Imagerie calcique in vivo de cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe chez la souris

Résumé

Le gyrus denté de l’hippocampe remplit des fonctions essentielles et distinctes dans l’apprentissage et la mémoire. Ce protocole décrit un ensemble de procédures robustes et efficaces pour l’imagerie calcique in vivo des cellules granulaires dans le gyrus denté chez des souris se déplaçant librement.

Résumé

Des approches en temps réel sont généralement nécessaires dans les études de l’apprentissage et de la mémoire, et l’imagerie calcique in vivo offre la possibilité d’étudier l’activité neuronale chez les animaux éveillés pendant les tâches comportementales. Étant donné que l’hippocampe est étroitement associé à la mémoire épisodique et spatiale, il est devenu une région essentielle du cerveau dans la recherche de ce domaine. Dans des recherches récentes, les cellules d’engramme et les cellules de lieu ont été étudiées en enregistrant les activités neuronales dans la région CA1 de l’hippocampe à l’aide du microscope miniature chez la souris tout en effectuant des tâches comportementales comprenant un champ ouvert et une piste linéaire. Bien que le gyrus denté soit une autre région importante de l’hippocampe, il a rarement été étudié avec l’imagerie in vivo en raison de sa plus grande profondeur et de sa difficulté d’imagerie. Dans ce protocole, nous présentons en détail un processus d’imagerie calcique, y compris comment injecter le virus, implanter une lentille GRIN (Gradient-index) et fixer une plaque de base pour l’imagerie du gyrus denté de l’hippocampe. Nous décrivons plus en détail comment prétraiter les données d’imagerie calcique à l’aide de MATLAB. De plus, des études sur d’autres régions cérébrales profondes qui nécessitent une imagerie peuvent bénéficier de cette méthode.

Introduction

Des études antérieures ont montré que l’hippocampe est une structure cérébrale essentielle au traitement et à la récupération des^souvenirs1,2. Depuis les années 1950, les circuits neuronaux de l’hippocampe chez les rongeurs ont été au centre de l’étude de la formation, du stockage et de la récupération de la mémoire³. Les structures anatomiques de l’hippocampe comprennent les sous-régions du gyrus denté (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 et du subiculum⁴. Des connexions bidirectionnelles complexes existent entre ces sous-régions, dont la DG, CA1 et CA3 forment un circuit trisynaptique proéminent composé de cellules granulaires et de cellules pyramidales⁵. Ce circuit reçoit son entrée primaire du cortex entorhinal (CE) et a été un modèle classique pour l’étude de la plasticité synaptique. Les recherches in vivo antérieures sur la fonction de l’hippocampe se sont principalement concentrées sur le CA1 ^6,7 en raison de son accès plus facile. Alors que les neurones CA1 jouent un rôle important dans la formation, la consolidation et la récupération de la mémoire, en particulier dans les cellules de place pour la mémoire spatiale, d’autres sous-régions de l’hippocampe sont également vitales ^8,9. En particulier, des études récentes ont mis en évidence les fonctions de la DG dans la formation de la mémoire. Les cellules de lieu dans la MD sont plus stables que celles de CA1¹⁰, et leurs activités reflètent des informations spécifiques au contexte¹¹. De plus, le marquage dépendant de l’activité des cellules granulaires DG peut être réactivé pour induire des comportements liés à la mémoire¹². Par conséquent, pour mieux comprendre le codage de l’information dans la DG, il est crucial d’étudier les activités de la sous-région de la MD pendant que l’animal effectue des tâches dépendantes de la mémoire.

Les études antérieures sur les activités des DG ont principalement utilisé l’électrophysiologie in vivo ¹³. Cependant, cette technique présente quelques inconvénients : tout d’abord, dans les enregistrements électriques, il peut être difficile d’identifier directement les différents types de cellules qui génèrent le signal. Les signaux enregistrés proviennent à la fois de cellules inhibitrices et de cellules excitatrices. Par conséquent, d’autres méthodes de traitement des données sont nécessaires pour séparer ces deux types de cellules. De plus, il est difficile de combiner d’autres informations sur le type de cellule, telles que des sous-groupes spécifiques à la projection ou un étiquetage dépendant de l’activité, avec des enregistrements électriques. De plus, en raison de la morphologie anatomique de la DG, les électrodes d’enregistrement sont souvent implantées dans une direction orthogonale, ce qui limite considérablement le nombre de neurones pouvant être enregistrés. Ainsi, il est difficile pour les enregistrements électriques de surveiller des centaines de neurones individuels de la structure DG chez le même animal¹⁴.

Une technique complémentaire d’enregistrement des activités neuronales dans la DG consiste à utiliser l’imagerie calcique in vivo ¹⁵. Les ions calcium sont fondamentaux dans les processus de signalisation cellulaire des organismes, jouant un rôle crucial dans de nombreuses fonctions physiologiques, en particulier dans le système nerveux des mammifères. Lorsque les neurones sont actifs, la concentration intracellulaire de calcium augmente rapidement, ce qui reflète la nature dynamique de l’activité neuronale et de la transmission du signal. Par conséquent, l’enregistrement en temps réel des changements dans les niveaux de calcium intracellulaire dans les neurones fournit des informations importantes sur les mécanismes de codage neuronaux.

La technologie d’imagerie calcique utilise des colorants fluorescents spécialisés ou des indicateurs calciques génétiquement modifiés (GECI) pour surveiller les concentrations d’ions calcium dans les neurones en détectant les changements d’intensité de fluorescence, qui peuvent ensuite être capturés par imagerie microscopique¹⁶. Généralement, la famille GCaMP de gènes indicateurs de calcium, comprenant la protéine fluorescente verte (GFP), la calmoduline et les séquences polypeptidiques M13, est utilisée. GCaMP peut émettre une fluorescence verte lorsqu’il se lie aux ions calcium¹⁷, ce qui permet d’enregistrer les fluctuations de la fluorescence verte par imagerie¹⁸. De plus, pour obtenir des images claires de la région cérébrale cible, une lentille à gradient d’indice (lentille GRIN) est généralement implantée au-dessus de la région d’intérêt. La lentille GRIN permet d’imager la région profonde du cerveau qui n’est pas accessible directement depuis la surface.

Cette technique est relativement facile à combiner avec d’autres outils génétiques pour marquer différents types de cellules. De plus, comme le plan d’imagerie est parallèle à l’orientation des cellules dans la DG, des centaines de neurones sont accessibles pour l’imagerie à chaque intervention chirurgicale réussie. Dans ce travail, nous présentons un protocole chirurgical complet et détaillé pour l’imagerie calcique in vivo dans le gyrus denté chez la souris (Figure 1). La procédure comporte deux opérations principales. La première consiste à injecter le virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f dans la DG. La deuxième opération consiste à implanter une lentille GRIN au-dessus du site d’injection du virus. Ces deux procédures se déroulent au cours de la même séance. Après la récupération de ces chirurgies, l’étape suivante consiste à vérifier la qualité de l’imagerie avec des microscopes miniaturisés (miniscopes). Si le champ d’imagerie comporte des centaines de cellules actives, la procédure ultérieure consiste à fixer la plaque de base du miniscope sur le crâne de la souris à l’aide de ciment dentaire ; La souris peut ensuite être utilisée pour des expériences d’imagerie. Nous présentons également un pipeline de prétraitement basé sur MATLAB pour rationaliser l’analyse des données de calcium collectées.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Fudan (202109004S). Tous les animaux utilisés dans cette étude étaient des C57BL/6J âgés de 6 mois ; Les deux sexes ont été utilisés. Les souris ont été maintenues sur un cycle de lumière de 12 heures, de 8 h à 20 h. Nous avons utilisé les coordonnées suivantes pour l’injection du virus en DG : A/P : -2,2 mm, M/L : 1,5 mm, D/V : 1,7 mm de la surface du cerveau.

1. Injection du virus dans le gyrus denté

1. Portez de l’équipement de protection, y compris des gants et des blouses stériles à usage unique.
2. Préparez les instruments chirurgicaux requis, deux tubes de 5 mL de solution saline (0,9 % de NaCl [stérile] ou liquide céphalo-rachidien artificiel) et deux aiguilles luer lock de 25 G.
   REMARQUE : Tous les instruments chirurgicaux doivent être soigneusement stérilisés avant l’opération. Nous avons utilisé l’autoclave à haute température (121-134 °C) et à haute pression (20 psi) pour stériliser les instruments chirurgicaux. De plus, nous avons vaporisé les surfaces avec des désinfectants à base d’alcool. Dans toutes les interventions chirurgicales, nous avons utilisé une solution saline stérile à 0,9 %. Les instruments ont été stérilisés par intermittence pendant l’opération avec des billes de verre chauffées.
3. Préparez une solution d’eau de Javel à 10 % dans de l’eau pour désinfecter toutes les fournitures qui pourraient entrer en contact avec le virus.
4. Diluez le virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f si nécessaire, à l’aide d’une solution saline stérilisée, et conservez-le au réfrigérateur à 4 °C ou sur de la glace. Le titre final cible du virus est de 1 × 10¹² GC/mL.
   REMARQUE : Nous vous recommandons d’éviter les cycles répétés de gel-dégel du virus afin de préserver son intégrité. À cette fin, nous aliquotes généralement le virus lorsqu’il est reçu du fabricant en petits volumes (par exemple, 2 μL par tube) et les conservons dans un congélateur à -80 °C. Le virus doit être utilisé le jour de la décongélation et ne doit pas être stocké à 4 °C pour une utilisation à long terme.
5. À l’aide d’un extracteur de micropipette, tirez la micropipette jusqu’à une pointe fine, coupez une petite partie de la pointe avec des ciseaux chirurgicaux et remplissez le tube d’huile minérale. Assurez-vous que la pipette peut aspirer le liquide normalement, puis installez-la sur l’injecteur.
   REMARQUE : Nous avons utilisé une méthode de traction en une étape avec le chauffage réglé à ~60% de la puissance maximale. D’autres extracteurs peuvent être utilisés pour cette étape. L’objectif global est de faire en sorte que la pointe ait un diamètre de ~50 à 100 μm ; un diamètre trop petit affectera l’écoulement du liquide ; Trop épais peut endommager le tissu cérébral de la souris.
6. Allumez tous les instruments, y compris l’appareil d’anesthésie de la souris, l’appareil de maintien de la température (coussin chauffant) et la pompe à vide. De plus, mesurez le poids corporel des souris avant la chirurgie.
   REMARQUE : Au cours de la procédure, nous avons surveillé visuellement la respiration de la souris et avons parfois vérifié la température corporelle pour nous assurer qu’elle était en bon état.
7. Placez la souris dans la chambre à gaz avec 2,5 % d’isoflurane et 1 L d’oxygène/min. Surveillez les conditions respiratoires de la souris pour évaluer l’état de l’anesthésie.
   REMARQUE : La fréquence respiratoire doit être d’environ 1 respiration / s pour garder la souris en bonne santé.
8. Sortez la souris de la chambre à gaz et placez-la sur l’appareil stéréotaxique.
9. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée avant de commencer l’opération suivante. Testez le réflexe de retrait de la pédale en pinçant les coussinets des deux pieds arrière. Si la souris répond au pincement du coussinet plantaire, administrez une anesthésie supplémentaire et testez à nouveau le réflexe avant de continuer.
10. Couvrez le nez de la souris avec un masque et réglez le débit d’isoflurane à 1,5 %. Fixez fermement la tête de la souris à l’aide de barres d’oreille (Figure 2A).
    REMARQUE : Veillez à ne pas fixer les barres d’oreille trop serrées sur la souris car cela pourrait facilement affecter la respiration de la souris et, dans certains cas, causer la mort.
11. Coupez le haut de la tête de la souris avec des ciseaux chirurgicaux et utilisez une crème dépilatoire pour enlever tous les poils restants jusqu’à ce que la peau soit complètement exposée. Appliquez la crème dépilatoire sur le cuir chevelu de la souris, laissez-la reposer pendant environ 5 minutes et utilisez de la gaze pour essuyer la crème.
12. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris.
13. Désinfectez la zone glabre avec un désinfectant à l’iodophore et à l’éthanol à 75 % à l’aide de cotons-tiges.
14. Faites une incision continue le long de la ligne médiane du cuir chevelu à l’aide de ciseaux chirurgicaux (ou d’une lame de scalpel) et coupez une partie du cuir chevelu pour exposer la surface du crâne (Figure 2B). Rincez la surface du crâne avec une solution saline ; Ensuite, retirez le fascia et l’excès de solution saline à l’aide d’une pompe à vide. Répétez ce processus plusieurs fois jusqu’à ce que la zone autour de la plaie cesse de saigner. Essuyez la surface du crâne avec des cotons-tiges pour le garder au sec.
    REMARQUE : Il existe d’autres façons d’enlever le fascia, comme l’essuyer avec une boule de coton ou un coton-tige.
15. Utilisez l’aiguille de positionnement pour ajuster la surface crânienne lorsque le bregma et le lambda sont visibles. Effectuez plusieurs réglages jusqu’à ce que toute la tête soit mise à niveau (l’erreur totale dans la direction de l’axe Z est inférieure à 0,05 mm).
16. Déplacez la pointe de l’aiguille du bregma vers la position cible appropriée. Pour les coordonnées cibles, utilisez le bregma comme point de référence. Marquez les quatre points pour définir le périmètre du site d’injection du virus : A/P : -2,0 mm, M/L : -1,5 mm ; A/P : -2,5 mm, M/L : -1,5 mm ; A/P -2,25 mm, M/L : -1,0 mm ; et A/P -2,25 mm, M/L : -2,0 mm, avec un marqueur effaçable.
    REMARQUE : Ce protocole effectue l’injection du virus et l’implantation du cristallin GRIN dans la même chirurgie. Dans ce protocole, toutes les chirurgies ont été effectuées sur l’hémisphère droit, mais il est concevable que l’un ou l’autre hémisphère puisse être utilisé. Dans la zone d’injection définie par les quatre points mentionnés ci-dessus, injectez le virus en trois doses distinctes de 80 nL à différents endroits. Bien que les trois endroits aient été choisis arbitrairement, nous recommandons qu’ils soient dispersés pour une meilleure propagation du virus. Cela augmentera le nombre de cellules infectées.
17. Faites la craniotomie dans la région avec la micro-perceuse et définissez ces quatre points comme bordure. Arrêtez le forage lorsque le tissu cérébral est visible (Figure 2C).
    REMARQUE : Essayez de percer le crâne lentement. Le foret peut endommager le tissu cérébral en raison d’une force excessive. Un forage lent peut également prévenir la surchauffe du cerveau.
18. Retirez les débris osseux et la dure-mère à l’aide d’une pince ultra fine et rincez constamment cette zone avec une solution saline stérile.
    REMARQUE : Il est normal qu’une petite quantité de saignement se produise pendant cette étape, car certains capillaires se rompent ; Continuez simplement à rincer avec une solution saline jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de saignement.
19. Utilisez le panneau de commande de l’injecteur pour éjecter un peu d’huile minérale afin de générer l’espace nécessaire pour le chargement ultérieur du virus. Remplissez la micropipette avec au moins 240 nL du virus dilué à une vitesse de 100 nL/s.
    REMARQUE : Les bulles d’air dans le tube doivent être évacuées à l’aide du panneau de commande pour garantir que la micropipette distribue la quantité appropriée de liquide. Si le volume de liquide est toujours imprécis après plusieurs essais, envisagez de changer la micropipette et de recommencer. Nous recommandons d’aspirer un virus supplémentaire par rapport au volume d’injection réel ; Cette approche empêche l’injection par inadvertance d’huile minérale dans le cerveau de la souris.
20. Déplacez la micropipette au-dessus de la région de la craniotomie ; ensuite, déplacez-le lentement dans le tissu cérébral jusqu’à l’axe Z ciblé de D/V : 1,70 mm sous la surface du cerveau.
    REMARQUE : De nombreuses références atlas utilisent la surface du crâne comme D/V 0. D’après notre expérience, l’utilisation des coordonnées de la surface du cerveau a permis un ciblage plus fiable pour la DG.
21. Utilisez le panneau de commande pour régler l’injecteur afin qu’il injecte 80 nL du virus à un débit de 1 nL/s (Figure 2D). Cliquez sur le bouton INJECTER sur le panneau de configuration pour injecter le virus. Par la suite, sélectionnez deux autres positions dans la craniotomie et répétez l’opération précédente.
    REMARQUE : Chaque injection prend ~2 min. Après avoir terminé l’injection, attendez 8 à 10 minutes supplémentaires avant de passer à une autre position. En cas de saignement lors de l’enlèvement, laver rapidement avec une solution saline.
22. Retirez lentement la micropipette du cerveau (Figure 2E).

2. Implantation de la lentille GRIN dans le gyrus denté

REMARQUE : Effectuez cette étape immédiatement après avoir terminé l’injection virale de 240 nL.

1. Désinfecter la lentille GRIN de 1 mm de diamètre dans de l’éthanol à 75% pendant 20 min ; Rincez-le correctement avec une solution saline avant l’implantation.
2. Élargissez la craniotomie à l’aide de la micro-perceuse pour augmenter l’ouverture dans la direction A/P à environ 1 mm. Nettoyez les débris avec une solution saline.
3. Fixez la lentille GRIN en place à l’aide d’un support et assurez-vous d’exposer une longueur adéquate.
   REMARQUE : Il est facile de coller le support sur la lentille GRIN lors de sa fixation sur le crâne à l’aide de résine UV dans les étapes suivantes. Cependant, cela peut être évité si la longueur exposée de l’objectif est adéquate.
4. Utilisez le support pour déplacer la lentille GRIN au-dessus de la région de la craniotomie. Réglez la position de l’axe Z à zéro lorsque le bas de la lentille GRIN touche la surface du tissu cérébral. Ensuite, retirez le support d’objectif GRIN et mettez-le de côté.
5. Fixez l’aiguille émoussée Luer Lock 25 G au tube d’aspiration de la pompe à vide et ajustez la pression à 0,04 MPa.
   REMARQUE : Si cette étape est effectuée pour la première fois, la pression peut être réduite de manière appropriée pour aspirer lentement le tissu cérébral.
6. Aspirez le tissu cérébral en faisant tourner la pointe de l’aiguille émoussée près du tissu cérébral et appuyez doucement sur le tissu cérébral pour faciliter l’aspiration. Rincer avec une solution saline (conserver à 4 °C) en continu pendant l’aspiration pour garder une vue dégagée du cerveau. Observez de près les caractéristiques des tissus pour surveiller la profondeur de l’aspiration : le tissu cortical est rose pâle, le corps calleux en dessous apparaît sous forme de tissu fibreux blanc et la couche CA1 de l’hippocampe est rouge foncé et grise. Arrêtez l’aspiration lorsque la surface du tissu devient lisse et qu’une grande surface de CA1 est exposée (Figure 3).
   REMARQUE : Cette étape est essentielle pour le succès de l’ensemble de la procédure et est souvent la partie la plus difficile. Nous avons fourni une liste de problèmes courants pour aider les lecteurs à résoudre cette étape (Tableau 1). De plus, nous recommandons de rincer la plaie en continu avec une solution saline froide, car cela peut réduire les saignements dans une certaine mesure.
   1. Si l’aiguille se bouche ; Fixez l’aiguille bloquée à une seringue et rincez le blocage. Essayez de changer l’aiguille si cela ne fonctionne pas.
   2. Si les saignements sont constants, ils peuvent bloquer la vue du tissu cérébral. Si cela se produit, attendez que le sang coagule, puis rincez-le avec une solution saline.
7. Déplacez le support au-dessus du trou percé. Réglez l’axe Z sur 0 lorsque la lentille GRIN entre en contact avec la surface du tissu cérébral. Si la lentille GRIN dépasse le diamètre du trou, utilisez la micro-perceuse pour agrandir le trou. Ensuite, répétez cette procédure.
8. Insérez la lentille GRIN dans le trou au niveau du D/V : -1,32 mm. Laissez reposer le support pendant 5 à 10 min. Après avoir soulevé le support, rincez le trou avec une solution saline. Répétez cette étape 3 fois (Figure 4A).
   REMARQUE : Il est normal que le tissu cérébral saigne pendant cette étape. Après des rinçages salins répétés, il ne devrait plus y avoir de sang dans le trou. La qualité de l’imagerie est grandement affectée par cette étape, et si le sang n’est pas nettoyé, le champ d’imagerie peut être noir.
9. Utilisez une solution saline pour nettoyer soigneusement le crâne, puis laissez sécher le crâne avant d’appliquer la résine UV.
10. À l’aide d’une aiguille, appliquez la résine UV autour de la lentille GRIN. Éclairez cette zone avec une lampe UV pendant 15 s et assurez-vous que la résine UV devient solide (Figure 4B).
    REMARQUE : Appliquez la résine UV petit à petit et répétez cette opération plusieurs fois jusqu’à ce que la zone autour de la lentille GRIN soit couverte. Veillez à ne pas fixer la lentille GRIN sur le support lors de l’utilisation de la lumière UV pour l’éclairage.
11. Retirez soigneusement le support de la lentille GRIN. Couvrez l’ensemble du crâne exposé avec de la résine UV et placez la plaque frontale sur le crâne dans la position appropriée. Éclairez l’ensemble du crâne et de la plaque frontale avec une lumière UV pendant 15 s (Figure 4C).
    REMARQUE : La plaque de tête est un composant permettant de maintenir solidement la tête de la souris en place lors de la fixation de la plaque de base (voir le fichier supplémentaire 1 pour la conception). Fixez la plaque frontale aussi fermement que possible ; Une plaque de tête détachée entraînera l’échec de toute la chirurgie. D’après notre expérience, une application minutieuse de la résine UV devrait permettre une fixation solide. Si une fixation plus forte est nécessaire, on peut envisager d’installer des vis crâniennes.
12. Couvrez la lentille GRIN exposée avec un capuchon de protection imprimé en 3D (voir le fichier supplémentaire 2 pour la conception). Fixez le capuchon à la plaque de tête à l’aide de vis M1.6 (Figure 4D).
13. Injecter de la dexaméthasone par voie intrapéritonéale (dissoute dans une solution saline à 0,9 %, 2 mg/kg) après l’opération pour prévenir l’inflammation postopératoire. De plus, administrez des injections sous-cutanées de carprofène (dissous dans une solution saline à 0,9 %, 5 mg/kg) pour réduire la douleur postopératoire.
14. Remettez les souris dans la cage et transférez-les dans une couverture thermique pour faciliter leur récupération. Ensuite, transférez les souris dans l’animalerie expérimentale après qu’elles puissent se déplacer librement.
    REMARQUE : Pour éviter d’endommager la plaque de base en se battant, les souris qui ont subi la chirurgie peuvent être logées individuellement ou avec un nombre minimal de cohabitants. Nous recommandons de ne pas dépasser trois souris dans une cage après la chirurgie.
15. Désinfectez les surfaces de travail à l’aide d’une solution d’eau de Javel à 10 %. Retirez l’équipement de protection individuelle (EPI) jetable et jetez-le dans des sacs à risque biologique.
16. Surveillez les souris tous les jours pendant 3 jours après la chirurgie. Enregistrez le poids corporel des souris et observez l’état de cicatrisation de leurs plaies et leurs activités de locomotion. Fournir des injections intrapéritonéales quotidiennes de solutions de dexaméthasone et de carprofène (la même dose qu’à l’étape 2.13) pendant 3 jours. Fournir une nourriture humide ou un traitement pour faciliter la récupération si nécessaire.

3. Vérifiez la qualité du champ d’imagerie

REMARQUE : La souris récupère en 2-3 semaines après la chirurgie avant la première séance d’imagerie calcique in vivo . Le but de cette étape est de vérifier la qualité de la chirurgie et la récupération de la souris. Si l’activité d’une seule cellule peut être observée dans le champ d’imagerie et que la souris est en bon état, fixez la plaque de base sur le crâne de la souris. La souris doit être euthanasiée par luxation cervicale si la qualité de l’imagerie ou l’état de santé n’est pas adéquat.

1. Connectez le boîtier de collecte de données miniscope à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB 3.0. Connectez ensuite le câble coaxial à la boîte via le connecteur To Scope (SMA).
2. Allumez le logiciel de contrôle du miniscope. Dans le logiciel, cliquez sur Sélectionner un fichier de configuration | Fichiers de configuration utilisateur V4 plus pour afficher les images en direct.
3. Utilisez un support personnalisé pour maintenir la souris sur la molette de roulement en serrant la plaque de tête. Tenez le miniscope à l’aide du support de miniscope (fabriqué avec l’impression 3D ; voir le fichier supplémentaire 3 pour la conception) et utilisez un instrument stéréotaxique pour déplacer le miniscope au-dessus de la tête de la souris (Figure 4E).
4. Retirez le capuchon à l’aide d’un tournevis. Essuyez doucement la surface de la lentille GRIN avec de l’éthanol à 75 %. Placez le miniscope juste au-dessus de la lentille GRIN exposée et faites en sorte que la surface inférieure de la lunette soit parallèle à la surface de la lentille. Trouvez le meilleur plan focal en abaissant lentement le miniscope vers l’objectif GRIN.
   REMARQUE : Réglez le plan focal sur 0, puis ajustez la position du miniscope ; Cela offre plus d’espace pour ajuster la mise au point. Sélectionnez le plan focal avec une visualisation claire du plus grand nombre de cellules.
5. Dans le logiciel de contrôle du miniscope, ajustez la puissance de la lumière LED au niveau optimal.
   REMARQUE : Pour observer l’activité d’une seule cellule, le champ d’imagerie ne doit être ni surexposé ni trop sombre. L’intensité des LED est généralement inférieure à 10 %.
6. Si le flux sanguin vasculaire est visible et que les cellules sont nombreuses et uniformément réparties dans le champ d’imagerie, passez à la section suivante de l’expérience.
   REMARQUE : Dans cette étape, il est important de pouvoir observer l’activité d’une seule cellule. Cela peut influencer les résultats de l’analyse des données. Normalement, les activités régionales (taches de fluctuations fluorescentes) sont difficiles à interpréter. Cela peut être une indication que les neurones cibles sont flous du cristallin GRIN. La souris ne sera pas utilisée dans les expériences ultérieures s’il apparaît que le champ d’imagerie est noir, que les cellules présentent une activité régionale ou qu’il n’y a pas assez de cellules.
7. Débranchez le câble du miniscope.

4. Fixez la plaque de base du miniscope au crâne de la souris

1. Fixez la plaque de base au miniscope et réajustez les positions du miniscope pour obtenir un champ de vision avec une bonne qualité d’image.
2. Mélangez les matériaux de base de la prothèse dans le bol à mélanger.
   REMARQUE : Il est important que le mélange ne coule pas trop librement ou ne soit pas trop ferme. Trop de fluidité a tendance à recouvrir la surface du cristallin GRIN, provoquant la perte de champ d’imagerie. S’ils sont trop fermes, les matériaux de base de la prothèse ne pourront pas couvrir étroitement l’espace entre la plaque de base et la plaque de tête.
3. Veillez à ne pas modifier la position du miniscope lors de l’application soigneuse de la première couche de matériaux de base de la prothèse autour de la plaque de base du miniscope. Attendez que la première couche de ciment durcisse avant d’appliquer une deuxième couche de ciment de la plaque de base sur la plaque de tête. Après le durcissement de tous les matériaux de base de la prothèse, desserrez la vis de réglage et détachez le miniscope de la plaque de base.
   REMARQUE : Lorsque vous utilisez des matériaux de base de prothèse, faites attention au champ d’imagerie dans le logiciel et effectuez les ajustements nécessaires avant que le ciment ne se solidifie.
4. Retirez délicatement le bras de maintien du miniscope.
5. Insérez le capuchon de la plaque de base dans la plaque de base pour protéger la lentille GRIN exposée et serrez la vis de réglage (Figure 4F).
6. Remettez la souris dans sa cage d’origine. Donnez à la souris plusieurs jours pour récupérer avant de mener les expériences comportementales.

5. Acquisition de données

REMARQUE : L’imagerie calcique in vivo peut être effectuée simultanément avec n’importe quel test de comportement. Dans ce protocole, nous utilisons la piste linéaire comme exemple. Cette piste linéaire mesure 1,5 m et a de l’eau aux deux extrémités, ce qui sert de récompense pour les souris. Les souris peuvent porter un microscope miniature (miniscope) et courir d’avant en arrière le long de la piste pendant une durée de 20 minutes. Pendant ce temps, les souris sont généralement capables d’effectuer ~60 essais.

1. Connectez le boîtier de collecte de données miniscope à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB 3.0. Connectez ensuite le câble coaxial à la boîte via le connecteur To Scope (SMA).
2. Allumez le logiciel de contrôle du miniscope. Dans le logiciel de contrôle de miniscope, cliquez sur Sélectionner un fichier de configuration | Fichiers de configuration utilisateur V4 plus pour afficher les images en direct.
3. Connectez la caméra industrielle à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB 3.0.
4. Allumez le logiciel de contrôle de l’appareil photo. Dans le logiciel, cliquez sur Ouvrir l’équipement et sélectionnez le fichier pour importer les paramètres de collecte des données. Sélectionnez le format vidéo comme Vidéo non compressée dans le conteneur AVI. Cliquez sur le bouton Démarrer pour afficher les images en direct.
   REMARQUE : Pour réduire la taille du fichier de la vidéo d’enregistrement comportemental, le champ de vision doit exclure toute zone inutile en dehors de la piste.
5. Utilisez un support personnalisé pour maintenir la souris sur la molette de roulement en serrant la plaque de tête.
6. Desserrez la vis de réglage à l’aide d’un tournevis, retirez le capuchon de la plaque de base et nettoyez la surface de la lentille GRIN avec de l’éthanol à 75 %.
7. Montez le miniscope sur sa base. Fixez le miniscope à sa base sur la tête de la souris.
8. Trouvez le meilleur plan focal en faisant glisser le bouton du plan focal.
9. Déplacez doucement la souris de la molette de course vers la piste linéaire.
10. Cliquez sur le bouton Enregistrer et maintenez-le enfoncé pour commencer l’enregistrement avec le miniscope. Ensuite, cliquez sur le bouton Démarrer la collecte pour démarrer l’enregistrement de la caméra. Enregistrez pendant 20 min.
11. Enregistrez séparément les données d’imagerie calcique in vivo , les données comportementales et les données Arduino. Nommez ces fichiers avec la date, le numéro de session et le numéro de souris.
    REMARQUE : Les études qui utilisent un miniscope ont tendance à avoir une période de collecte de données à long terme sur un seul animal de laboratoire. Nommer clairement les fichiers peut faciliter la procédure de traitement des données.
12. Détachez le miniscope de sa base.
13. Fermez le logiciel de contrôle de l’appareil photo, le logiciel de contrôle du miniscope et l’ordinateur.
14. Débranchez le câble coaxial de l’oscilloscope To Scope (SMA) et le câble USB 3.0 de l’appareil photo.
15. Dévissez la vis de réglage dans la base, remettez le capuchon de la plaque de base et serrez la vis.
16. Remettez la souris dans sa cage d’origine.

6. Traitement des données

1. Chargez les données d’imagerie calcique enregistrées dans MATLAB.
   REMARQUE : Nous reconnaissons que l’analyse des données doit être adaptée au plan expérimental. Ici, nous fournissons un pipeline de prétraitement qui convertit la vidéo brute d’imagerie calcique en traces d’activité de cellules individuelles. Nous pensons que cette procédure est relativement universelle et utile pour les utilisateurs. Tous les scripts décrits dans cette section se trouvent dans le fichier supplémentaire 4.
2. Convertissez les données d’imagerie du format AVI au format HDF5 (.h5).
   REMARQUE : La sortie brute du miniscope génère des fichiers AVI avec compression. Les fichiers non compressés ont généralement une taille de plusieurs dizaines de gigaoctets. Le format de fichier HDF5 permet un accès virtuel et partiel qui peut être facilement visualisé et manipulé pour une analyse ultérieure.
3. Appliquez la correction de mouvement non rigide (NoRMCorre)¹⁹.
4. Sous-échantillonnez le film corrigé en fonction du mouvement au cas où la RAM de l’ordinateur serait limitée pour les étapes ultérieures.
   REMARQUE : les données d’origine collectées par le miniscope ont une taille de 600 x 600. En utilisant un sous-échantillonnage spatial, nous pouvons réduire la taille de la vidéo à 200 x 200. Cette méthode réduit considérablement les besoins de stockage des données et permet un traitement plus rapide des données.
5. Appliquez EXTRACT sur les données sous-échantillonnées pour identifier les signaux unicellulaires, en suivant les instructions pour le code EXTRACT dans le référentiel en ligne²⁰ (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public).

Résultats

La figure 1 montre le schéma de la procédure expérimentale, y compris l’injection du virus, l’implantation d’une lentille GRIN, l’affixation de la plaque de base, l’imagerie calcique in vivo via un miniscope et le traitement des données. Généralement, l’ensemble de la procédure prend 1 mois. La figure 2 montre des exemples de procédures d’injection du virus, y compris le positionnement du trou percé sur le crâne et l’état du t...

Discussion

Ici, nous avons décrit une procédure d’imagerie calcique in vivo chez la DG de souris. Nous pensons que ce protocole sera utile pour les chercheurs qui souhaitent étudier les fonctions des DG dans divers processus cognitifs, en particulier dans les cas où une sous-population génétiquement identifiée présente un intérêt. Nous expliquons ici les avantages de notre protocole, en mettant l’accent sur certains points clés de la chirurgie, et discutons des limites de cette méthode.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 μL universal pipette tips	Transcat Pipettes	1030-260-000-9	For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips)	iSmile	20-0105	For removing the brain tissue
3D printed protective cap	N/A	N/A	To protect the GRIN Lens
75% ethanol	Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd	bwsj-230219105303	For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus	Brain Case	BC-0083	For viral injection
Adobe Illustrator	Adobe	cc 2018 version 22.1	To draw figures
Anesthesia air pump	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-30	For anesthesia
Camera control software	Daheng Imaging	Galaxy Windows SDK_CN (V2)	For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder)	RWD Life Science Co.,Ltd	68214	To hold the GRIN lens
Carprofen	MedChemExpress	53716-49-7	To reduce postoperative pain of the mouse
Coax Cable	Open ephys	CW8251	To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope	Olympus Life Science	FV3000	For observing the brain slices
Cotton swab	Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd	20202140438	For disinfection
Customized headplate	N/A	N/A	For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder	N/A	N/A	To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing)	New Centry Dental	430205	For attaching the miniscope
Depilatory cream	Veet	ASIN : B001DUUPQ0	For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M	RWD Life Science Co.,Ltd	68803	For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone	Huachu Co., Ltd.	N/A	To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope	RWD Life Science Co., Ltd	MZ62-WX	For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-31-6	For anesthesia
GRIN lens	GoFoton	CLHS100GFT003	For GRIN lens implantation
GRIN lens	InFocus Grin Corp	SIH-100-043-550-0D0-NC	For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)	RWD Life Science Co.,Ltd	V100	For anesthesia
Industrial camera	Daheng Imaging	MER-231-41U3M-L, VS-0618H1	For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant	Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd	8861F6DFC92A	For disinfection
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10	For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	For viral injection
MATLAB	MathWorks	R2021b	For analyzing the data
Microdrill	RWD Life Science Co.,Ltd	78001	For craniotomy
Micropipette puller	Narishige International USA	PC-100	For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	For viral injection
Miniscope DAQ Software	Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)	N/A	For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)	Open ephys	V3.3	To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4	Open ephys	V4	For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2)	Open ephys	Variant 2	For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-207	For viral injection
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.	H37022025	To keep the eyes moist
PCR tube	LabServ	309101009	For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad)	Lenovo	20W0-005UCD	To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel	Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd	NA-H115	For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	60902	To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	S2	For unscrew the set screws
Set screw	TBD	2-56 cone point set screw	For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co.,Ltd	R500	For anesthesia
Sterile syringe	Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD	20163140236	For rinse the blood
Surgical scissors	RWD Life Science Co.,Ltd	S14016-13	For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl.	RWD Life Science Co.,Ltd	69027	To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps	RWD Life Science Co.,Ltd	F11020-11	For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable	Open ephys	N/A	To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light	Jinshida	66105854002	To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive)	Loctite	32268	To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump	Kylin-Bell	GL-802B	To remove the blood, saline and the brain tissue