In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징)

요약

해마의 치상이랑(dentate gyrus)은 학습과 기억에서 필수적이고 뚜렷한 기능을 수행합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스의 치상이랑에 있는 과립 세포의 생체 내 칼슘 이미징을 위한 일련의 강력하고 효율적인 절차를 설명합니다.

초록

실시간 접근 방식은 일반적으로 학습 및 기억 연구에 필요하며, 생체 내 칼슘 이미징은 행동 작업 중 깨어 있는 동물의 신경 활동을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 해마는 일화 및 공간 기억과 밀접하게 관련되어 있기 때문에 이 분야의 연구에서 필수적인 뇌 영역이 되었습니다. 최근 연구에서는 생쥐에서 소형 현미경을 사용하여 해마 CA1 영역의 신경 활동을 기록하여 개방 필드 및 선형 트랙을 포함한 행동 작업을 수행하는 방법을 연구했습니다. 치상이랑은 해마의 또 다른 중요한 영역이지만, 깊이가 깊고 이미징이 어렵기 때문에 생체 내 이미징으로 연구된 적은 거의 없습니다. 이 프로토콜에서는 바이러스를 주입하는 방법, GRIN(Gradient-index) 렌즈를 이식하는 방법, 해마의 치상이랑을 이미징하기 위한 베이스 플레이트를 부착하는 방법을 포함한 칼슘 이미징 과정을 자세히 제시합니다. 또한 MATLAB을 사용하여 칼슘 이미징 데이터를 전처리하는 방법을 설명합니다. 또한 이미징이 필요한 다른 뇌 심부 영역에 대한 연구에도 이 방법이 도움이 될 수 있습니다.

서문

이전 연구에 따르면 해마는 기억을 처리하고 검색하는 데 필수적인 뇌 구조입니다 ^1,2. 1950년대 이래로 설치류의 해마의 신경회로는 기억 형성, 저장 및 회수를 연구하는 데 초점이 되어 왔다³. 해마 내의 해부학적 구조에는 치상이랑(DG), CA1, CA2, CA3, CA4 및 subiculum⁴의 하위 영역이 포함됩니다. 이러한 하위 영역들 사이에는 복잡한 양방향 연결이 존재하며, 그 중 DG, CA1 및 CA3는 과립 세포와 피라미드 세포로 구성된 두드러진 삼시냅스 회로를 형성합니다⁵. 이 회로는 내측 피질(entorhinal cortex, EC)로부터 주요 입력을 받으며 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 연구하기 위한 고전적인 모델이었습니다. 이전의 생체 내 연구는 해마 기능에 대한 연구가 대부분 CA1 ^6,7에 집중되어 있었는데, 이는 접근이 용이하기 때문입니다. CA1 뉴런은 기억 형성, 통합 및 검색, 특히 공간 기억을 위한 장소 세포에서 중요한 역할을 하지만 해마의 다른 하위 영역도 중요합니다 ^8,9. 특히 최근 연구에서는 DG가 기억 형성에 미치는 영향을 강조하고 있다. DG의 장소 셀은 CA1(¹⁰)의 장소셀보다 더 안정적인 것으로 보고되었으며, 이들의 활동은 상황별 정보(context-specific information)¹¹를 반영한다. 또한, DG 과립 세포의 활동 의존적 표지는 기억 관련 행동을 유도하기 위해 재활성화될 수 있다¹². 따라서 DG의 정보 코딩에 대한 더 깊은 이해를 얻으려면 동물이 메모리 의존적 작업을 수행하는 동안 DG 하위 영역의 활동을 조사하는 것이 중요합니다.

당뇨병 활성에 대한 선행 연구는 주로 in vivo electrophysiology를 사용하였다¹³. 그러나, 이 기술에는 몇 가지 단점이 있다: 첫째, 전기적 기록에서, 신호를 생성하는 다양한 유형의 세포를 직접 식별하기 어려울 수 있다. 기록된 신호는 억제성 세포와 흥분성 세포 모두에서 나옵니다. 따라서 이 두 가지 세포 유형을 분리하기 위해 추가 데이터 처리 방법이 필요합니다. 더욱이, 투영 특이적 소그룹 또는 활동 의존적 라벨링과 같은 다른 세포 유형 정보를 전기 기록과 결합하는 것은 어렵습니다. 또한 DG의 해부학적 형태로 인해 기록 전극이 직교 방향으로 이식되는 경우가 많아 기록할 수 있는 뉴런의 수가 크게 제한됩니다. 따라서, 전기적 기록이 동일한 동물(¹⁴)의 DG 구조로부터 수백 개의 개별 뉴런을 모니터링하는 것은 어렵다.

DG에서 뉴런 활동을 기록하는 보완적인 기술은 in vivo calcium imaging¹⁵을 사용하는 것이다. 칼슘 이온은 유기체의 세포 신호 전달 과정에 필수적이며, 특히 포유류 신경계 내에서 많은 생리적 기능에서 중요한 역할을 합니다. 뉴런이 활동할 때 세포 내 칼슘 농도가 급격히 증가하여 뉴런 활동과 신호 전달의 역동적인 특성을 반영합니다. 따라서 뉴런의 세포 내 칼슘 농도의 실시간 변화를 기록하면 신경 코딩 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

칼슘 이미징 기술은 특수 형광 염료 또는 유전자 조작 칼슘 지표(GECI)를 사용하여 형광 강도의 변화를 감지하여 뉴런의 칼슘 이온 농도를 모니터링한 다음 현미경 이미징을 통해 캡처할 수 있습니다¹⁶. 일반적으로 녹색 형광 단백질(GFP), 칼모듈린 및 M13 폴리펩티드 서열로 구성된 GCaMP 계열의 칼슘 지시자 유전자가 사용됩니다. GCaMP는 칼슘 이온⁽¹⁷)에 결합할 때 녹색 형광을 방출할 수 있으므로 이미징¹⁸을 통해 녹색 형광의 변동을 기록할 수 있습니다. 또한 표적 뇌 영역의 선명한 이미지를 얻기 위해 일반적으로 GRIN 렌즈(Gradient Index Lens)를 관심 영역 위에 이식합니다. GRIN 렌즈는 표면에서 직접 접근할 수 없는 뇌 심부 영역을 이미징할 수 있습니다.

이 기술은 다른 세포 유형을 표지하기 위해 다른 유전 도구와 결합하기가 비교적 쉽습니다. 또한, 이미징 평면이 DG의 세포 방향과 평행하기 때문에 성공적인 수술을 받을 때마다 수백 개의 뉴런에 접근할 수 있습니다. 이 연구에서는 생쥐의 치상이랑에서 생체 내 칼슘 이미징을 위한 완전하고 상세한 수술 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 이 절차에는 두 가지 주요 작업이 포함됩니다. 첫 번째는 AAV-CaMKIIα-GCaMP6f 바이러스를 DG에 주입하는 것입니다. 두 번째 수술은 바이러스 주입 부위 위에 GRIN 렌즈를 이식하는 것입니다. 이 두 가지 절차는 같은 자리에서 수행됩니다. 이러한 수술에서 회복 후 다음 단계는 소형 현미경 (miniscope)으로 이미징 품질을 확인하는 것입니다. 이미징 필드에 수백 개의 활성 세포가 있는 경우 후속 절차는 치과용 시멘트를 사용하여 미니스코프 베이스 플레이트를 마우스 두개골에 부착하는 것입니다. 그런 다음 마우스를 이미징 실험에 사용할 수 있습니다. 또한 수집된 칼슘 데이터의 분석을 간소화하기 위한 MATLAB 기반 전처리 파이프라인도 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 Fudan University의 Institutional Animal Care and Use Committee(202109004S)의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 모든 동물은 6개월 된 C57BL/6J였습니다. 남녀 모두가 사용되었다. 생쥐는 오전 8시부터 오후 8시까지 12시간 조명 주기로 유지되었습니다. DG에서 바이러스 주입을 위해 A/P: -2.2mm, M/L: 1.5mm, D/V: 뇌 표면에서 1.7mm 좌표를 사용했습니다.

1. 치상이랑에 바이러스 주입

1. 일회용 멸균 장갑과 가운을 포함한 보호 장비를 착용하십시오.
2. 필요한 수술 기구, 5mL의 식염수(0.9% NaCl[멸균] 또는 인공 뇌척수액) 튜브 2개, 25G 루어 락 뭉툭한 바늘 2개를 준비합니다.
   알림: 모든 수술 기구는 수술 전에 철저히 멸균해야 합니다. 우리는 수술 기구를 멸균하기 위해 고온(121-134 °C) 및 압력(20 psi)에서 고압멸균을 사용했습니다. 또한 표면에 알코올 성분의 소독제를 뿌렸습니다. 모든 수술 과정에서 0.9% 멸균 식염수를 사용했습니다. 수술 중에는 가열된 유리 구슬로 기구를 간헐적으로 멸균했습니다.
3. 바이러스와 접촉할 수 있는 모든 용품을 소독하기 위해 물에 10% 표백제 용액을 준비하십시오.
4. 필요한 경우 AAV-CaMKIIα-GCaMP6f 바이러스를 멸균 식염수를 사용하여 희석하고 4°C 냉장고 또는 얼음에 보관합니다. 바이러스의 목표 최종 역가는 1 × 10¹² GC/mL입니다.
   참고: 바이러스 무결성을 유지하기 위해 바이러스의 반복적인 동결-해동 주기를 피하는 것이 좋습니다. 이를 위해 일반적으로 제조업체로부터 바이러스를 수령할 때 소량(예: 튜브당 2μL)으로 분주하여 -80°C 냉동고에 보관합니다. 바이러스는 해동 당일에 사용해야 하며 장기간 사용하기 위해 4°C에서 보관해서는 안 됩니다.
5. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 마이크로피펫을 미세한 끝으로 당기고 수술용 가위로 팁의 작은 부분을 잘라낸 다음 튜브에 미네랄 오일을 채웁니다. 피펫이 액체를 정상적으로 빨아들일 수 있는지 확인한 다음 인젝터에 설치합니다.
   알림: 히터를 최대 전력의 ~60%로 설정한 1단계 당기는 방법을 사용했습니다. 이 단계에는 다른 풀러를 사용할 수 있습니다. 전체 목표는 팁의 직경을 ~50-100μm로 만드는 것입니다. 직경이 너무 작으면 액체의 흐름에 영향을 미칩니다. 너무 두꺼우면 쥐의 뇌 조직에 손상을 줄 수 있습니다.
6. 마우스 마취기, 온도 유지 기계(가열 패드) 및 진공 펌프를 포함한 모든 기구를 켭니다. 또한 수술 전에 쥐의 체중을 측정하십시오.
   참고: 시술 중에는 쥐의 호흡을 육안으로 모니터링하고 때때로 체온을 확인하여 상태가 양호한지 확인했습니다.
7. 2.5% 이소플루란과 1L의 산소/분이 있는 가스실에 마우스를 넣습니다. 마우스의 호흡 상태를 모니터링하여 마취 상태를 측정합니다.
   알림: 호흡수는 마우스를 건강하게 유지하기 위해 약 1회 호흡/초여야 합니다.
8. 가스실에서 마우스를 꺼내 입체 장치에 놓습니다.
9. 다음 작업을 시작하기 전에 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 양쪽 뒷발의 발 패드를 꼬집어 페달 철수 반사를 테스트합니다. 마우스가 발 패드 꼬집음에 반응하면 진행하기 전에 추가 마취를 투여하고 반사를 다시 테스트하십시오.
10. 마스크로 마우스 코를 가리고 이소플루란 유속을 1.5%로 설정합니다. 이어 바(ear bars)로 마우스 헤드를 단단히 고정합니다(그림 2A).
    알림: 이어 바를 마우스에 너무 단단히 고정하면 마우스의 호흡에 쉽게 영향을 미치고 경우에 따라 사망에 이를 수 있으므로 주의하십시오.
11. 수술용 가위로 쥐의 머리 꼭대기를 자르고 제모 크림을 사용하여 피부가 완전히 노출될 때까지 남은 털을 제거합니다. 제모 크림을 쥐의 두피에 바르고 약 5분 동안 그대로 둔 후 거즈로 크림을 닦아냅니다.
12. 쥐의 눈에 안과 연고를 바릅니다.
13. 면봉을 사용하여 요오드포 소독제와 75% 에탄올로 털이 없는 부분을 소독합니다.
14. 수술용 가위(또는 메스 칼날)를 사용하여 두피의 정중선을 따라 연속적으로 절개하고 두피의 일부를 잘라내어 두개골 표면을 노출시킵니다(그림 2B). 식염수로 두개골 표면을 헹굽니다. 그런 다음 진공 펌프를 사용하여 근막과 과도한 식염수를 제거합니다. 상처 주변에서 출혈이 멈출 때까지 이 과정을 여러 번 반복한다. 두개골 표면을 면봉으로 닦아 건조하게 유지하십시오.
    알림: 면봉이나 면봉으로 닦아내는 것과 같이 근막을 제거하는 다른 방법이 있습니다.
15. 위치 추적 바늘을 사용하여 브레그마와 람다가 보일 때 두개골 표면을 조정합니다. 전체 머리가 수평이 될 때까지 여러 번 조정합니다(Z축 방향의 전체 오차는 0.05mm 미만).
16. 바늘 끝을 브레그마에서 적절한 목표 위치로 이동합니다. 대상 좌표의 경우 bregma를 참조점으로 사용합니다. 바이러스 주입 부위의 둘레를 정의하기 위해 4개의 점을 표시하십시오: A/P: -2.0mm, M/L: -1.5mm; A/P: -2.5mm, M/L: -1.5mm; A/P -2.25mm, M/L: -1.0mm; 및 A/P -2.25mm, M/L: -2.0mm, 지울 수 있는 마커 포함.
    참고: 이 프로토콜은 동일한 수술에서 바이러스 주입과 GRIN 렌즈 이식을 수행합니다. 이 프로토콜에서는 모든 수술이 우반구에서 수행되었지만 두 반구 중 하나를 사용할 수 있다고 생각할 수 있습니다. 위에서 언급한 4가지 포인트에 의해 정의된 주입 영역 내에서 서로 다른 위치에서 3개의 개별 80nL 용량으로 바이러스를 주입합니다. 세 곳은 임의로 선정되었지만, 바이러스 확산을 위해 분산하는 것을 권장합니다. 이것은 감염된 세포의 수를 증가시킵니다.
17. 마이크로 드릴로 해당 부위의 개두술을 만들고 이 네 점을 경계로 설정합니다. 뇌 조직이 보이면 시추를 중단합니다(그림 2C).
    알림: 두개골을 천천히 뚫으십시오. 드릴 비트는 과도한 힘으로 인해 뇌 조직에 해를 끼칠 수 있습니다. 천천히 드릴링하는 것도 뇌의 과열을 예방할 수 있습니다.
18. 초미세 집게를 사용하여 뼈 부스러기와 경막을 제거하고 이 부위를 멸균 식염수로 지속적으로 헹굽니다.
    알림: 이 단계에서 일부 모세혈관이 파열됨에 따라 소량의 출혈이 발생하는 것은 정상입니다. 더 이상 피가 나지 않을 때까지 식염수로 계속 헹굽니다.
19. 인젝터의 제어판을 사용하여 약간의 미네랄 오일을 배출하여 바이러스의 후속 로딩에 필요한 공간을 생성합니다. 100nL/s의 속도로 희석된 바이러스를 최소 240nL로 마이크로피펫에 채웁니다.
    알림: 튜브의 기포는 마이크로피펫이 적절한 양의 액체를 분주하도록 보장하기 위해 제어판을 사용하여 배출해야 합니다. 여러 번 시도한 후에도 액체 부피가 여전히 정확하지 않으면 마이크로피펫을 교체하고 다시 시작하는 것이 좋습니다. 실제 주입량보다 더 많은 바이러스를 흡입하는 것이 좋습니다. 이 접근 방식은 생쥐의 뇌에 부주의하게 미네랄 오일을 주입하는 것을 방지합니다.
20. 마이크로피펫을 개두술 부위 위로 이동합니다. 그런 다음 뇌 표면에서 1.70mm 아래 D/V의 목표 Z축까지 뇌 조직으로 천천히 이동합니다.
    참고: 많은 참조 아틀라스는 두개골 표면을 D/V 0으로 사용합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 뇌 표면의 좌표를 사용하면 DG에 대한 더 신뢰할 수 있는 타겟팅을 얻을 수 있습니다.
21. 제어판을 사용하여 1nL/s의 유속으로 80nL의 바이러스를 주입하도록 주입기를 설정합니다(그림 2D). 조작부의 INJECT 버튼을 클릭하여 바이러스를 주입합니다. 그런 다음 개두술 내에서 두 개의 다른 위치를 선택하고 이전 작업을 반복합니다.
    참고: 각 주입에는 ~2분이 소요됩니다. 주입이 끝나면 다른 위치로 이동하기 전에 8-10분 더 기다립니다. 제거 중 출혈이 발생하면 즉시 식염수로 세척하십시오.
22. 뇌에서 마이크로피펫을 천천히 제거합니다(그림 2E).

2. 치상이랑에 GRIN 렌즈 이식

참고: 240nL 바이러스 주입을 완료한 직후 이 단계를 수행합니다.

1. 직경 1mm의 GRIN 렌즈를 75% 에탄올로 20분 동안 소독합니다. 이식하기 전에 식염수로 적절하게 헹굽니다.
2. 마이크로드릴을 사용하여 개두술을 확장하여 A/P 방향의 개구부를 약 1mm로 늘립니다. 식염수로 이물질을 제거하십시오.
3. Clamp GRIN 렌즈를 홀더로 제자리에 놓고 적절한 길이가 노출되도록 하십시오.
   알림: 다음 단계에서 UV 수지를 사용하여 두개골에 고정할 때 홀더를 GRIN 렌즈에 쉽게 붙일 수 있습니다. 그러나 이는 렌즈의 노출 길이가 적절하다면 피할 수 있습니다.
4. 홀더를 사용하여 GRIN 렌즈를 개두술 부위 위로 이동합니다. GRIN 렌즈의 바닥이 뇌 조직의 표면에 닿을 때 Z축 위치를 0으로 설정합니다. 그런 다음 GRIN 렌즈 홀더를 분리하여 따로 보관합니다.
5. 25G 루어 락 뭉툭한 바늘을 진공 펌프 흡입 튜브에 부착하고 압력을 0.04MPa로 조정합니다.
   알림: 이 단계를 처음 수행하는 경우 압력을 적절하게 줄여 뇌 조직을 천천히 흡인할 수 있습니다.
6. 뭉툭한 바늘 끝을 뇌 조직 위로 바짝 돌려 뇌 조직을 흡입하고 뇌 조직을 부드럽게 눌러 흡인을 용이하게 합니다. 뇌를 명확하게 볼 수 있도록 흡입하는 동안 식염수(4 °C에서 보관)로 계속 헹굽니다. 흡인의 깊이를 모니터링하기 위해 조직의 특징을 면밀히 관찰하십시오 : 피질 조직은 옅은 분홍색, 아래의 뇌량은 흰색의 섬유질 조직으로 보이며, 해마 CA1 층은 짙은 빨간색과 회색입니다. 조직 표면이 매끄러워지고 넓은 면적의 CA1이 노출되면 흡입을 중단합니다(그림 3).
   참고: 이 단계는 전체 절차의 성공에 매우 중요하며 종종 가장 어려운 부분입니다. 독자가 이 단계를 해결하는 데 도움이 되는 일반적인 문제 목록을 제공했습니다(표 1). 또한 출혈을 어느 정도 줄일 수 있으므로 차가운 식염수로 상처를 지속적으로 헹구는 것이 좋습니다.
   1. 바늘이 막히면; 막힌 바늘을 주사기에 부착하고 막힌 부분을 씻어냅니다. 그래도 작동하지 않으면 바늘을 교체해 보십시오.
   2. 출혈이 계속되면 뇌 조직의 시야를 가릴 수 있습니다. 이 경우 혈액이 응고될 때까지 기다렸다가 식염수로 헹굽니다.
7. 드릴 구멍 위로 홀더를 이동합니다. GRIN 렌즈가 뇌 조직의 표면에 닿을 때 Z축을 0으로 설정합니다. GRIN 렌즈가 구멍의 직경을 초과하면 마이크로 드릴을 사용하여 구멍을 확장하십시오. 그런 다음 이 절차를 반복합니다.
8. GRIN 렌즈를 D/V: -1.32mm의 구멍에 삽입합니다. 홀더를 5-10분 동안 그대로 두십시오. 홀더를 올린 후 식염수로 구멍을 헹굽니다. 이 단계를 3번 반복합니다(그림 4A).
   참고: 이 단계에서 뇌 조직에서 출혈이 발생하는 것은 정상입니다. 식염수를 반복적으로 헹군 후에는 구멍에 더 이상 피가 없어야 합니다. 이 단계는 이미징 품질에 큰 영향을 미치며 혈액을 청소하지 않으면 이미징 필드가 검게 변할 수 있습니다.
9. 식염수를 사용하여 두개골을 철저히 청소한 다음 UV 수지를 바르기 전에 두개골을 건조시키십시오.
10. 바늘을 사용하여 GRIN 렌즈 주위에 UV 수지를 바릅니다. 이 영역을 UV 광선으로 15초 동안 비추고 UV 수지가 고체가 되도록 합니다(그림 4B).
    알림: UV 레진을 한 번에 조금씩 바르고 GRIN 렌즈 주변이 덮일 때까지 이 작업을 여러 번 반복합니다. UV 광선을 조명에 사용할 때 GRIN 렌즈를 홀더에 부착하지 않도록 주의하십시오.
11. GRIN 렌즈에서 홀더를 조심스럽게 제거합니다. 노출된 두개골 전체를 UV 레진으로 덮고 헤드플레이트를 두개골의 적절한 위치에 놓습니다. 전체 두개골과 헤드플레이트를 15초 동안 UV 광선으로 비춥니다(그림 4C).
    알림: 헤드플레이트는 베이스플레이트를 부착할 때 마우스 머리를 제자리에 단단히 고정하기 위한 구성 요소입니다( 추가 파일 1 참조). 헤드플레이트를 가능한 한 단단히 고정하십시오. 헤드플레이트가 분리되면 전체 수술이 실패하게 됩니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, UV 수지를 철저히 도포하면 단단히 부착할 수 있어야 합니다. 더 강력한 부착이 필요한 경우 두개골 나사 설치를 고려할 수 있습니다.
12. 노출된 GRIN 렌즈를 3D 프린팅된 보호 캡으로 덮습니다(설계에 대한 추가 파일 2 참조). M1.6 나사를 사용하여 캡을 헤드플레이트에 고정합니다(그림 4D).
13. 수술 후 염증을 예방하기 위해 수술 후 덱사메타손을 복강내로 주사(0.9% 식염수, 2mg/kg에 용해)합니다. 또한 수술 후 통증을 줄이기 위해 카프로펜(0.9% 식염수, 5mg/kg에 용해)을 피하 주사합니다.
14. 쥐를 케이지에 다시 넣고 회복을 용이하게 하기 위해 열 담요로 옮깁니다. 그런 다음 쥐가 자유롭게 움직일 수 있게 된 후 실험 동물 집으로 옮깁니다.
    알림: 싸움으로 인한 베이스 플레이트의 손상을 방지하기 위해 수술을 받은 마우스는 개별적으로 또는 최소한의 동거인과 함께 수용될 수 있습니다. 수술 후 케이지에 3마리의 쥐를 초과하지 않는 것이 좋습니다.
15. 10% 표백제 용액을 사용하여 작업 표면을 소독합니다. 일회용 개인 보호 장비(PPE)를 제거하고 생물학적 위험 봉투에 폐기하십시오.
16. 수술 후 3일 동안 매일 쥐를 모니터링하십시오. 생쥐의 체중을 기록하고 상처 치유 상태와 운동 활동을 관찰합니다. 덱사메타손과 카프로펜 용액(2.13단계와 동일한 용량)을 3일 동안 매일 복강 내 주사합니다. 필요한 경우 회복을 촉진하기 위해 촉촉한 차우 또는 트리트먼트를 제공하십시오.

3. 이미징 필드의 품질 확인

참고: 마우스는 첫 번째 생체 내 칼슘 이미징 세션 전에 수술 후 2-3주 내에 회복됩니다. 이 단계의 목적은 수술의 품질과 마우스의 회복을 확인하는 것입니다. 이미징 필드에서 단세포 활동을 관찰할 수 있고 마우스의 상태가 양호하면 베이스 플레이트를 마우스 두개골에 부착합니다. 마우스는 영상 품질이나 건강 상태가 적절하지 않은 경우 자궁경부 탈구로 안락사시켜야 합니다.

1. USB 3.0 케이블을 사용하여 미니스코프 데이터 수집 상자를 컴퓨터에 연결합니다. 그런 다음 SMA(To Scope Connector)를 통해 동축 케이블을 상자에 연결합니다.
2. 미니스코프 제어 소프트웨어를 켭니다. Software(소프트웨어)에서 Select Config File(구성 파일 선택) | 사용자 구성 파일 V4 plus 를 사용하여 라이브 이미지를 볼 수 있습니다.
3. 맞춤형 홀더를 사용하여 cl을 사용하여 러닝 휠에 마우스를 고정하십시오.amp헤드 플레이트. 미니스코프 홀더(3D 프린팅으로 제작, 디자인은 보충 파일 3 참조)로 미니스코프를 잡고 입체 기기를 사용하여 미니스코프를 마우스 머리 위로 움직입니다(그림 4E).
4. 드라이버로 캡을 제거합니다. GRIN 렌즈의 표면을 75% 에탄올로 부드럽게 닦습니다. 미니스코프를 노출된 GRIN 렌즈 바로 위에 놓고 스코프의 바닥 표면을 렌즈 표면과 평행하게 만듭니다. 미니스코프를 GRIN 렌즈 쪽으로 천천히 내려 최적의 초점면을 찾습니다.
   알림: 초점면을 0으로 설정한 다음 미니스코프의 위치를 조정하십시오. 이렇게 하면 초점을 조정할 수 있는 더 많은 공간이 제공됩니다. 가장 많은 수의 셀을 명확하게 시각화할 수 있는 초점면을 선택합니다.
5. 미니스코프 제어 소프트웨어에서 LED 조명 전력을 최적의 수준으로 조정합니다.
   알림: 단일 세포 활동을 관찰하려면 이미징 필드가 과다 노출되거나 너무 어둡지 않아야 합니다. LED 강도 는 일반적으로 10% 이내입니다.
6. 혈관 혈류가 보이고 세포가 수많고 이미징 필드 전체에 균일하게 분포되어 있는 경우 실험의 다음 섹션으로 진행합니다.
   참고: 이 단계에서는 단일 셀 활동을 관찰할 수 있는 것이 중요합니다. 이는 데이터 분석 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 일반적으로 지역 활동(형광 변동 덩어리)은 해석하기 어렵습니다. 이는 표적 뉴런이 GRIN 렌즈의 초점에서 벗어났다는 표시일 수 있습니다. 마우스는 이미징 필드가 검은색이거나 세포가 국소 활성을 보이거나 세포 수가 충분하지 않은 경우 후속 실험에 사용되지 않습니다.
7. 미니스코프에서 케이블을 분리합니다.

4. 미니스코프 베이스 플레이트를 쥐의 두개골에 부착합니다.

1. 베이스 플레이트를 미니스코프에 부착하고 미니스코프의 위치를 다시 조정하여 좋은 이미징 품질의 시야를 얻습니다.
2. 믹싱 볼에 의치 기본 재료를 섞습니다.
   알림: 혼합물이 너무 자유롭게 흐르거나 너무 단단하지 않은 것이 중요합니다. 유동성이 너무 많으면 GRIN 렌즈의 표면을 덮는 경향이 있어 이미징 필드가 손실됩니다. 너무 단단하면 의치 기본 재료가 베이스 플레이트와 헤드플레이트 사이의 틈을 단단히 덮을 수 없습니다.
3. 미니스코프 베이스 플레이트 주위에 의치 베이스 재료의 첫 번째 층을 조심스럽게 적용하는 동안 미니스코프의 위치를 변경하지 않도록 주의하십시오. 베이스 플레이트에서 헤드 플레이트로 두 번째 시멘트 층을 적용하기 전에 시멘트의 첫 번째 층이 굳을 때까지 기다립니다. 모든 의치 모재를 경화시킨 후 고정 나사를 풀고 베이스 플레이트에서 미니스코프를 분리합니다.
   알림: 의치 기본 재료를 사용할 때 소프트웨어의 이미징 필드에 주의를 기울이고 시멘트가 응고되기 전에 필요한 조정을 하십시오.
4. 미니스코프에서 고정 암을 부드럽게 제거합니다.
5. 베이스 플레이트 캡을 베이스 플레이트에 넣어 노출된 GRIN 렌즈를 보호하고 고정 나사를 조입니다(그림 4F).
6. 마우스를 홈 케이지에 다시 넣습니다. 행동 실험을 수행하기 전에 쥐가 회복할 수 있도록 몇 일을 기다립니다.

5. 데이터 수집

참고: In vivo 칼슘 이미징은 모든 거동 테스트와 동시에 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 선형 트랙을 예로 사용합니다. 이 선형 트랙은 1.5m이며 양쪽 끝에 물이 있어 쥐에 대한 보상 역할을 합니다. 생쥐는 소형 현미경(미니스코프)을 착용하고 20분 동안 트랙을 따라 앞뒤로 달릴 수 있습니다. 이 기간 동안 마우스는 일반적으로 ~60번의 시도를 실행할 수 있습니다.

1. USB 3.0 케이블을 사용하여 미니스코프 데이터 수집 상자를 컴퓨터에 연결합니다. 그런 다음 SMA( To Scope ) 커넥터를 통해 동축 케이블을 상자에 연결합니다.
2. 미니스코프 제어 소프트웨어를 켭니다. miniscope control Software(미니스코프 제어 소프트웨어)에서 Select Config File(구성 파일 선택) | 사용자 구성 파일 V4 plus 를 사용하여 라이브 이미지를 볼 수 있습니다.
3. USB 3.0 케이블을 사용하여 산업용 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.
4. 카메라 제어 소프트웨어를 켭니다. 소프트웨어에서 Open Equipment(장비 열기)를 클릭하고 데이터 수집 매개변수를 가져올 파일을 선택합니다. AVI 컨테이너에서 비디오 형식을 압축되지 않은 비디오로 선택합니다. 시작 버튼을 클릭하여 라이브 이미지를 봅니다.
   알림: 파일 크기를 줄이려면 동작 녹화 비디오의 시야는 트랙 외부의 불필요한 영역을 제외해야 합니다.
5. 맞춤형 홀더를 사용하여 cl을 사용하여 러닝 휠에 마우스를 고정하십시오.amp헤드 플레이트.
6. 드라이버로 고정 나사를 풀고 베이스 플레이트 캡을 제거한 다음 GRIN 렌즈 표면을 75% 에탄올로 청소합니다.
7. 미니스코프를 베이스에 장착합니다. 미니스코프를 마우스 머리 바닥에 고정합니다.
8. 초점면 버튼을 밀어 최적의 초점면을 찾습니다.
9. 러닝 휠에서 선형 트랙으로 마우스를 부드럽게 움직입니다.
10. 녹화 버튼을 길게 클릭하여 미니스코프로 녹화를 시작합니다. 그런 다음 수집 시작 버튼을 눌러 카메라 녹화를 시작합니다. 20분 동안 녹화합니다.
11. in vivo 칼슘 이미징 데이터, 행동 데이터 및 Arduino 데이터를 별도로 저장합니다. 이러한 파일의 이름을 날짜, 세션 번호 및 마우스 번호로 지정합니다.
    참고: 미니스코프를 사용하는 연구는 단일 실험 동물에 대해 장기적인 데이터 수집 기간을 갖는 경향이 있습니다. 파일 이름을 명확하게 지정하면 데이터 처리 절차에 도움이 될 수 있습니다.
12. 베이스에서 미니스코프를 분리합니다.
13. 카메라 제어 소프트웨어, 미니스코프 제어 소프트웨어 및 컴퓨터를 닫습니다.
14. To Scope(SMA)에서 동축 케이블을 분리하고 카메라에서 USB 3.0 케이블을 분리합니다.
15. 베이스의 고정 나사를 풀고 베이스 플레이트 캡을 다시 끼운 다음 나사를 조입니다.
16. 마우스를 홈 케이지에 다시 넣으십시오.

6. 데이터 처리

1. 기록된 칼슘 이미징 데이터를 MATLAB에 불러옵니다.
   참고: 우리는 데이터 분석이 실험 설계에 맞게 조정되어야 한다는 것을 알고 있습니다. 여기에서는 원시 칼슘 이미징 비디오를 개별 세포의 활동 추적으로 변환하는 전처리 파이프라인을 제공합니다. 우리는 이 절차가 비교적 보편적이고 사용자에게 유용하다고 믿습니다. 이 섹션에서 설명하는 모든 스크립트는 보충 파일 4에서 찾을 수 있습니다.
2. 이미징 데이터를 AVI에서 HDF5(.h5) 형식으로 변환합니다.
   참고: 미니스코프의 원시 출력은 압축된 AVI 파일을 생성합니다. 압축되지 않은 파일의 크기는 일반적으로 수십 기가바이트입니다. HDF5 파일 형식을 사용하면 후속 분석을 위해 쉽게 시각화하고 조작할 수 있는 가상 및 부분 액세스가 가능합니다.
3. Non-Rigid Motion Correction(NoRMCorre)을 적용합니다.¹⁹.
4. 이후 단계를 위해 컴퓨터의 RAM이 제한된 경우 동작 보정된 동영상을 다운 샘플링합니다.
   알림: 미니스코프로 수집된 원본 데이터의 크기는 600 x 600입니다. 공간 다운 샘플을 사용하면 비디오 크기를 200 x 200으로 줄일 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 데이터 스토리지 요구 사항이 크게 줄어들고 데이터 처리 속도가 빨라집니다.
5. 온라인 저장소²⁰ (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public)의 EXTRACT 코드에 대한 지침에 따라 다운샘플링된 데이터에 EXTRACT를 적용하여 단일 셀 신호를 식별합니다.

결과

그림 1 은 바이러스 주입, GRIN 렌즈 주입, 베이스 플레이트 부착, 미니스코프를 통한 생체 내 칼슘 이미징 및 데이터 처리를 포함한 실험 절차의 개략도를 보여줍니다. 일반적으로 전체 절차는 1개월이 소요됩니다. 그림 2 는 두개골에 뚫린 구멍의 위치와 GRIN 렌즈 이식 전 뇌 조직의 상태를 포함한 바이러스 주입 절차의 예를 보여줍니다.

토론

여기서 우리는 마우스의 DG에서 생체 내 칼슘 이미징 절차를 설명했습니다. 우리는 이 프로토콜이 다양한 인지 과정에서 DG 기능을 연구하려는 연구자, 특히 유전적으로 식별된 하위 집단에 관심이 있는 경우에 유용할 것이라고 믿습니다. 여기에서는 수술의 몇 가지 핵심 사항을 강조하여 프로토콜의 장점을 설명하고 이 방법의 한계에 대해 논의합니다.

우리는 사용 가?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 μL universal pipette tips	Transcat Pipettes	1030-260-000-9	For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips)	iSmile	20-0105	For removing the brain tissue
3D printed protective cap	N/A	N/A	To protect the GRIN Lens
75% ethanol	Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd	bwsj-230219105303	For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus	Brain Case	BC-0083	For viral injection
Adobe Illustrator	Adobe	cc 2018 version 22.1	To draw figures
Anesthesia air pump	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-30	For anesthesia
Camera control software	Daheng Imaging	Galaxy Windows SDK_CN (V2)	For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder)	RWD Life Science Co.,Ltd	68214	To hold the GRIN lens
Carprofen	MedChemExpress	53716-49-7	To reduce postoperative pain of the mouse
Coax Cable	Open ephys	CW8251	To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope	Olympus Life Science	FV3000	For observing the brain slices
Cotton swab	Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd	20202140438	For disinfection
Customized headplate	N/A	N/A	For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder	N/A	N/A	To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing)	New Centry Dental	430205	For attaching the miniscope
Depilatory cream	Veet	ASIN : B001DUUPQ0	For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M	RWD Life Science Co.,Ltd	68803	For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone	Huachu Co., Ltd.	N/A	To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope	RWD Life Science Co., Ltd	MZ62-WX	For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-31-6	For anesthesia
GRIN lens	GoFoton	CLHS100GFT003	For GRIN lens implantation
GRIN lens	InFocus Grin Corp	SIH-100-043-550-0D0-NC	For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)	RWD Life Science Co.,Ltd	V100	For anesthesia
Industrial camera	Daheng Imaging	MER-231-41U3M-L, VS-0618H1	For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant	Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd	8861F6DFC92A	For disinfection
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10	For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	For viral injection
MATLAB	MathWorks	R2021b	For analyzing the data
Microdrill	RWD Life Science Co.,Ltd	78001	For craniotomy
Micropipette puller	Narishige International USA	PC-100	For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	For viral injection
Miniscope DAQ Software	Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)	N/A	For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)	Open ephys	V3.3	To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4	Open ephys	V4	For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2)	Open ephys	Variant 2	For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-207	For viral injection
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.	H37022025	To keep the eyes moist
PCR tube	LabServ	309101009	For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad)	Lenovo	20W0-005UCD	To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel	Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd	NA-H115	For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	60902	To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	S2	For unscrew the set screws
Set screw	TBD	2-56 cone point set screw	For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co.,Ltd	R500	For anesthesia
Sterile syringe	Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD	20163140236	For rinse the blood
Surgical scissors	RWD Life Science Co.,Ltd	S14016-13	For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl.	RWD Life Science Co.,Ltd	69027	To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps	RWD Life Science Co.,Ltd	F11020-11	For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable	Open ephys	N/A	To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light	Jinshida	66105854002	To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive)	Loctite	32268	To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump	Kylin-Bell	GL-802B	To remove the blood, saline and the brain tissue