التحقيق في تكوين الأوعية الدموية على المستوى الوظيفي والجزيئي من خلال الاستفادة من مقايسة هجرة جرح الخدش ومقايسة تنبت كروية

Summary

تقدم هذه الدراسة مقايسة هجرة جرح الخدش ثنائية الأبعاد (2D) ومقايسة تنبت كروية ثلاثية الأبعاد (3D) ، جنبا إلى جنب مع طرق تحليل المصب الخاصة بكل منها ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي والكيمياء المناعية ، كمقايسات مناسبة لدراسة تكوين الأوعية في المختبر.

Abstract

يلعب تكوين الأوعية دورا حاسما في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية داخل الجسم بما في ذلك نمو الورم أو أمراض العين الوعائية الحديثة. يعد الفهم التفصيلي للآليات الجزيئية الأساسية ونماذج الفحص الموثوقة أمرا ضروريا لاستهداف الأمراض بشكل فعال وتطوير خيارات علاجية جديدة. تم تطوير العديد من المقايسات في المختبر لنمذجة تكوين الأوعية ، والاستفادة من الفرص التي توفرها البيئة الخاضعة للرقابة لتوضيح الدوافع الوعائية على المستوى الجزيئي وفحص الأهداف العلاجية.

تقدم هذه الدراسة سير العمل للتحقيق في تكوين الأوعية في المختبر باستخدام الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). نحن بالتفصيل مقايسة هجرة جرح الخدش باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية الذي يقيس هجرة الخلايا البطانية في إعداد 2D ومقايسة تنبت كروية تقييم الخلايا البطانية تنبت في إعداد 3D التي توفرها مصفوفة الكولاجين. بالإضافة إلى ذلك ، نحدد استراتيجيات لإعداد العينات لتمكين المزيد من التحليلات الجزيئية مثل علم النسخ ، لا سيما في إعداد 3D ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي وكذلك الكيمياء المناعية. إجمالا ، يوفر هذا الإطار للعلماء مجموعة أدوات موثوقة ومتعددة الاستخدامات لمتابعة استفساراتهم العلمية في مقايسات تكوين الأوعية في المختبر .

Introduction

تكوين الأوعية الدموية ، الذي يشير إلى تكوين أوعية دموية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا¹ ، هو عملية حاسمة أثناء التطور الفسيولوجي والظروف المرضية. لا غنى عنه لتوفير الطاقة للأنسجة النشطة للغاية في التمثيل الغذائي مثل شبكية العين² أو الجهاز العصبي المركزي النامي³ وأثناء شفاء الأنسجة التالفة⁴. تولد الأوعية غير الطبيعي ، من ناحية أخرى ، هو الأساس للعديد من الأمراض. الأورام الصلبة ، مثل سرطان القولون والمستقيم أو سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، تسهل نموها وإمدادات الطاقة اللازمة من خلال تعزيز تكوين الأوعية^{الدموية 5}. بصرف النظر عن السرطان ، فإن أمراض....

Protocol

1. ثقافة خلايا HUVEC

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية تحت ظروف العمل المعقمة (منضدة العمل المعقمة).

1. توسيع HUVECs
   1. لكل من مقايسات تكوين الأوعية ، استخدم الخلايا البطانية للوريد السري البشري المجمعة (HUVECs) أو الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية (HMVECs).
   2. قم بزراعة الخلايا حتى تصل إلى التقاء 90٪ في قارورة T75 غير المطلية مع وسط نمو الخلايا البطانية (EGM) قبل إجراء الانقسام. إجراء تغيير متوسط 3 مرات في الأسبوع.
      ملاحظة: لتسريع النمو ، يمكن تغيير الوسيط يوميا. لا تستخدم HUVECs بعد المقطع السادس. تلقت الدراسة النتائج الأكثر اتساقا في جميع التجارب مع HUVECs من نفس المقطع.
....

النتائج

بالنسبة لفحص الترحيل ، من الأهمية بمكان إجراء فحص شامل للصور الملتقطة عند النقطة الزمنية t = 0 h لضمان اكتشاف النظام بدقة وجود طبقة أحادية الخلية كاملة التكوين (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك ، يجب تأكيد وضوح واستقامة حدود الخدش (الشكل 1 ب). يجب أن تكون المنطقة الخا?.......

Discussion

في هذا التقرير ، قدمنا مجموعة من التقنيات مع قراءات وظيفية وجزيئية لدراسة تكوين الأوعية في المختبر.

يمثل اختبار الهجرة تقنية راسخة تستخدم في جميع مجالات العمل المختبري الرطب. لقد اخترنا نهج تصوير الخلايا الحية المتاح تجاريا للاستفادة من تنسيق 96 بئرا المناسب لتجارب ا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493