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In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징)
요약
해마의 치상이랑(dentate gyrus)은 학습과 기억에서 필수적이고 뚜렷한 기능을 수행합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스의 치상이랑에 있는 과립 세포의 생체 내 칼슘 이미징을 위한 일련의 강력하고 효율적인 절차를 설명합니다.
초록
실시간 접근 방식은 일반적으로 학습 및 기억 연구에 필요하며, 생체 내 칼슘 이미징은 행동 작업 중 깨어 있는 동물의 신경 활동을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 해마는 일화 및 공간 기억과 밀접하게 관련되어 있기 때문에 이 분야의 연구에서 필수적인 뇌 영역이 되었습니다. 최근 연구에서는 생쥐에서 소형 현미경을 사용하여 해마 CA1 영역의 신경 활동을 기록하여 개방 필드 및 선형 트랙을 포함한 행동 작업을 수행하는 방법을 연구했습니다. 치상이랑은 해마의 또 다른 중요한 영역이지만, 깊이가 깊고 이미징이 어렵기 때문에 생체 내 이미징으로 연구된 적은 거의 없습니다. 이 프로토콜에서는 바이러스를 주입하는 방법, GRIN(Gradient-index) 렌즈를 이식하는 방법, 해마의 치상이랑을 이미징하기 위한 베이스 플레이트를 부착하는 방법을 포함한 칼슘 이미징 과정을 자세히 제시합니다. 또한 MATLAB을 사용하여 칼슘 이미징 데이터를 전처리하는 방법을 설명합니다. 또한 이미징이 필요한 다른 뇌 심부 영역에 대한 연구에도 이 방법이 도움이 될 수 있습니다.
서문
이전 연구에 따르면 해마는 기억을 처리하고 검색하는 데 필수적인 뇌 구조입니다 1,2. 1950년대 이래로 설치류의 해마의 신경회로는 기억 형성, 저장 및 회수를 연구하는 데 초점이 되어 왔다3. 해마 내의 해부학적 구조에는 치상이랑(DG), CA1, CA2, CA3, CA4 및 subiculum4의 하위 영역이 포함됩니다. 이러한 하위 영역들 사이에는 복잡한 양방향 연결이 존재하며, 그 중 DG, CA1 및 CA3는 과립 세포와 피라미드 세포로 구성된 두드러진 삼시냅스 회로를 형성합니다5. 이 회로는 내측 피질(entorhinal cortex, EC)로부터 주요 입력을 받으며 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 연구하기 위한 고전적인 모델이었습니다. 이전의 생체 내 연구는 해마 기능에 대한 연구가 대부분 CA1 6,7에 집중되어 있었는데, 이는 접근이 용이하기 때문입니다. CA1 뉴런은 기억 형성, 통합 및 검색, 특히 공....
프로토콜
모든 동물 시술은 Fudan University의 Institutional Animal Care and Use Committee(202109004S)의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 모든 동물은 6개월 된 C57BL/6J였습니다. 남녀 모두가 사용되었다. 생쥐는 오전 8시부터 오후 8시까지 12시간 조명 주기로 유지되었습니다. DG에서 바이러스 주입을 위해 A/P: -2.2mm, M/L: 1.5mm, D/V: 뇌 표면에서 1.7mm 좌표를 사용했습니다.
1. 치상이랑에 바이러스 주입
- 일회용 멸균 장갑과 가운을 포함한 보호 장비를 착용하십시오.
- 필요한 수술 기구, 5mL의 식염수(0.9% NaCl[멸균] 또는 인공 뇌척수액) 튜브 2개, 25G 루어 락 뭉툭한 바늘 2개를 준비합니다.
알림: 모든 수술 기구는 수술 전에 철저히 멸균해야 합니다. 우리는 수술 기구를 멸균하기 위해 고온(121-134 °C) 및 압력(20 psi)에서 고압멸균을 사용했습니다. 또한 표면에 알코올 성분의 소독제를 뿌렸습니다. 모든 수술 과정에서 0.9% 멸균 식염수를 사용했습니다. 수술 중에는 가열된 유리 구슬로 기구를 간헐적으로 멸균했습니다. - 바이러스와 접촉할 수 있는 ....
대표적 결과
그림 1 은 바이러스 주입, GRIN 렌즈 주입, 베이스 플레이트 부착, 미니스코프를 통한 생체 내 칼슘 이미징 및 데이터 처리를 포함한 실험 절차의 개략도를 보여줍니다. 일반적으로 전체 절차는 1개월이 소요됩니다. 그림 2 는 두개골에 뚫린 구멍의 위치와 GRIN 렌즈 이식 전 뇌 조직의 상태를 포함한 바이러스 주입 절차의 예를 보여줍니다.
토론
여기서 우리는 마우스의 DG에서 생체 내 칼슘 이미징 절차를 설명했습니다. 우리는 이 프로토콜이 다양한 인지 과정에서 DG 기능을 연구하려는 연구자, 특히 유전적으로 식별된 하위 집단에 관심이 있는 경우에 유용할 것이라고 믿습니다. 여기에서는 수술의 몇 가지 핵심 사항을 강조하여 프로토콜의 장점을 설명하고 이 방법의 한계에 대해 논의합니다.
우리는 사용 가?.......
공개
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.
감사의 말
이 연구는 상하이 기초 연구를 위한 파일럿 프로그램(Shanghai Pilot Program for Basic Research) - 푸단대학교 21TQ1400100(22TQ019), 상하이시 과학기술 주요 프로젝트, 린강 연구소(Lingang Laboratory, 보조금 번호)의 지원을 받습니다. LG-QS-202203-09) 및 중국국가자연과학재단(32371036).
....자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 μL universal pipette tips | Transcat Pipettes | 1030-260-000-9 | For removing the blood and saline |
| 25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips) | iSmile | 20-0105 | For removing the brain tissue |
| 3D printed protective cap | N/A | N/A | To protect the GRIN Lens |
| 75% ethanol | Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd | bwsj-230219105303 | For disinfection and cleaning the GRIN lens surface |
| AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus | Brain Case | BC-0083 | For viral injection |
| Adobe Illustrator | Adobe | cc 2018 version 22.1 | To draw figures |
| Anesthesia air pump | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-30 | For anesthesia |
| Camera control software | Daheng Imaging | Galaxy Windows SDK_CN (V2) | For recording the behavioral data |
| Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder) | RWD Life Science Co.,Ltd | 68214 | To hold the GRIN lens |
| Carprofen | MedChemExpress | 53716-49-7 | To reduce postoperative pain of the mouse |
| Coax Cable | Open ephys | CW8251 | To connect the miniscope and the miniscope DAQ box |
| Confocal microscope | Olympus Life Science | FV3000 | For observing the brain slices |
| Cotton swab | Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd | 20202140438 | For disinfection |
| Customized headplate | N/A | N/A | For holding the mouse on the running wheel |
| Customized headplate holder | N/A | N/A | To hold the headplate of the mouse |
| Denture base matierlals (self-curing) | New Centry Dental | 430205 | For attaching the miniscope |
| Depilatory cream | Veet | ASIN : B001DUUPQ0 | For removing the hair of the mouse |
| Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M | RWD Life Science Co.,Ltd | 68803 | For viral injection and GRIN lens implantation |
| Dexamethasone | Huachu Co., Ltd. | N/A | To prevent postoperative inflammation of the mouse |
| Dissecting microscope | RWD Life Science Co., Ltd | MZ62-WX | For observing the conditions during surgeries |
| Gas filter canister, large, packge of 6 | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-31-6 | For anesthesia |
| GRIN lens | GoFoton | CLHS100GFT003 | For GRIN lens implantation |
| GRIN lens | InFocus Grin Corp | SIH-100-043-550-0D0-NC | For GRIN lens implantation |
| Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm) | RWD Life Science Co.,Ltd | V100 | For anesthesia |
| Industrial camera | Daheng Imaging | MER-231-41U3M-L, VS-0618H1 | For acquiring the behavioral data |
| Iodophor disinfectant | Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd | 8861F6DFC92A | For disinfection |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22-10 | For anesthesia |
| Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | For viral injection |
| MATLAB | MathWorks | R2021b | For analyzing the data |
| Microdrill | RWD Life Science Co.,Ltd | 78001 | For craniotomy |
| Micropipette puller | Narishige International USA | PC-100 | For pulling the liquid sample collection tube |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | For viral injection |
| Miniscope DAQ Software | Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software) | N/A | For recording the calcium imaging data |
| Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3) | Open ephys | V3.3 | To acquire the calcium imaging data |
| Miniscope V4 | Open ephys | V4 | For in vivo calcium imaging |
| Miniscope V4 base plate (Variant 2) | Open ephys | Variant 2 | For holding the miniscope |
| nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-207 | For viral injection |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd. | H37022025 | To keep the eyes moist |
| PCR tube | LabServ | 309101009 | For dilue the virus |
| Personal Computer (ThinkPad) | Lenovo | 20W0-005UCD | To record the calcium imaging data and behavioral data |
| Running wheel | Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd | NA-H115 | For holding the mouse when affixing the base plate |
| Screwdriver (M1.6 screws) | Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) | 60902 | To unscrew the M1.6 screws |
| Screwdriver (set screws) | Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) | S2 | For unscrew the set screws |
| Set screw | TBD | 2-56 cone point set screw | For fasten the miniscope to its base plate |
| Small animal anesthesia machine | RWD Life Science Co.,Ltd | R500 | For anesthesia |
| Sterile syringe | Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD | 20163140236 | For rinse the blood |
| Surgical scissors | RWD Life Science Co.,Ltd | S14016-13 | For cutting off the hair and scalp |
| ThermoStar temperature controller,69025 pad incl. | RWD Life Science Co.,Ltd | 69027 | To maintain the animal's body temperature |
| Ultra fine forceps | RWD Life Science Co.,Ltd | F11020-11 | For removing the bone debris and dura |
| USB 3.0 cable | Open ephys | N/A | To connect the miniscope DAQ box and the computer |
| UV light | Jinshida | 66105854002 | To fix the GRIN lens on the skull |
| UV resin (light cure adhesive) | Loctite | 32268 | To fix the GRIN lens on the skull |
| Vacuum pump | Kylin-Bell | GL-802B | To remove the blood, saline and the brain tissue |
참고문헌
- Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
- Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J.
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