Imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado del hipocampo en ratones

Resumen

El giro dentado del hipocampo lleva a cabo funciones esenciales y distintas en el aprendizaje y la memoria. Este protocolo describe un conjunto de procedimientos robustos y eficientes para la obtención de imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado en ratones que se mueven libremente.

Resumen

Los enfoques en tiempo real suelen ser necesarios en los estudios de aprendizaje y memoria, y las imágenes de calcio in vivo ofrecen la posibilidad de investigar la actividad neuronal en animales despiertos durante las tareas de comportamiento. Dado que el hipocampo está estrechamente asociado con la memoria episódica y espacial, se ha convertido en una región cerebral esencial en la investigación de este campo. En investigaciones recientes, las células de engrama y las células de lugar se estudiaron registrando las actividades neuronales en la región CA1 del hipocampo utilizando el microscopio en miniatura en ratones mientras realizaban tareas de comportamiento que incluían campo abierto y pista lineal. Aunque la circunvolución dentada es otra región importante en el hipocampo, rara vez se ha estudiado con imágenes in vivo debido a su mayor profundidad y dificultad para la obtención de imágenes. En este protocolo, presentamos en detalle un proceso de imágenes de calcio, que incluye cómo inyectar el virus, implantar una lente GRIN (índice de gradiente) y colocar una placa base para obtener imágenes del giro dentado del hipocampo. Describimos con más detalle cómo preprocesar los datos de imágenes de calcio utilizando MATLAB. Además, los estudios de otras regiones profundas del cerebro que requieren imágenes pueden beneficiarse de este método.

Introducción

Estudios previos encontraron que el hipocampo es una estructura cerebral esencial para procesar y recuperar recuerdos ^1,2. Desde la década de 1950, los circuitos neuronales del hipocampo en roedores han sido un foco en el estudio de la formación, almacenamiento y^{recuperación de la} memoria. Las estructuras anatómicas dentro del hipocampo incluyen las subregiones del giro dentado (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 y subículo⁴. Existen conexiones bidireccionales complejas entre estas subregiones, de las cuales DG, CA1 y CA3 forman un circuito trisináptico prominente que const....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fudan (202109004S). Todos los animales utilizados en este estudio fueron C57BL/6J de 6 meses de edad; Se utilizaron ambos sexos. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz de 12 horas, de 8 a.m. a 8 p.m. Utilizamos las siguientes coordenadas para la inyección del virus en DG: A/P: -2,2 mm, M/L: 1,5 mm, D/V: 1,7 mm de la superficie cerebral.

1. Inyección de virus en la circunvolución dentada

1. Use equipo de protección, incluidos guantes y batas estériles de un solo uso.
2. Pre....

Discusión

Aquí describimos un procedimiento para la obtención de imágenes de calcio in vivo en la DG de ratones. Creemos que este protocolo será útil para los investigadores que buscan estudiar las funciones de la DG en diversos procesos cognitivos, particularmente en los casos en que una subpoblación identificada genéticamente es de interés. A continuación explicamos las ventajas de nuestro protocolo, haciendo hincapié en algunos puntos clave en la cirugía, y comentamos las limitaciones de este método.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 μL universal pipette tips	Transcat Pipettes	1030-260-000-9	For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips)	iSmile	20-0105	For removing the brain tissue
3D printed protective cap	N/A	N/A	To protect the GRIN Lens
75% ethanol	Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd	bwsj-230219105303	For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus	Brain Case	BC-0083	For viral injection
Adobe Illustrator	Adobe	cc 2018 version 22.1	To draw figures
Anesthesia air pump	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-30	For anesthesia
Camera control software	Daheng Imaging	Galaxy Windows SDK_CN (V2)	For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder)	RWD Life Science Co.,Ltd	68214	To hold the GRIN lens
Carprofen	MedChemExpress	53716-49-7	To reduce postoperative pain of the mouse
Coax Cable	Open ephys	CW8251	To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope	Olympus Life Science	FV3000	For observing the brain slices
Cotton swab	Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd	20202140438	For disinfection
Customized headplate	N/A	N/A	For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder	N/A	N/A	To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing)	New Centry Dental	430205	For attaching the miniscope
Depilatory cream	Veet	ASIN : B001DUUPQ0	For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M	RWD Life Science Co.,Ltd	68803	For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone	Huachu Co., Ltd.	N/A	To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope	RWD Life Science Co., Ltd	MZ62-WX	For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-31-6	For anesthesia
GRIN lens	GoFoton	CLHS100GFT003	For GRIN lens implantation
GRIN lens	InFocus Grin Corp	SIH-100-043-550-0D0-NC	For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)	RWD Life Science Co.,Ltd	V100	For anesthesia
Industrial camera	Daheng Imaging	MER-231-41U3M-L, VS-0618H1	For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant	Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd	8861F6DFC92A	For disinfection
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10	For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	For viral injection
MATLAB	MathWorks	R2021b	For analyzing the data
Microdrill	RWD Life Science Co.,Ltd	78001	For craniotomy
Micropipette puller	Narishige International USA	PC-100	For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	For viral injection
Miniscope DAQ Software	Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)	N/A	For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)	Open ephys	V3.3	To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4	Open ephys	V4	For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2)	Open ephys	Variant 2	For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-207	For viral injection
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.	H37022025	To keep the eyes moist
PCR tube	LabServ	309101009	For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad)	Lenovo	20W0-005UCD	To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel	Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd	NA-H115	For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	60902	To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	S2	For unscrew the set screws
Set screw	TBD	2-56 cone point set screw	For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co.,Ltd	R500	For anesthesia
Sterile syringe	Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD	20163140236	For rinse the blood
Surgical scissors	RWD Life Science Co.,Ltd	S14016-13	For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl.	RWD Life Science Co.,Ltd	69027	To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps	RWD Life Science Co.,Ltd	F11020-11	For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable	Open ephys	N/A	To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light	Jinshida	66105854002	To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive)	Loctite	32268	To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump	Kylin-Bell	GL-802B	To remove the blood, saline and the brain tissue