שההיפוקמפוס קשור קשר הדוק עם זיכרון אפיזודי ומרחבי, הוא הפך לאזור חיוני במוח במחקר של תחום זה. במחקר שנערך לאחרונה, תאי אנגרמה ותאי מקום נחקרו על ידי רישום הפעילות העצבית באזור CA1 בהיפוקמפוס באמצעות מיקרוסקופ זעיר בעכברים תוך ביצוע משימות התנהגותיות כולל שדה פתוח ומסלול ליניארי. למרות שהבליטה המשוננת היא אזור חשוב נוסף בהיפוקמפוס, היא נחקרה רק לעתים רחוקות עם הדמיה in vivo בשל עומקה הגדול יותר וקושי ההדמיה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים בפירוט תהליך הדמיית סידן, כולל כיצד להזריק את הנגיף, להשתיל עדשת GRIN (Gradient-index) ולחבר לוחית בסיס להדמיית הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס. בהמשך אנו מתארים כיצד לעבד מראש את נתוני הדמיית הסידן באמצעות MATLAB. נוסף על כך, מחקרים על אזורים עמוקים אחרים במוח שדורשים הדמיה עשויים להפיק תועלת משיטה זו.

Introduction

מחקרים קודמים מצאו כי ההיפוקמפוס הוא מבנה מוחי חיוני לעיבוד ואחזור זיכרונות ^1,2. מאז שנות ה-50 של המאה ה-20, המעגלים העצביים של ההיפוקמפוס במכרסמים התמקדו בחקר היווצרות, אחסון ושליפה של זיכרון³. המבנים האנטומיים בתוך ההיפוקמפוס כוללים את תת-האזורים של בליטה משוננת (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 וסוביקולום⁴. קשרים דו-כיווניים מורכבים קיימים בין תת-אזורים אלה, מתוכם DG, CA1 ו-CA3 יוצרים מעגל טריסינפטי בולט המורכב מתאי גרגיר ותאים פירמידליים⁵. מעגל זה מקבל את הקלט העיקרי שלו מקליפת המוח האנטורינלית (EC) והיה מודל קלאסי לחקר פלסטיות סינפטית. מחקר in vivo קודם על תפקוד ההיפוקמפוס התרכז בעיקר ב- CA1 ^6,7 בשל הגישה הקלה יותר שלו. בעוד שתאי עצב מסוג CA1 ממלאים תפקידים חשובים ביצירת זיכרון, התגבשות ושליפה, במיוחד בתאי מקום לזיכרון מרחבי, תת-אזורים אחרים של ההיפוקמפוס חיוניים גם הם ^8,9. בפרט, מחקרים אחרונים הדגישו את הפונקציות של DG בהיווצרות זיכרון. תאי מקום ב-DG דווחו כיציבים יותר מאלה שב-CA1¹⁰, ופעילותם משקפת מידע ספציפי להקשר¹¹. יתר על כן, תיוג תלוי פעילות של תאי גרגיר DG יכול להיות מופעל מחדש כדי לגרום להתנהגויות הקשורות לזיכרון¹². לכן, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של קידוד המידע ב-DG, חיוני לחקור את הפעילויות של תת-אזור ה-DG בזמן שהחיה מבצעת משימות תלויות זיכרון.

מחקרים קודמים של פעילויות DG שימשו בעיקר אלקטרופיזיולוגיה vivo ¹³. עם זאת, טכניקה זו יש כמה חסרונות: ראשית, בהקלטות חשמליות, ייתכן שיהיה קשה לזהות ישירות את סוגי התאים השונים המייצרים את האות. האותות המוקלטים הם מתאים מעכבים ומעוררים. לכן, שיטות עיבוד נתונים נוספות נדרשות כדי להפריד בין שני סוגי תאים אלה. יתר על כן, קשה לשלב מידע אחר על סוג התא, כגון תת-קבוצות ספציפיות להקרנה או תיוג תלוי פעילות, עם הקלטות חשמליות. בנוסף, בשל המורפולוגיה האנטומית של DG, אלקטרודות ההקלטה מושתלות לעתים קרובות בכיוון אורתוגונלי, אשר מגביל מאוד את מספר הנוירונים שניתן להקליט. לכן, קשה להקלטות חשמליות להשיג ניטור של מאות נוירונים בודדים ממבנה DG באותה חיה¹⁴.

טכניקה משלימה לרישום פעילויות נוירונים ב- DG היא להשתמש ב- in vivo הדמיית סידן¹⁵. יוני סידן חיוניים לתהליכי איתות תאיים באורגניזמים, והם ממלאים תפקיד מכריע בתפקודים פיזיולוגיים רבים, במיוחד במערכת העצבים של יונקים. כאשר תאי עצב פעילים, ריכוז הסידן התוך-תאי עולה במהירות, מה שמשקף את האופי הדינמי של הפעילות העצבית והעברת האותות. לכן, רישום השינויים בזמן אמת ברמות הסידן התוך-תאי בתאי העצב מספק תובנות חשובות לגבי מנגנוני הקידוד העצביים.

טכנולוגיית דימות סידן משתמשת בצבעים פלואורסצנטיים מיוחדים או במדדי סידן מהונדסים גנטית (GECIs) כדי לנטר ריכוזי יוני סידן בנוירונים על ידי זיהוי שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות, אשר לאחר מכן ניתן ללכוד באמצעות הדמיה מיקרוסקופית¹⁶. בדרך כלל משתמשים במשפחת GCaMP של גנים לאינדיקטור סידן, הכוללת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), קלמודולין ורצפי פוליפפטיד M13. GCaMP יכול לפלוט פלואורסצנטיות ירוקה כאשר הוא נקשר ליוני סידן¹⁷, מה שמאפשר לתנודות בפלואורסצנטיות הירוקה להירשם באמצעות הדמיה¹⁸. בנוסף, כדי לקבל תמונות ברורות של אזור המטרה במוח, עדשת אינדקס הדרגתי (עדשת GRIN) מושתלת בדרך כלל מעל האזור המעניין. עדשת GRIN מאפשרת הדמיה של אזור עמוק במוח שלא ניתן לגשת אליו ישירות מפני השטח.

קל יחסית לשלב טכניקה זו עם כלים גנטיים אחרים כדי לתייג סוגי תאים שונים. יתר על כן, מכיוון שמישור ההדמיה מקביל להתמצאות התאים ב-DG, מאות תאי עצב נגישים לדימות בכל ניתוח מוצלח. בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקול ניתוח מלא ומפורט להדמיית סידן in vivo בבליטה המשוננת בעכברים (איור 1). ההליך כולל שתי פעולות עיקריות. הראשון הוא להזריק את וירוס AAV-CaMKIIα-GCaMP6f לתוך DG. הפעולה השנייה היא השתלת עדשת GRIN מעל אתר הזרקת הנגיף. שני הליכים אלה מתנהלים באותה ישיבה. לאחר ההחלמה מניתוחים אלה, השלב הבא הוא לבדוק את איכות ההדמיה באמצעות מיקרוסקופים ממוזערים (מיניסקופים). אם בשדה ההדמיה יש מאות תאים פעילים, ההליך הבא הוא לחבר את לוחית הבסיס של המינסקופ לגולגולת העכבר באמצעות מלט דנטלי; לאחר מכן ניתן להשתמש בעכבר לניסויי הדמיה. כמו כן, אנו מציגים צנרת עיבוד מקדים מבוססת MATLAB לייעול ניתוח נתוני הסידן שנאספו.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פודאן (202109004S). כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה היו C57BL/6J בני 6 חודשים; נעשה שימוש בשני המינים. עכברים הוחזקו במחזור אור של 12 שעות, מ-8 בבוקר עד 8 בערב. השתמשנו בקואורדינטות הבאות להזרקת וירוסים ב-DG: A/P: -2.2 מ"מ, M/L: 1.5 מ"מ, D/V: 1.7 מ"מ מפני השטח של המוח.

1. הזרקת וירוס לבליטה המשוננת

1. יש ללבוש ציוד מגן, כולל כפפות וחלוקים סטריליים לשימוש חד פעמי.
2. הכינו את כלי הניתוח הנדרשים, שני צינורות של 5 מ"ל מי מלח (0.9% NaCl [נוזלים סטריליים] או מלאכותיים של המוח השדרה) ושתי מחטים קהות 25 G luer lock.
   הערה: יש לעקר היטב את כל כלי הניתוח לפני הניתוח. השתמשנו autoclaving בטמפרטורה גבוהה (121-134 ° C) ולחץ (20 psi) כדי לעקר את כלי הניתוח. בנוסף, ריססנו את המשטחים בחומרי חיטוי על בסיס אלכוהול. בכל ההליכים הכירורגיים, השתמשנו בתמיסת מלח סטרילית 0.9%. מכשירים עוקרו לסירוגין במהלך הניתוח עם חרוזי זכוכית מחוממים.
3. הכינו תמיסת אקונומיקה 10% במים לחיטוי כל אספקה שעלולה לבוא במגע עם הנגיף.
4. לדלל את וירוס AAV-CaMKIIα-GCaMP6f במידת הצורך, באמצעות מלוחים מעוקרים, ולאחסן אותו במקרר 4 ° C או על קרח. היעד הסופי של הנגיף הוא 1 × 10¹² GC/mL.
   הערה: אנו ממליצים להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים של הנגיף כדי לשמור על שלמות הנגיף. לשם כך, אנו בדרך כלל aliquot את הנגיף כאשר הוא מתקבל מהיצרן לתוך כמויות קטנות (למשל, 2 μL לכל צינור) ולשמור אותם במקפיא -80 ° C. יש להשתמש בנגיף ביום ההפשרה ואין לאחסן אותו ב -4 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.
5. השתמשו במושך מיקרופיפטה כדי למשוך את המיקרופיפטה לקצה דק, חתכו חלק קטן מהקצה במספריים כירורגיים ומלאו את הצינור בשמן מינרלי. ודא שהפיפטה יכולה למצוץ נוזלים כרגיל ולאחר מכן, התקן אותה על המזרק.
   הערה: השתמשנו בשיטת משיכה חד שלבית כאשר המחמם מוגדר ב~ 60% מההספק המרבי. ניתן להשתמש במושכים אחרים לשלב זה. המטרה הכוללת היא להפוך את הקצה ~ 50-100 מיקרומטר בקוטר; קוטר קטן מדי ישפיע על זרימת הנוזל; עבה מדי עלול לגרום נזק לרקמת המוח של העכבר.
6. הפעל את כל המכשירים, כולל מכונת הרדמה לעכבר, מכונת תחזוקת טמפרטורה (כרית חימום) ומשאבת ואקום. בנוסף, למדוד את משקל הגוף של העכברים לפני הניתוח.
   הערה: במהלך ההליך, עקבנו אחר נשימת העכבר באופן חזותי ומדי פעם בדקנו את טמפרטורת הגוף כדי לוודא שהם במצב טוב.
7. הכניסו את העכבר לתא הגזים עם 2.5% איזופלורן ו-1 ליטר חמצן/דקה. עקוב אחר תנאי הנשימה של העכבר כדי לאמוד את מצב ההרדמה.
   הערה: קצב הנשימה צריך להיות בערך 1 נשימה / s כדי לשמור על העכבר במצב בריאותי טוב.
8. הוציאו את העכבר מתא הגזים והניחו אותו על המנגנון הסטריאוטקסי.
9. ודא שהעכבר מורדם כראוי לפני תחילת הפעולה הבאה. בדוק את רפלקס משיכת הדוושה על ידי צביטת כריות כף הרגל של שתי כפות הרגליים האחוריות. אם העכבר מגיב לצביטה של כרית כף הרגל, יש לבצע הרדמה נוספת ולבדוק שוב את הרפלקס לפני שתמשיך.
10. כסו את אף העכבר במסכה וקבעו את קצב זרימת האיזופלורן ל -1.5%. קבע את ראש העכבר בחוזקה באמצעות מוטות אוזניים (איור 2A).
    הערה: היזהר לא לתקן את מוטות האוזניים חזק מדי על העכבר שכן זה יכול בקלות להשפיע על הנשימה של העכבר ובמקרים מסוימים, לגרום למוות.
11. חתוך את החלק העליון של ראשו של העכבר עם מספריים כירורגיים, והשתמש בקרם depilatory כדי להסיר את שאריות השיער עד שהעור נחשף לחלוטין. החל את קרם depilatory על הקרקפת של העכבר, לתת לו לשבת במשך כ 5 דקות, ולהשתמש גזה לנגב את הקרם.
12. החל משחה אופתלמית על העיניים של העכבר.
13. יש לחטא את האזור חסר השיער בחומר חיטוי יודופור ואתנול 75% באמצעות צמר גפן.
14. בצעו חתך רציף לאורך קו האמצע של הקרקפת באמצעות מספריים כירורגיים (או להב אזמל), וחתכו חלק מהקרקפת כדי לחשוף את פני הגולגולת (איור 2B). לשטוף את פני השטח של הגולגולת עם מלוחים; לאחר מכן, הסירו את הפאשיה ואת עודף המלח באמצעות משאבת ואקום. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד שהאזור סביב הפצע מפסיק לדמם. נגבו את פני הגולגולת במקלוני צמר גפן כדי לשמור עליה יבשה.
    הערה: ישנן דרכים אחרות להסיר את הפאשיה, כגון ניגוב שלה עם כדור צמר גפן או צמר גפן.
15. השתמש במחט האיתור כדי להתאים את משטח הגולגולת כאשר הברגמה והלמבדה גלויים. בצע מספר התאמות עד שכל הראש מפולס (השגיאה כולה בכיוון ציר Z קטנה מ- 0.05 מ"מ).
16. הזיזו את קצה המחט מהברגמה למיקום היעד המתאים. עבור קואורדינטות היעד, השתמש בברגמה כנקודת התייחסות. סמן את ארבע הנקודות כדי להגדיר את היקף אתר הזרקת הנגיף: A/P: -2.0 מ"מ, M/L: -1.5 מ"מ; A/P: -2.5 מ"מ, M/L: -1.5 מ"מ; A/P -2.25 מ"מ, M/L: -1.0 מ"מ; ו- A/P -2.25 מ"מ, M/L: -2.0 מ"מ, עם סמן מחיק.
    הערה: פרוטוקול זה מבצע את הזרקת הנגיף ואת השתלת עדשת GRIN באותו ניתוח. בפרוטוקול זה, כל הניתוחים בוצעו בהמיספרה הימנית, אך ניתן להעלות על הדעת שניתן להשתמש בכל אחת משתי ההמיספרות. בתוך אזור ההזרקה המוגדר על ידי ארבע הנקודות שהוזכרו לעיל, הזריקו את הנגיף בשלוש מנות נפרדות של 80 nL במקומות שונים. למרות ששלושת המקומות נבחרו באופן שרירותי, אנו ממליצים לפזר אותם כדי להפיץ טוב יותר את הנגיף. זה יגדיל את מספר התאים הנגועים.
17. הפוך את craniotomy באזור עם microdrill ולהגדיר אלה ארבע נקודות כמו הגבול. הפסיקו לקדוח כאשר רקמת המוח נראית לעין (איור 2C).
    הערה: נסה לקדוח את הגולגולת לאט. המקדח עלול לפגוע ברקמת המוח עקב כוח מוגזם. קידוח איטי יכול גם למנוע התחממות יתר של המוח.
18. הסירו את שאריות העצם והדורה באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד ושטפו כל הזמן את האזור במי מלח סטריליים.
    הערה: זה נורמלי עבור כמות קטנה של דימום להתרחש במהלך שלב זה, כמו כמה נימים לקרוע; פשוט המשיכו לשטוף במי מלח עד שלא יהיה יותר דימום.
19. השתמש בלוח הבקרה של המזרק כדי להוציא קצת שמן מינרלי כדי ליצור את השטח הנדרש עבור הטעינה הבאה של הנגיף. מלאו את המיקרופיפטה בלפחות 240 nL של הנגיף המדולל במהירות של 100 nL/s.
    הערה: יש לפרוק בועות אוויר בצינור באמצעות לוח הבקרה כדי להבטיח שהמיקרופיפטה מפיצה את כמות הנוזלים המתאימה. אם נפח הנוזל עדיין אינו מדויק לאחר מספר ניסיונות, שקול לכבות את המיקרופיפטה ולהתחיל מחדש. אנו ממליצים לשאוף וירוס נוסף מעבר לנפח ההזרקה בפועל; גישה זו מונעת הזרקה לא מכוונת של שמן מינרלי למוח העכבר.
20. העבר את micropipette מעל אזור craniotomy; לאחר מכן, העבירו אותו באיטיות לתוך רקמת המוח לציר Z הממוקד של D/V: 1.70 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח.
    הערה: אטלס הפניות רבות משתמש במשטח הגולגולת כ- D/V 0. מניסיוננו, השימוש בקואורדינטות מפני השטח של המוח הניב מיקוד אמין יותר עבור DG.
21. השתמשו בלוח הבקרה כדי להגדיר את המזרק להזריק 80 nL של הנגיף בקצב זרימה של 1 nL/s (איור 2D). לחץ על הלחצן INJECT בלוח הבקרה כדי להזריק את הנגיף. לאחר מכן, בחר שתי עמדות אחרות בתוך craniotomy ולחזור על הפעולה הקודמת.
    הערה: כל זריקה אורכת ~2 דקות. לאחר סיום הזריקה, המתן 8-10 דקות נוספות לפני שתעבור למצב אחר. כאשר הדימום מתרחש במהלך ההסרה, לשטוף מיד עם מלוחים.
22. הוציאו את המיקרופיפטה מהמוח באיטיות (איור 2E).

2. השתלת עדשת GRIN בבליטה המשוננת

הערה: בצע שלב זה מיד לאחר השלמת ההזרקה הנגיפית של 240 nL.

1. יש לחטא את עדשת GRIN בקוטר 1 מ"מ באתנול 75% למשך 20 דקות; שטפו אותו כראוי במי מלח לפני ההשתלה.
2. הרחיבו את הקרניוטומיה באמצעות המיקרו-מקדחה כדי להגדיל את הפתח בכיוון ה-A/P לכ-1 מ"מ בערך. נקו את הלכלוך עם מי מלח.
3. הדקו את עדשת GRIN למקומה עם מחזיק והקפידו לחשוף אורך מתאים.
   הערה: קל להדביק את המחזיק לעדשת GRIN בעת קיבוע על הגולגולת באמצעות שרף UV בשלבים הבאים. עם זאת, ניתן להימנע מכך אם אורך העדשה החשוף מספיק.
4. השתמש במחזיק כדי להזיז את עדשת GRIN מעל אזור הקרניוטומיה. הגדר את מיקום ציר Z לאפס כאשר החלק התחתון של עדשת GRIN נוגע בפני השטח של רקמת המוח. לאחר מכן, הסירו את מחזיק עדשת GRIN והניחו אותו בצד.
5. חבר את המחט הקהה של נעילת הלואר 25 G לצינור היניקה של משאבת הוואקום וכוונן את הלחץ ל- 0.04 MPa.
   הערה: אם שלב זה מבוצע בפעם הראשונה, ניתן להפחית את הלחץ כראוי כדי לשאוף לאט את רקמת המוח.
6. יש לשאוב את רקמת המוח על ידי סיבוב קצה המחט הקהה קרוב מעל רקמת המוח וללחוץ בעדינות על רקמת המוח כדי להקל על השאיפה. יש לשטוף במי מלח (לאחסן בטמפרטורה של 4°C) ברציפות במהלך היניקה כדי לשמור על תצוגה ברורה של המוח. התבונן בתכונות הרקמה מקרוב כדי לעקוב אחר עומק השאיפה: רקמת קליפת המוח היא ורודה חיוורת, כפיס המוח שמתחתיה מופיע כרקמה לבנה סיבית, ושכבת CA1 בהיפוקמפוס היא אדומה כהה ואפורה. עצרו את היניקה כאשר פני השטח של הרקמה נעשים חלקים ושטח גדול של CA1 נחשף (איור 3).
   הערה: שלב זה הוא קריטי להצלחת ההליך כולו ולעתים קרובות הוא החלק הקשה ביותר. סיפקנו רשימה של בעיות נפוצות כדי לעזור לקוראים לפתור שלב זה (טבלה 1). יתר על כן, אנו ממליצים לשטוף את הפצע ברציפות עם מלוחים קרים, שכן זה יכול להפחית את הדימום במידה מסוימת.
   1. אם המחט נסתמת; מחברים את המחט החסומה למזרק ושוטפים את החסימה. נסה לשנות את המחט אם זה לא עובד.
   2. אם הדימום קבוע, הוא יכול לחסום את הנוף של רקמת המוח. אם זה קורה, לחכות הדם להיקרש, ולאחר מכן לשטוף אותו עם מלוחים.
7. הזז את המחזיק מעל החור שנקדח. הגדר את ציר Z ל- 0 כאשר עדשת GRIN באה במגע עם פני השטח של רקמת המוח. אם עדשת GRIN חורגת מקוטר החור, השתמש במיקרו-מקדחה כדי להרחיב את החור. לאחר מכן, חזור על הליך זה.
8. הכנס את עדשת GRIN לחור ב- D/V: -1.32 מ"מ. תן למחזיק לעמוד במשך 5-10 דקות. לאחר הרמת המחזיק, שוטפים את החור במי מלח. חזור על שלב זה 3x (איור 4A).
   הערה: זה נורמלי שרקמת המוח מדממת במהלך שלב זה. לאחר שטיפות מלח חוזרות ונשנות, לא אמור להיות יותר דם בחור. איכות ההדמיה מושפעת מאוד משלב זה, ואם הדם אינו מנוקה הוא עלול לגרום לשדה ההדמיה להיות שחור.
9. השתמש במי מלח כדי לנקות את הגולגולת ביסודיות ולאחר מכן תן לגולגולת להתייבש לפני החלת שרף UV.
10. השתמש במחט כדי להחיל את שרף UV סביב עדשת GRIN. האר את האזור הזה באור על-סגול במשך 15 שניות וודא שהשרף העל-סגול הופך למוצק (איור 4B).
    הערה: יש למרוח את שרף ה-UV מעט בכל פעם ולחזור על פעולה זו מספר פעמים עד לכיסוי האזור סביב עדשת GRIN. היזהר לא להצמיד את עדשת GRIN למחזיק בעת שימוש באור UV להארה.
11. הסירו את המחזיק מעדשת GRIN בזהירות. כסו את כל הגולגולת החשופה בשרף UV והניחו את לוחית הראש על הגולגולת במיקום המתאים. האר את כל הגולגולת ואת לוחית הראש באור UV למשך 15 שניות (איור 4C).
    הערה: לוחית הראש היא רכיב להחזקת ראש העכבר בבטחה במקומו בעת חיבור לוח הבסיס (ראה קובץ משלים 1 עבור העיצוב). אבטח את לוחית הראש בחוזקה ככל האפשר; לוחית ראש מנותקת תגרום לכישלון הניתוח כולו. מניסיוננו, יישום יסודי של שרף UV צריך להיות מסוגל לספק חיבור מוצק. אם נדרש חיבור חזק יותר, ניתן לשקול התקנת ברגי גולגולת.
12. כסו את עדשת GRIN החשופה במכסה מגן מודפס בתלת-ממד (ראו קובץ משלים 2 לעיצוב). קבע את המכסה ללוחית הראש באמצעות ברגי M1.6 (איור 4D).
13. יש להזריק dexamethasone intraperitoneally (מומס ב 0.9% מלוחים, 2 מ"ג / ק"ג) לאחר הניתוח כדי למנוע דלקת לאחר הניתוח. בנוסף, לתת זריקות תת עוריות של carprofen (מומס ב 0.9% מלוחים, 5 מ"ג / ק"ג) כדי להפחית את הכאב לאחר הניתוח.
14. החזירו את העכברים לכלוב והעבירו אותם לשמיכה תרמית כדי להקל על החלמתם. לאחר מכן, העבירו את העכברים לבית החיות הניסיוני לאחר שיוכלו לנוע בחופשיות.
    הערה: כדי למנוע נזק ללוחית הבסיס על ידי לחימה, עכברים שעברו את הניתוח עשויים להיות משוכנים בנפרד או עם מספר מינימלי של חיים משותפים. מומלץ לא לחרוג משלושה עכברים בכלוב לאחר הניתוח.
15. יש לחטא את משטחי העבודה באמצעות תמיסת אקונומיקה 10%. הסר ציוד מגן אישי חד פעמי (PPE) והשלך אותו לשקיות סיכון ביולוגי.
16. יש לעקוב אחר העכברים מדי יום במשך 3 ימים לאחר הניתוח. רשמו את משקל גופם של עכברים והתבוננו במצב ריפוי הפצעים שלהם ובפעילויות התנועה שלהם. לספק זריקות intraperitoneal יומי של dexamethasone ו carprofen פתרונות (אותו מינון כמו בשלב 2.13) במשך 3 ימים. לספק צ'או לח או טיפול כדי להקל על ההתאוששות בעת הצורך.

3. בדוק את איכות שדה ההדמיה

הערה: העכבר מתאושש תוך 2-3 שבועות לאחר הניתוח לפני פגישת ההדמיה הראשונה של סידן in vivo . מטרת שלב זה היא לבדוק את איכות הניתוח ואת החלמתו של העכבר. אם ניתן להבחין בפעילות של תא בודד בשדה ההדמיה והעכבר במצב טוב, הצמידו את לוחית הבסיס לגולגולת העכבר. יש להרדים את העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם אם איכות ההדמיה או המצב הבריאותי אינם מספיקים.

1. חבר את תיבת איסוף הנתונים של המיניסקופ למחשב באמצעות כבל USB 3.0. לאחר מכן חבר את כבל הקואקס לתיבה באמצעות מחבר To Scope (SMA).
2. הפעל את תוכנת בקרת המיניסקופ. בתוכנה, לחץ על בחר Config File | קבצי תצורת משתמש V4 פלוס כדי להציג את התמונות החיות.
3. השתמש במחזיק מותאם אישית כדי לשמור את העכבר על גלגל הריצה על-ידי הידוק לוחית הראש. החזק את המיניסקופ עם מחזיק המיניסקופ (עשוי מהדפסה תלת-ממדית; ראה קובץ משלים 3 לעיצוב), והשתמש במכשיר סטריאוטקסי כדי להזיז את המיניסקופ מעל ראש העכבר (איור 4E).
4. הסירו את המכסה בעזרת מברג. נגבו בעדינות את פני השטח של עדשת GRIN עם 75% אתנול. מקם את המיניסקופ ממש מעל עדשת GRIN החשופה והפוך את המשטח התחתון של ההיקף למקביל לפני השטח של העדשה. מצא את מישור המוקד הטוב ביותר על-ידי הורדה איטית של המיניסקופ לכיוון עדשת GRIN.
   הערה: הגדר את מישור המוקד על 0 ולאחר מכן התאם את מיקום המיניסקופ; זה מספק יותר מקום לכוונון המיקוד. בחר את מישור המוקד עם תצוגה חזותית ברורה של מספר התאים הגדול ביותר.
5. בתוכנת הבקרה של המיניסקופ, התאם את עוצמת תאורת ה- LED לרמה האופטימלית.
   הערה: כדי לצפות בפעילות של תא בודד, שדה ההדמיה לא צריך להיות חשוף יתר על המידה או כהה מדי. עוצמת ה-LED היא בדרך כלל בתוך 10%.
6. אם זרימת הדם בכלי הדם נראית לעין והתאים רבים ומפוזרים באופן אחיד בכל שדה ההדמיה, המשך לחלק הבא של הניסוי.
   הערה: בשלב זה, חשוב להיות מסוגל לצפות בפעילות תא יחיד. זה יכול להשפיע על התוצאות של ניתוח הנתונים. בדרך כלל, קשה לפרש פעילויות אזוריות (כתמים של תנודות פלואורסצנטיות). זה עשוי להיות אינדיקציה לכך שנוירוני המטרה אינם ממוקדים בעדשת GRIN. העכבר לא ישמש בניסויים הבאים אם נראה ששדה ההדמיה שחור, התאים מפגינים פעילות אזורית, או שאין מספיק תאים.
7. נתק את הכבל מהמיניסקוף.

4. חברו את לוחית הבסיס של המיניסקופ לגולגולת העכבר

1. חבר את לוח הבסיס למיניסקופ, והתאם מחדש את מיקומי המיניסקופ כדי לקבל שדה ראייה באיכות הדמיה טובה.
2. מערבבים את חומרי הבסיס של התותבות בקערת הערבוב.
   הערה: חשוב שהתערובת לא תזרום בחופשיות רבה מדי ולא תהיה יציבה מדי. יותר מדי נזילות נוטה לכסות את פני השטח של עדשת GRIN וגורמת לאובדן שדה ההדמיה. אם הם יציבים מדי, חומרי הבסיס של התותבות לא יוכלו לכסות בחוזקה את המרווח בין לוחית הבסיס ללוחית הראש.
3. יש להקפיד שלא לשנות את מיקום המיניסקופ בעת יישום השכבה הראשונה של חומרי בסיס תותבים סביב לוח הבסיס של המיניסקוף. המתינו עד ששכבת המלט הראשונה תתקשה לפני החלת שכבת מלט שנייה מצלחת הבסיס על לוחית הראש. לאחר התקשות כל חומרי הבסיס של התותבות, שחררו את בורג הסט ונתקו את המיניסקופ מלוח הבסיס.
   הערה: בעת שימוש בחומרי בסיס תותבות, שים לב לשדה ההדמיה בתוכנה ובצע את כל ההתאמות הדרושות לפני שהמלט מתמצק.
4. הסר את הזרוע האוחזת מהמיניסקופה בעדינות.
5. הכניסו את מכסה לוחית הבסיס ללוח הבסיס כדי להגן על עדשת GRIN החשופה והדקו את בורג הסט (איור 4F).
6. החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו. תן לעכבר כמה ימים להתאושש לפני ביצוע הניסויים ההתנהגותיים.

5. רכישת נתונים

הערה: ניתן לבצע הדמיית סידן In vivo במקביל לכל בדיקת התנהגות. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במסלול הליניארי כדוגמה. אורכו של מסלול ליניארי זה הוא 1.5 מטרים ובשני קצותיו יש מים, המשמשים כפרס לעכברים. העכברים יכולים ללבוש מיקרוסקופ מיניאטורי (מיניסקופ) ולרוץ קדימה ואחורה לאורך המסלול במשך 20 דקות. במהלך תקופה זו, העכברים מסוגלים בדרך כלל להריץ ~ 60 ניסויים.

1. חבר את תיבת איסוף הנתונים של המיניסקופ למחשב באמצעות כבל USB 3.0. לאחר מכן חבר את כבל הקואקס לתיבה באמצעות מחבר To Scope (SMA).
2. הפעל את תוכנת בקרת המיניסקופ. בתוכנת בקרת מיניסקופ, לחץ על בחר קובץ תצורה | קבצי תצורת משתמש V4 פלוס כדי להציג את התמונות החיות.
3. חבר את המצלמה התעשייתית למחשב באמצעות כבל USB 3.0.
4. הפעל את תוכנת בקרת המצלמה. בתוכנה, לחץ על פתח ציוד ובחר את הקובץ לייבוא הפרמטרים של איסוף הנתונים. בחר את פורמט הווידאו כוידאו לא דחוס במיכל AVI. לחץ על לחצן התחל כדי להציג את התמונות החיות.
   הערה: כדי להקטין את גודל הקובץ של סרטון ההקלטה ההתנהגותי, שדה הראייה אמור לא לכלול אזורים מיותרים מחוץ למסלול.
5. השתמש במחזיק מותאם אישית כדי לשמור את העכבר על גלגל הריצה על-ידי הידוק לוחית הראש.
6. שחררו את בורג הסט בעזרת מברג, הסירו את מכסה צלחת הבסיס ונקו את פני השטח של עדשת GRIN עם 75% אתנול.
7. הרכיבו את המיניסקופ לבסיסו. הדקו את המיניסקופ לבסיסו על ראש העכבר.
8. מצא את מישור המוקד הטוב ביותר על-ידי החלקת לחצן מישור המוקד.
9. העבר את העכבר מגלגל הריצה למסלול הליניארי בעדינות.
10. לחץ והחזק את תקליט כפתור כדי להתחיל להקליט עם המיניסקופ. לאחר מכן, לחץ על התחל לאסוף כפתור כדי להתחיל את הקלטת המצלמה. שיא ל-20 דקות.
11. שמור בנפרד נתוני הדמיית סידן in vivo , נתוני התנהגות ונתוני Arduino. תן לקבצים אלה שם עם תאריך, מספר הפעלה ומספר עכבר.
    הערה: מחקרים המשתמשים במיניסקופ נוטים להיות בעלי תקופת איסוף נתונים ארוכת טווח על חיית ניסוי יחידה. מתן שמות ברור לקבצים יכול לסייע בהליך עיבוד הנתונים.
12. נתק את המיניסקופ מבסיסו.
13. סגור את תוכנת בקרת המצלמה, את תוכנת בקרת המיניסקופ ואת המחשב.
14. נתק את כבל הקואקסיאלי מ-To Scope (SMA) ואת כבל ה-USB 3.0 מהמצלמה.
15. שחררו את בורג הסט בבסיס, החזירו את מכסה צלחת הבסיס והדקו את הבורג.
16. החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.

6. עיבוד נתונים

1. טען את נתוני הדמיית הסידן המוקלטים ב- MATLAB.
   הערה: אנו מכירים בכך שיש להתאים את ניתוח הנתונים לתכנון הניסוי. כאן אנו מספקים צינור עיבוד מקדים הממיר את סרטון הדמיית הסידן הגולמי לעקבות פעילות מתאים בודדים. אנו מאמינים כי הליך זה הוא אוניברסלי יחסית ושימושי עבור המשתמשים. ניתן למצוא את כל הסקריפטים המתוארים בסעיף זה בקובץ משלים 4.
2. המר את נתוני ההדמיה מתבנית AVI לתבנית HDF5 ( .h5).
   הערה: הפלט הגולמי של המיניסקופ מייצר קבצי AVI עם דחיסה. הקבצים הלא דחוסים הם בדרך כלל בגודל של עשרות ג'יגה-בתים. פורמט הקובץ HDF5 מאפשר גישה וירטואלית וחלקית שניתן לדמיין ולתפעל בקלות לניתוח הבא.
3. החל את תיקון התנועה הלא קשיח (NoRMCorre)¹⁹.
4. דגום לאחור את הסרט המתוקן בתנועה למקרה שזיכרון ה-RAM של המחשב מוגבל לשלבים מאוחרים יותר.
   הערה: הנתונים המקוריים שנאספו על-ידי miniscope הם בגודל של 600 x 600. על ידי שימוש בדגימה למטה מרחבית, אנו יכולים להקטין את גודל הווידאו ל 200 x 200. שיטה זו מפחיתה באופן משמעותי את דרישות אחסון הנתונים ומאפשרת עיבוד נתונים מהיר יותר.
5. החל את EXTRACT על הנתונים שנדגמו למטה כדי לזהות אותות של תא בודד, בהתאם להוראות עבור קוד EXTRACT במאגר המקוון²⁰ (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public).

תוצאות

איור 1 מראה את הסכמות של הליך הניסוי, כולל הזרקת וירוסים, השתלת עדשת GRIN, הצמדת לוחית בסיס, הדמיית סידן in vivo באמצעות מיניסקופ ועיבוד נתונים. בדרך כלל, ההליך כולו לוקח חודש אחד. איור 2 מציג הליכים לדוגמה של הזרקת וירוסים, כולל מיקום החור שנקדח על הגולגולת ומ?...

Discussion

כאן תיארנו הליך להדמיית סידן in vivo ב- DG של עכברים. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים השואפים לחקור תפקודי DG בתהליכים קוגניטיביים שונים, במיוחד במקרים בהם תת-אוכלוסייה מזוהה גנטית מעניינת. כאן נסביר את יתרונות הפרוטוקול שלנו, תוך שימת דגש על כמה נקודות מרכזיות בניתוח, ונ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 μL universal pipette tips	Transcat Pipettes	1030-260-000-9	For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips)	iSmile	20-0105	For removing the brain tissue
3D printed protective cap	N/A	N/A	To protect the GRIN Lens
75% ethanol	Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd	bwsj-230219105303	For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus	Brain Case	BC-0083	For viral injection
Adobe Illustrator	Adobe	cc 2018 version 22.1	To draw figures
Anesthesia air pump	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-30	For anesthesia
Camera control software	Daheng Imaging	Galaxy Windows SDK_CN (V2)	For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder)	RWD Life Science Co.,Ltd	68214	To hold the GRIN lens
Carprofen	MedChemExpress	53716-49-7	To reduce postoperative pain of the mouse
Coax Cable	Open ephys	CW8251	To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope	Olympus Life Science	FV3000	For observing the brain slices
Cotton swab	Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd	20202140438	For disinfection
Customized headplate	N/A	N/A	For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder	N/A	N/A	To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing)	New Centry Dental	430205	For attaching the miniscope
Depilatory cream	Veet	ASIN : B001DUUPQ0	For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M	RWD Life Science Co.,Ltd	68803	For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone	Huachu Co., Ltd.	N/A	To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope	RWD Life Science Co., Ltd	MZ62-WX	For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-31-6	For anesthesia
GRIN lens	GoFoton	CLHS100GFT003	For GRIN lens implantation
GRIN lens	InFocus Grin Corp	SIH-100-043-550-0D0-NC	For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)	RWD Life Science Co.,Ltd	V100	For anesthesia
Industrial camera	Daheng Imaging	MER-231-41U3M-L, VS-0618H1	For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant	Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd	8861F6DFC92A	For disinfection
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10	For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	For viral injection
MATLAB	MathWorks	R2021b	For analyzing the data
Microdrill	RWD Life Science Co.,Ltd	78001	For craniotomy
Micropipette puller	Narishige International USA	PC-100	For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	For viral injection
Miniscope DAQ Software	Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)	N/A	For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)	Open ephys	V3.3	To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4	Open ephys	V4	For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2)	Open ephys	Variant 2	For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-207	For viral injection
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.	H37022025	To keep the eyes moist
PCR tube	LabServ	309101009	For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad)	Lenovo	20W0-005UCD	To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel	Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd	NA-H115	For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	60902	To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	S2	For unscrew the set screws
Set screw	TBD	2-56 cone point set screw	For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co.,Ltd	R500	For anesthesia
Sterile syringe	Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD	20163140236	For rinse the blood
Surgical scissors	RWD Life Science Co.,Ltd	S14016-13	For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl.	RWD Life Science Co.,Ltd	69027	To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps	RWD Life Science Co.,Ltd	F11020-11	For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable	Open ephys	N/A	To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light	Jinshida	66105854002	To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive)	Loctite	32268	To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump	Kylin-Bell	GL-802B	To remove the blood, saline and the brain tissue