JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الدراسة مقايسة هجرة جرح الخدش ثنائية الأبعاد (2D) ومقايسة تنبت كروية ثلاثية الأبعاد (3D) ، جنبا إلى جنب مع طرق تحليل المصب الخاصة بكل منها ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي والكيمياء المناعية ، كمقايسات مناسبة لدراسة تكوين الأوعية في المختبر.

Abstract

يلعب تكوين الأوعية دورا حاسما في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية داخل الجسم بما في ذلك نمو الورم أو أمراض العين الوعائية الحديثة. يعد الفهم التفصيلي للآليات الجزيئية الأساسية ونماذج الفحص الموثوقة أمرا ضروريا لاستهداف الأمراض بشكل فعال وتطوير خيارات علاجية جديدة. تم تطوير العديد من المقايسات في المختبر لنمذجة تكوين الأوعية ، والاستفادة من الفرص التي توفرها البيئة الخاضعة للرقابة لتوضيح الدوافع الوعائية على المستوى الجزيئي وفحص الأهداف العلاجية.

تقدم هذه الدراسة سير العمل للتحقيق في تكوين الأوعية في المختبر باستخدام الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). نحن بالتفصيل مقايسة هجرة جرح الخدش باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية الذي يقيس هجرة الخلايا البطانية في إعداد 2D ومقايسة تنبت كروية تقييم الخلايا البطانية تنبت في إعداد 3D التي توفرها مصفوفة الكولاجين. بالإضافة إلى ذلك ، نحدد استراتيجيات لإعداد العينات لتمكين المزيد من التحليلات الجزيئية مثل علم النسخ ، لا سيما في إعداد 3D ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي وكذلك الكيمياء المناعية. إجمالا ، يوفر هذا الإطار للعلماء مجموعة أدوات موثوقة ومتعددة الاستخدامات لمتابعة استفساراتهم العلمية في مقايسات تكوين الأوعية في المختبر .

Introduction

تكوين الأوعية الدموية ، الذي يشير إلى تكوين أوعية دموية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا1 ، هو عملية حاسمة أثناء التطور الفسيولوجي والظروف المرضية. لا غنى عنه لتوفير الطاقة للأنسجة النشطة للغاية في التمثيل الغذائي مثل شبكية العين2 أو الجهاز العصبي المركزي النامي3 وأثناء شفاء الأنسجة التالفة4. تولد الأوعية غير الطبيعي ، من ناحية أخرى ، هو الأساس للعديد من الأمراض. الأورام الصلبة ، مثل سرطان القولون والمستقيم أو سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، تسهل نموها وإمدادات الطاقة اللازمة من خلال تعزيز تكوين الأوعيةالدموية 5. بصرف النظر عن السرطان ، فإن أمراض الأوعية الدموية الحديثة في العين مثل اعتلال الشبكية السكري أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والتي تمثل الأسباب الرئيسية للعمى في العالم المتقدم ، تنتج عن نمو الأوعية الشاذة 6,7. يعد الفهم التفصيلي للآلية المرضية الأساسية أمرا بالغ الأهمية لفهم كيف يمكن تعزيز تكوين الأوعية الفسيولوجية ، على سبيل المثال ، في التئام الجروح مع التحكم بشكل أفضل في الحالات المرضية مثل أمراض العين التكاثرية الوعائية.

على المستوى الخلوي ، يتم تنشيط الخلايا البطانية الوعائية بواسطة جزيئات إشارات مختلفة في تكوين الأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى تكاثر الخلايا والهجرة8. تنتظم الخلايا لاحقا في تسلسل هرمي ، حيث تشكل خلايا الطرف غير المتكاثرة فيلوبوديا في الحافة الأمامية لفرع الوعاءالنامي 8. إلى جانب ذلك ، تتبع خلايا الساق سريعة التكاثر خلايا الطرف ، مما يساهم في تكوين الوعاء الناشئ. بعد ذلك ، يتم تجنيد أنواع أخرى من الخلايا ، مثل الخلايا المحيطة أو خلايا العضلات الملساء ، لزيادة استقرار الفرعالوليد 9.

لاستكشاف العمليات الجزيئية على مستوى الخلايا البطانية الوعائية ، تم تطوير العديد من البروتوكولات في المختبر ومراجعتها مؤخرا10. تنقسم هذه المقايسات عادة إلى فئتين: مناهج 2D أكثر بساطة ولكنها قابلة للتطوير وبروتوكولات 3D أكثر تفصيلا. في مشروع حديث ، أجرينا تحليلا مقارنا شاملا بين مقايسة هجرة الجروح ثنائية الأبعاد ومقايسة تنبت كروية ثلاثية الأبعاد11 لتقييم مدى اختلافاتها وقدرتها على نمذجة الجوانب المختلفة لتكوين الأوعيةالدموية 12.

في حين أن كلاهما يوفر مزايا كونه موثوقا وقابلا للتنفيذ بسهولة ، على المستوى الجزيئي ، كان اختبار تنبت كروي 3D مواتيا في معالجة الجوانب الرئيسية لتكوين الأوعية مقارنة بالبيانات في الجسم الحي ، مثل مفاتيح التمثيل الغذائي أو تفاعلات مصفوفة الخلية. نظرا لاستخدام مقايسات تكوين الأوعية في المختبر لتقييم إمكانات تعديل الأوعية الدموية لمسارات الإشارات13 وفحص العوامل العلاجية ، فإن قابلية نقل النتائج في المختبر إلى إعدادات الجسم الحي أمر ضروري. علاوة على ذلك ، فإن فرصة التحليلات القائمة على omics على مستويات الحمض النووي الريبي والبروتين لتوصيف التغيرات الجزيئية استجابة للتعديل المستهدف للعمليات الوعائية في ظل ظروف خاضعة للرقابة تظل فائدة مهمة مقارنة بالإعدادات في الجسم الحي 14،15.

في هذا المنشور ، نقدم المقايسات الرئيسية لاستكشاف الأسئلة المتعلقة بتكوين الأوعية من خلال استخدام مقايسة هجرة تصوير الخلايا الحية ومقايسة تنبت كروية ، بما في ذلك التحليلات الجزيئية اللاحقة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي للتحليل النسخي والكيمياء المناعية على مستوى البروتين.

Protocol

1. ثقافة خلايا HUVEC

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية تحت ظروف العمل المعقمة (منضدة العمل المعقمة).

  1. توسيع HUVECs
    1. لكل من مقايسات تكوين الأوعية ، استخدم الخلايا البطانية للوريد السري البشري المجمعة (HUVECs) أو الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية (HMVECs).
    2. قم بزراعة الخلايا حتى تصل إلى التقاء 90٪ في قارورة T75 غير المطلية مع وسط نمو الخلايا البطانية (EGM) قبل إجراء الانقسام. إجراء تغيير متوسط 3 مرات في الأسبوع.
      ملاحظة: لتسريع النمو ، يمكن تغيير الوسيط يوميا. لا تستخدم HUVECs بعد المقطع السادس. تلقت الدراسة النتائج الأكثر اتساقا في جميع التجارب مع HUVECs من نفس المقطع.
  2. تقسيم HUVECs
    1. عندما تصل HUVECs إلى الالتقاء المطلوب في قارورة T75 ، اشطفها مرة واحدة ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، متبوعا باحتضان الخلايا بنسبة 0.5٪ تربسين لمدة 2 دقيقة في الحاضنة.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي التعرض المطول للتربسين إلى إتلاف وظيفة HUVEC.
    2. افصل الخلايا برفق عن طريق النقر على القارورة. تأكد من الانفصال الناجح تحت مجهر تباين الطور المقلوب.
    3. أضف 8 مل من EGM ، وانقل المحلول إلى أنبوب ، وقم بتجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 3 دقائق.
    4. إذا كان عد الخلايا ضروريا ، فأعد تعليق الخلايا في 5 مل من EGM واستخدم غرفة Neubauer. خلاف ذلك ، أضف 40 مل من EGM ووزعها على 4 قوارير زراعة خلايا T75 جديدة.

2. فحص هجرة جرح الخدش

ملاحظة: يتطلب اختبار ترحيل جرح الخدش مدة 3 أيام حتى يكتمل (الشكل 1). قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية تحت ظروف العمل المعقمة (مقعد العمل المعقم).

  1. تصفيح وتجويع الخلايا (اليوم 1)
    1. باستخدام صفيحة متخصصة من 96 بئرا لتصوير الخلايا الحية ، قم بزرع 20000 HUVECs في 100 ميكرولتر من EGM لكل بئر. اسمح للخلايا بالاستقرار لمدة 6 ساعات في الحاضنة.
      ملاحظة: ينصح بتحسين أعداد الخلايا بالنظر إلى السرعة المتفاوتة لنمو الخلايا البطانية الوعائية بين الموردين والمختبرات. الهدف هو تحقيق طبقة أحادية مثالية في اليوم التالي قبل بدء الخدش. يمكن للآبار المكتظة بالسكان تغيير سلوك الخلايا البطانية ، على سبيل المثال ، عن طريق تثبيط الاتصال16 ، في حين أن الطبقة الأحادية غير المكتملة تعيق التحليل بشكل كبير.
    2. تجويع جميع الآبار بين عشية وضحاها مع 100 ميكرولتر من EBM لكل بئر مع استكمال 2٪ FBS.
      ملاحظة: احرص على عدم إتلاف الطبقة الأحادية للخلية ، خاصة عند استخدام ماصة متعددة القنوات.
  2. تحضير محاليل التحفيز (اليوم 2)
    1. تمييع المواد المرغوبة والضوابط في الوسط القاعدي لنمو الخلايا البطانية (EBM) المكمل ب 2٪ FBS. لكل بئر ، استخدم 100 ميكرولتر من المحلول.
      ملاحظة: EBM المكمل ب 2٪ FBS يعمل كعنصر تحكم سلبي ، بينما يمكن استخدام عامل نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية المؤتلف (VEGF) عند 25 نانوغرام / مل كعنصر تحكم إيجابي. باستخدام ألواح 96 بئرا ، يوصى بتصميم التجارب بحد أدنى من النسخ المتماثلة التقنية (4 آبار بظروف متطابقة) ، على الرغم من أنه يقترح استخدام 8 للحصول على أفضل النتائج. احرص على تقليل تأثيرات الحافة أو الزاوية المحتملة عند التخطيط للتخطيط.
  3. إنشاء الصفر (اليوم 2)
    1. افحص الخلايا تحت المجهر للتحقق من وجود طبقة أحادية متقاربة للخلية وصلاحية الخلية. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا في أداة صانع الجروح ذات 96 بئرا وقم بإنشاء الخدش عن طريق الضغط لأسفل على ذراع الجهاز. ارفع غطاء أداة صانع الجروح بعناية قبل تحرير الرافعة لمنع الخدش المزدوج.
    2. اغسل جميع الآبار مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من EBM لكل بئر مع 2٪ FBS. تأكد تحت المجهر من إزالة الحطام بنجاح.
  4. تحفيز الخلايا (اليوم 2)
    1. أضف 100 ميكرولتر من محاليل التحفيز أو التحكم المعدة لكل بئر.
  5. التصوير (اليوم 2-3)
    1. احصل على الصور مرة واحدة في الساعة لمدة تصل إلى 24 ساعة باستخدام جدول زمني تلقائي يوفره مجهر التصوير بالخلايا الحية.
      ملاحظة: لضمان جودة صورة جيدة ، قم بمسح كل بئر فور نقلها إلى الحاضنة التي تضم نظام تصوير الخلايا الحية. يساعد وقت التأقلم لمدة 30 دقيقة في الحاضنة في الحصول على جودة صورة أفضل. تمت برمجة برنامج المجهر للحصول على صورة واحدة في الساعة لكل بئر عند خط الوسط للخدش المحدد.
  6. في حالة عدم وجود أداة صنع الجروح وتصوير الخلايا الحية ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. استخدم طرف ماصة في لوحة 24 بئرا للحث على حدوث خدش. التقط صورا باستخدام مجهر زراعة الخلايا الكلاسيكي على فترات زمنية محددة. لهذا الغرض ، استخدم مجهرا آليا مزودا بقدرات تتبع دقيقة x و y. يتيح ذلك تحديد المواقع تلقائيا ، مما يضمن التقاط صور متسقة في مواقع محددة مسبقا.
      ملاحظة: عندما يكون التصوير اليدوي ضروريا ، يكون خيارا قابلا للتطبيق لتصوير T0 فقط بالإضافة إلى نقطة زمنية واحدة "x" بعد ساعات من العلاج. في البروتوكول الموصوف باستخدام HUVECs ، كانت النقطة الزمنية T12 (12 ساعة بعد التحفيز) نقطة زمنية جذابة مع فصل واضح بين التحكم الإيجابي السلبي والمحفز ب VEGF. ومع ذلك ، يوصى بإجراء تجارب دورة زمنية أولية مع التصوير كل 2 ساعة أو 1 ساعة لتحديد النقطة الزمنية المثلى للإعدادات التجريبية المحددة في كل مختبر.
  7. التحليل (اليوم 3)
    1. قد يتيح برنامج مجهر تصوير الخلايا الحية التحليل المباشر للصور المكتسبة. حدد الأقنعة التي تحدد حديقة الخلية والخدش الأولي ومناطق كثافة الجرح النسبية. تحديد حدود الخلايا بناء على اختلافات التباين.
      ملاحظة: تم استخدام تعديل تجزئة 1.6 ، وملف ثقب 500 ميكرومتر2 ، وحجم معدل 1 بكسل ، ومساحة >500 ميكرومتر ، وانحراف مركزي >0.6 للتجارب التي أجريت مع HUVECs. من الضروري إجراء فحص بصري شامل لمعلمات اكتشاف الخلايا بالنسبة للصور الفعلية. من خلال التكوينات المحسنة ، يحسب البرنامج كثافة الجرح النسبية (RWD) بمرور الوقت تلقائيا ويولد الرسوم البيانية الزمنية المقابلة مع الانحراف المعياري (SD) للنسخ المتماثلة التقنية. يمكن بعد ذلك استخدام هذه البيانات للتحليل الإحصائي.

3. استخراج الحمض النووي الريبي مع الخلايا المزروعة 2D

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية حتى الخطوة 3.3 تحت ظروف العمل المعقمة (منضدة العمل المعقمة).

  1. خلايا الطلاء (اليوم 1)
    1. افصل HUVECs وفقا للخطوة 1.2 من بروتوكول زراعة الخلايا HUVEC.
    2. بذر 50000 خلية لكل بئر في صفيحة 12 بئرا مع 2 مل من EGM لكل بئر.
    3. قم بتغيير الوسط بعد 6 ساعات إلى EBM الذي يحتوي على 2٪ FBS (وسائط جائعة) للتجويع بين عشية وضحاها.
  2. علاج الخلايا (اليوم 2)
    1. عوامل تمييع الفائدة في EBM تستكمل مع 2 ٪ FBS. استبدل الوسائط الجائعة بالتخفيف المحضر واحتضان الخلايا للوقت المطلوب في حاضنة.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي (اليوم 2-3)
    1. تحلل الخلايا ب 750 ميكرولتر من Trizol لكل بئر واحتضانها لمدة 10 دقائق على شاكر مداري.
    2. أعد تعليق العينات باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر عدة مرات ثم قم بتخزينها في أنابيب RNA محددة منخفضة الارتباط (حجم 1.5 مل). يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

4. الكيمياء المناعية مع الخلايا المزروعة 2D

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية حتى الخطوة 4.4 في ظل ظروف العمل المعقمة (منضدة العمل المعقمة).

  1. إعداد أغطية
    1. احتضان 100 غطاء بقطر 12 مم في هيدروكسيد البوتاسيوم 5٪ في الميثانول في أنبوب سعة 50 مل لمدة 30 دقيقة أثناء هز المحلول المطبق.
      ملاحظة: هذه خطوة مهمة جدا في إزالة البروتون من سطح أغطية الغطاء وتحسين ظروف الطلاء والثقافة. في هذه المرحلة ، يوصى بشدة بالتأكد من توزيع أغطية الغطاء جيدا داخل الوسط وعدم تجفيفها ولصقها معا.
    2. اغسل أغطية الملابس لمدة 30 دقيقة 4 مرات بالماء منزوع المعادن.
    3. بعد الغسيل ، قم بنقلها إلى محلول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ للتخزين.
  2. طلاء أغطية
    1. اتكئ على أغطية الغطاء بشكل فردي على جدار طبق بتري مربع للسماح بتبخر كحول الأيزوبروبيل.
    2. بعد 5 دقائق ، انقل أغطية الغطاء إلى صفيحة بئر 24 (غطاء واحد لكل بئر). ضع 1 مل من محلول 10 مجم / مل من الكولاجين I في برنامج تلفزيوني على كل بئر واحتضانه لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. ثم اغسل أغطية الغطاء 4-5 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني.
  3. زراعة الخلايا
    1. فصل HUVECs باتباع الإجراءات الموضحة في الخطوة 1.2 من بروتوكول زراعة الخلايا HUVEC.
    2. بذر 50000 خلية لكل بئر في صفيحة 24 بئرا مع 2 مل من EGM لكل بئر.
    3. بعد 6 ساعات ، قم بتغيير الوسط إلى EBM الذي يحتوي على 2٪ FBS للسماح للخلايا بالالتصاق بالبئر وتجويع الخلايا طوال الليل.
    4. في اليوم التالي ، استكمل وكلاء الفائدة المخففون في EBM بنسبة 2٪ FBS. استبدل محلول الجوع في الآبار بالتخفيف المحضر واحتضان الخلايا للوقت المطلوب في حاضنة.
  4. التثبيت والحجب
    1. قم بزراعة الخلايا للوقت المطلوب ، ثم اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    2. ثبت الخلايا التي تحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. يغسل مع برنامج تلفزيوني 3-4 مرات لمدة 5 دقائق.
    4. احتضان العينات مع المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 5٪ مصل الماعز الطبيعي (NGS) ، 0.1٪ Triton-X-100 في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، من المهم غسل العينات لضمان إزالة PFA تماما. اختر نوع المصل بناء على أصل الجسم المضاد الثانوي.
  5. تلطيخ
    1. احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية في المخزن المؤقت المانع باستخدام الجسم المضاد الأساسي.
    2. في اليوم التالي ، لإزالة أي جسم مضاد أولي غير منضم ، اغسل العينات 3-4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منها.
    3. بعد ذلك ، احتضان العينات لمدة 1 ساعة في RT مع الجسم المضاد الثانوي المقابل و Phalloidin-FITC ، المخفف معا في المخزن المؤقت للحظر.
    4. اغسل 3-4 مرات إضافية.
    5. اقلب الغطاء على الشرائح باستخدام قطرة صغيرة من وسيط التثبيت المحتوي على DAPI ، واتركه يجف في الظلام ، وأغلقه بطلاء الأظافر. قم بتخزين العينات في الظلام عند 4 درجات مئوية.

5. مقايسة تنبت كروية

ملاحظة: يتطلب اختبار تنبت كروي 3 أيام للاكتمال (الشكل 2). قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية حتى الخطوة 5.7 تحت ظروف العمل المعقمة (مقعد العمل المعقم).

  1. توليد كرويات في قطرات معلقة (اليوم 1)
    1. فصل HUVECs باتباع الإجراءات الموضحة في الخطوة 1.2 من بروتوكول زراعة الخلايا HUVEC.
    2. اجمع بين 200000 خلية مع 8 مل من EGM و 2 مل من محلول مخزون الميثوسيل ، مما يضمن الخلط الشامل. يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 1 للحصول على تعليمات حول إعداد محلول مخزون الميثوسيل.
    3. ضعي قطرات 25 ميكرولتر من المحلول على السطح الداخلي المقلوب لطبق بتري كبير مربع. قم بتدوير الغطاء برفق بمقدار 180 درجة وضعه في الجزء السفلي من وعاء زراعة الخلايا بحيث تتدلى القطرات. ضع الوعاء في حاضنة زراعة الخلايا طوال الليل.
  2. تحضير هلام الكولاجين (اليوم 2)
    1. امزج جيدا 2.3 مل من كولاجين ذيل الفئران من النوع الأول مع 0.280 مل من 10x متوسط 199 حتى يحقق الخليط لونا أصفر متساويا باستمرار. الحفاظ على هذا الخليط على الجليد طوال العملية برمتها.
  3. معايرة هلام الكولاجين (اليوم 2)
    1. قم بمعايرة الخليط لتحقيق درجة حموضة فسيولوجية ، يشار إليها باللون البرتقالي ، باستخدام NaOH (2 N).
    2. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES إلى المنتج النهائي.
      ملاحظة: لضمان النطاق الديناميكي الأمثل للمقايسة ، من الضروري الاقتراب قدر الإمكان من درجة الحموضة الفسيولوجية. قد تتطلب دفعات مختلفة من الكولاجين كميات مختلفة من هيدروكسيد الصوديوم. حافظ على الخليط جيدا على الجليد طوال العملية واخلطه بشكل متجانس طوال الوقت.
  4. حصاد الكرويات (اليوم 2)
    1. شطف قطرات معلقة من أغطية ثقافة الخلية مع 20 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. جهاز طرد مركزي الحل لمدة 7 دقائق في 250 × غرام. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الأجسام الكروية في 0.1 مل من FBS و 0.4 مل من EGM عن طريق النقر برفق على الأنبوب.
    3. أضف 2 مل من محلول مرق الميثوسيل واخلطه جيدا. استخدم ماصة بسعة لا تقل عن 5 مل لتجنب إتلاف الأجسام الكروية.
  5. إضافة كرويات إلى مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد (اليوم 2)
    1. أضف 2 مل من خليط الكولاجين المحضر إلى الكرويات المعاد تعليقها واخلطها جيدا.
    2. استغني عن 0.5 مل من الخليط الناتج في آبار صفيحة 24 بئرا واحتضانها في حاضنة الخلايا لمدة 30 دقيقة.
  6. تحفيز الأجسام الكروية في مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد (اليوم 2)
    1. تحضير تخفيف المواد المرغوبة في EBM. لكل بئر ، استخدم 100 ميكرولتر من المحلول.
      ملاحظة: يعمل EBM كعنصر تحكم سلبي ، بينما يمكن استخدام عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) عند 25 نانوغرام / مل (التركيز النهائي في 500 ميكرولتر من مصفوفة الكولاجين وطبقة EBM 100 ميكرولتر) كعنصر تحكم إيجابي.
    2. احتضان للوقت المطلوب.
      ملاحظة: في الفحص القياسي ، يوصى ب 18-24 ساعة ، ولكن يجب تحسين التوقيت بعناية في كل مختبر.
  7. تصوير كرويات (اليوم 3)
    1. استخدم مجهرا مقلوبا ومنصة تصوير لالتقاط صور لجميع الأجسام الكروية غير الملامسة لحافة البئر أو مع بعضها البعض أو تظهر عليها علامات التلف. حافظ على إعدادات متسقة ومستويات التكبير/التصغير في جميع الظروف.
  8. التحليل (اليوم 3)
    1. استخدم أداة القياس في ImageJ Fiji للتأكد من طول جميع البراعم من كل كروية في كل صورة.
      ملاحظة: استخدم المكون الإضافي الموجود في الملف التكميلي 2 ، مما يجعل التحليل أكثر كفاءة ويولد ملف .txt الإخراج.
    2. قم باستيراد البيانات إلى جدول بيانات أو R أو أي برنامج مفضل آخر ، واستخدم متوسط الطول التراكمي لجميع البراعم لكل كروي كقراءة لكل حالة.
      ملاحظة: لا يمكن الجمع بين النتائج من المواد الهلامية المختلفة في شكل أطوال تنبت مطلقة. يجب تطبيع البيانات من كل مجموعة معالجة إلى مجموعة التحكم EBM أو VEGF (طول النبتة النسبي) قبل دمج البيانات.

6. استخراج الحمض النووي الريبي مع الخلايا المزروعة 3D

  1. مقايسة تنبت كروية
    1. قم بإجراء مقايسة تنبت كروية كما هو موضح في القسم 5.
  2. تحلل هلام الكولاجين
    1. اغسل المواد الهلامية الكروية مع برنامج تلفزيوني دافئ لمدة 5 دقائق.
    2. قطع المواد الهلامية كروية إلى أرباع ونقل كل 4 أرباع في أنبوب 50 مل. استخدام مشرط للتشريح الميكانيكي للمواد الهلامية.
    3. عالج عينات الجل بمحلول تحلل (يحتوي على 2 ملغ / مل كولاجيناز D في برنامج تلفزيوني) واحتضانها لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر.
    4. اغسل المواد الهلامية برفق باستخدام برنامج تلفزيوني مكمل ب 2 مللي متر EDTA لإيقاف تفاعل المخزن المؤقت للتحلل.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. أعد تعليق المواد الهلامية المحللة في 750 ميكرولتر من Trizol واحتضانها لمدة 10 دقائق لضمان استخراج الحمض النووي الريبي الكافي كما هو موضح في الخطوة 3.3.
    2. أعد تعليق العينات باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر عدة مرات وانقل العينات إلى أنابيب RNA محددة منخفضة الارتباط (حجم 1.5 مل). قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

7. الكيمياء المناعية للكرويات في مصفوفة الكولاجين 3D

  1. مقايسة تنبت كروية
    1. قم بإجراء مقايسة تنبت كروية كما هو موضح في القسم 5.
  2. التثبيت والحجب
    1. إصلاح المواد الهلامية مع 4 ٪ PFA في PBS لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: لضمان التثبيت الجيد للخلايا الموجودة في الجل ، يجب فصل المواد الهلامية بعناية على جوانب الآبار بمشرط وملاقط بعد الشطف باستخدام برنامج تلفزيوني.
    2. اغسل المواد الهلامية برفق 3-4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ثم افصلها تماما عن سطح الآبار وانقلها إلى ألواح جديدة من 24 بئرا.
    3. احتضان المواد الهلامية لمدة 1 ساعة في RT مع محلول الحجب (يحتوي على 5٪ NGS و 0.1٪ Triton-X-100 في PBS) على شاكر مداري.
  3. تلطيخ
    1. احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري مع الجسم المضاد الأساسي المخفف في المخزن المؤقت المانعة.
      ملاحظة: لم يؤد تحويل المواد الهلامية أثناء هذه الحضانة إلى تحسين جودة التلطيخ.
    2. في اليوم التالي ، اغسل المواد الهلامية برفق 4-5 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. احتضان الجسم المضاد الثانوي المقابل ، المخفف ب Phalloidin-FITC في حجب المخزن المؤقت طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر المدار.
    4. قم بإجراء 4-5 خطوات غسيل إضافية باستخدام برنامج تلفزيوني.
    5. انقل المواد الهلامية إلى شرائح المجهر وقم بتركيبها بقطرتين من وسيط التثبيت المحتوي على DAPI على غطاء يوضع على كل هلام. اترك العينات تجف قبل إغلاقها بطلاء الأظافر وقم بتخزينها في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  4. مجهريه
    1. صور جميع العينات على مجهر متحد البؤر. استخدم هدف 20x وركز على منطقة الاهتمام. احصل على الصور على شكل مكدسات Z ، بالإضافة إلى صور المستوى البؤري الفردية.
      ملاحظة: يعد الحصول على صور Z-stack والمستوى البؤري في أقسام متعددة في جميع أنحاء عينة 3D أمرا ضروريا لالتقاط التمثيل الكامل ، خاصة بالنسبة للعينات ثلاثية الأبعاد السميكة.

8. الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية (HRMVECs)

ملاحظة: يمكن أيضا تنفيذ جميع الخطوات الموضحة باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة ، على سبيل المثال ، الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية (HRMVECs). في هذه الحالة ، يجب تحويل الوسط إلى وسط خلية بطانية وعائية دقيقة محددة تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) للزراعة بالإضافة إلى خطوات محددة في كل فحص. وترد أدناه الاختلافات الخاصة بلجنة إدارة الموارد البشرية والمالية والنقدية لبروتوكولات المقايسة:

  1. فحص جرح الخدش
    1. زراعة الخلايا في 10٪ FBS وسط الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة بدلا من EGM.
    2. بذرة 20000 خلية / بئر.
    3. لا تجوع الخلايا بين عشية وضحاها.
    4. بعد إجراء الخدش ، قم بتغيير وسط الخلية البطانية المتوسطة إلى القاعدية التي تحتوي على 5٪ FBS بدلا من EBM مع 2٪ FBS.
  2. الكيمياء المناعية ل 2D HRMVECs المزروعة
    1. زراعة الخلايا في 10٪ من وسط الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة بدلا من EGM.
    2. لا تجوع الخلايا بين عشية وضحاها.
    3. قم بتغيير الوسيط قبل العلاج مباشرة إلى EBM + 5٪ FBS بدلا من EBM + 2٪ FBS.
  3. مقايسة تنبت كروية
    1. قم بزرع الخلايا كقطرات معلقة مع وسط خلية بطانية للأوعية الدموية الدقيقة تحتوي على 10٪ FBS بدلا من EGM.
  4. الكيمياء المناعية للكرويات في مصفوفة الكولاجين 3D
    1. قم بزرع الخلايا كقطرات معلقة مع وسط خلية بطانية للأوعية الدموية الدقيقة تحتوي على 10٪ FBS بدلا من EGM.

النتائج

بالنسبة لفحص الترحيل ، من الأهمية بمكان إجراء فحص شامل للصور الملتقطة عند النقطة الزمنية t = 0 h لضمان اكتشاف النظام بدقة وجود طبقة أحادية الخلية كاملة التكوين (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك ، يجب تأكيد وضوح واستقامة حدود الخدش (الشكل 1 ب). يجب أن تكون المنطقة الخا?...

Discussion

في هذا التقرير ، قدمنا مجموعة من التقنيات مع قراءات وظيفية وجزيئية لدراسة تكوين الأوعية في المختبر.

يمثل اختبار الهجرة تقنية راسخة تستخدم في جميع مجالات العمل المختبري الرطب. لقد اخترنا نهج تصوير الخلايا الحية المتاح تجاريا للاستفادة من تنسيق 96 بئرا المناسب لتجارب ا?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح في هذا المشروع.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون صوفي كروجر وغابرييل برينز على دعمهما الفني الممتاز. نشكر سيباستيان ماير على تطوير المكون الإضافي ImageJ لتحديد براعم الكرة الأرضية ومرفق المنارة الأساسي ، Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ) ، قسم الطب الأول ، مستشفى جامعة فرايبورغ لاستخدام نظام IncuCyte. تم إنشاء الرسومات باستخدام biorender.com. تم دعم هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135 / 3-1 + Bu3135 / 3-2 to F.B] ، و Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-Program للعلماء السريريين والعلماء السريريين المتقدمين إلى F.B.] ، و Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 to F.B.] و "زمالة CORTEX للعلماء السريريين إلى JR] و Volker Homann Stiftung [إلى JN + F.B.] و "Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg إ. ف." [إلى P.L.]

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-FragmentJackson IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tailCorning354236
Collagenase DRoche 11088858001
Endothelial Cell Basal MediumLonzaCC-3156EBM
Endothelial Cell Growth MediumLonzaCC-3162EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid Serva11290.02EDTA
Fetal bovine serumBio&SELLS 0615FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooledLonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates Sartorius4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis SystemSartorius
MethocelSigmam-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
Phosphate-buffered salineThermo Fisher Scientfic14190-094PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial CellsCell SystemsACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlueInvitrogen by ThermoFisher Scientific2260939
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth FactorPeproTech100-20VEGF
Squared petri dishGreiner688102
TrizolQiagen79306
TrypsinPAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
WoundMakerSartorius4493

References

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Gariano, R. F., Gardner, T. W. Retinal angiogenesis in development and disease. Nature. 438 (7070), 960-966 (2005).
  3. Mancuso, M. R., Kuhnert, F., Kuo, C. J. Developmental angiogenesis of the central nervous system. Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 173-180 (2008).
  4. Tonnesen, M. G., Feng, X., Clark, R. A. Angiogenesis in wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 40-46 (2000).
  5. Folkman, J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis. Semin Oncol. 29, 15-18 (2002).
  6. Crawford, T. N., Alfaro, D. V., Kerrison, J. B., Jablon, E. P. Diabetic retinopathy and angiogenesis. Curr Diabetes Rev. 5 (1), 8-13 (2009).
  7. Ng, E. W., Adamis, A. P. Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration. Can J Ophthalmol. 40 (3), 352-368 (2005).
  8. Blanco, R., Gerhardt, H. Vegf and notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), 006569 (2013).
  9. Hellström, M., Kalén, M., Lindahl, P., Abramsson, A., Betsholtz, C. Role of PDGF-B and PDGFR-β in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse. Development. 126 (14), 3047-3055 (1999).
  10. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
  11. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. J Cell Sci. 112, 3249-3258 (1999).
  12. Rapp, J., et al. 2D and 3D in vitro angiogenesis assays highlight different aspects of angiogenesis. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1870 (3), 167028 (2024).
  13. Rapp, J., et al. STAT3 signaling induced by the IL-6 family of cytokines modulates angiogenesis. J Cell Sci. 136 (1), 260182 (2023).
  14. Heiss, M., et al. Endothelial cell spheroids as a versatile tool to study angiogenesis in vitro. FASEB J. 29 (7), 3076-3084 (2015).
  15. Rapp, J., et al. Oncostatin m reduces pathological neovascularization in the retina through müller cell activation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (1), 22 (2024).
  16. Fagotto, F., Gumbiner, B. M. Cell contact-dependent signaling. Dev Biol. 180 (2), 445-454 (1996).
  17. Rapp, J., et al. Addressing bias in manual segmentation of spheroid sprouting assays with U-Net. Mol Vis. 29, 197-205 (2023).
  18. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  19. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the Boyden chamber assay. J Vis Exp. (129), e56337 (2017).
  20. Decicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312 (2014).
  21. Vernon, R. B., Angello, J. C., Iruela-Arispe, M. L., Lane, T. F., Sage, E. H. Reorganization of basement membrane matrices by cellular traction promotes the formation of cellular networks in vitro. Lab Invest. 66 (5), 536-547 (1992).
  22. Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology. Microvasc Res. 55 (1), 65-76 (1998).
  23. Müller, A. M., Hermanns, M. I., Cronen, C., Kirkpatrick, C. J. Comparative study of adhesion molecule expression in cultured human macro-and microvascular endothelial cells. Exp Mol Pathol. 73 (3), 171-180 (2002).
  24. Chiew, G. G. Y., Wei, N., Sultania, S., Lim, S., Luo, K. Q. Bioengineered three-dimensional co-culture of cancer cells and endothelial cells: A model system for dual analysis of tumor growth and angiogenesis. Biotechnol Bioeng. 114 (8), 1865-1877 (2017).
  25. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (1), 101-111 (1994).
  26. Lambert, V., et al. Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice. Nat Protoc. 8 (11), 2197-2211 (2013).
  27. Kastana, P., et al. Matrigel plug assay for in vivo evaluation of angiogenesis. Methods Mol Biol. 1952, 219-232 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HUVEC 2D 3D Transcriptomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved