A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الدراسة مقايسة هجرة جرح الخدش ثنائية الأبعاد (2D) ومقايسة تنبت كروية ثلاثية الأبعاد (3D) ، جنبا إلى جنب مع طرق تحليل المصب الخاصة بكل منها ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي والكيمياء المناعية ، كمقايسات مناسبة لدراسة تكوين الأوعية في المختبر.

Abstract

يلعب تكوين الأوعية دورا حاسما في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية داخل الجسم بما في ذلك نمو الورم أو أمراض العين الوعائية الحديثة. يعد الفهم التفصيلي للآليات الجزيئية الأساسية ونماذج الفحص الموثوقة أمرا ضروريا لاستهداف الأمراض بشكل فعال وتطوير خيارات علاجية جديدة. تم تطوير العديد من المقايسات في المختبر لنمذجة تكوين الأوعية ، والاستفادة من الفرص التي توفرها البيئة الخاضعة للرقابة لتوضيح الدوافع الوعائية على المستوى الجزيئي وفحص الأهداف العلاجية.

تقدم هذه الدراسة سير العمل للتحقيق في تكوين الأوعية في المختبر باستخدام الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). نحن بالتفصيل مقايسة هجرة جرح الخدش باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية الذي يقيس هجرة الخلايا البطانية في إعداد 2D ومقايسة تنبت كروية تقييم الخلايا البطانية تنبت في إعداد 3D التي توفرها مصفوفة الكولاجين. بالإضافة إلى ذلك ، نحدد استراتيجيات لإعداد العينات لتمكين المزيد من التحليلات الجزيئية مثل علم النسخ ، لا سيما في إعداد 3D ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي وكذلك الكيمياء المناعية. إجمالا ، يوفر هذا الإطار للعلماء مجموعة أدوات موثوقة ومتعددة الاستخدامات لمتابعة استفساراتهم العلمية في مقايسات تكوين الأوعية في المختبر .

Introduction

تكوين الأوعية الدموية ، الذي يشير إلى تكوين أوعية دموية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا1 ، هو عملية حاسمة أثناء التطور الفسيولوجي والظروف المرضية. لا غنى عنه لتوفير الطاقة للأنسجة النشطة للغاية في التمثيل الغذائي مثل شبكية العين2 أو الجهاز العصبي المركزي النامي3 وأثناء شفاء الأنسجة التالفة4. تولد الأوعية غير الطبيعي ، من ناحية أخرى ، هو الأساس للعديد من الأمراض. الأورام الصلبة ، مثل سرطان القولون والمستقيم أو سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، تسهل نموها وإمدادات الطاقة اللازمة من خلال تعزيز تكوين الأوعيةالدموية 5. بصرف النظر عن السرطان ، فإن أمراض....

Protocol

1. ثقافة خلايا HUVEC

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية تحت ظروف العمل المعقمة (منضدة العمل المعقمة).

  1. توسيع HUVECs
    1. لكل من مقايسات تكوين الأوعية ، استخدم الخلايا البطانية للوريد السري البشري المجمعة (HUVECs) أو الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية (HMVECs).
    2. قم بزراعة الخلايا حتى تصل إلى التقاء 90٪ في قارورة T75 غير المطلية مع وسط نمو الخلايا البطانية (EGM) قبل إجراء الانقسام. إجراء تغيير متوسط 3 مرات في الأسبوع.
      ملاحظة: لتسريع النمو ، يمكن تغيير الوسيط يوميا. لا تستخدم HUVECs بعد المقطع السادس. تلقت الدراسة النتائج الأكثر اتساقا في جميع التجارب مع HUVECs من نفس المقطع.
  2. ....

النتائج

بالنسبة لفحص الترحيل ، من الأهمية بمكان إجراء فحص شامل للصور الملتقطة عند النقطة الزمنية t = 0 h لضمان اكتشاف النظام بدقة وجود طبقة أحادية الخلية كاملة التكوين (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك ، يجب تأكيد وضوح واستقامة حدود الخدش (الشكل 1 ب). يجب أن تكون المنطقة الخا?.......

Discussion

في هذا التقرير ، قدمنا مجموعة من التقنيات مع قراءات وظيفية وجزيئية لدراسة تكوين الأوعية في المختبر.

يمثل اختبار الهجرة تقنية راسخة تستخدم في جميع مجالات العمل المختبري الرطب. لقد اخترنا نهج تصوير الخلايا الحية المتاح تجاريا للاستفادة من تنسيق 96 بئرا المناسب لتجارب ا?.......

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح في هذا المشروع.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون صوفي كروجر وغابرييل برينز على دعمهما الفني الممتاز. نشكر سيباستيان ماير على تطوير المكون الإضافي ImageJ لتحديد براعم الكرة الأرضية ومرفق المنارة الأساسي ، Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ) ، قسم الطب الأول ، مستشفى جامعة فرايبورغ لاستخدام نظام IncuCyte. تم إنشاء الرسومات باستخدام biorender.com. تم دعم هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135 / 3-1 + Bu3135 / 3-2 to F.B] ، و Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-Program للعلماء السريريين والعلماء السريريين المتقدمين إلى F.B.] ، و Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 to F.B.] و "زمالة CORTEX للعلماء السريريين إلى JR] و Volker H....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäurePAN-BiotecP05-01100HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-FragmentJackson IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tailCorning354236
Collagenase DRoche 11088858001
Endothelial Cell Basal MediumLonzaCC-3156EBM
Endothelial Cell Growth MediumLonzaCC-3162EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid Serva11290.02EDTA
Fetal bovine serumBio&SELLS 0615FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooledLonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates Sartorius4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis SystemSartorius
MethocelSigmam-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
Phosphate-buffered salineThermo Fisher Scientfic14190-094PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial CellsCell SystemsACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlueInvitrogen by ThermoFisher Scientific2260939
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth FactorPeproTech100-20VEGF
Squared petri dishGreiner688102
TrizolQiagen79306
TrypsinPAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
WoundMakerSartorius4493

References

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Gariano, R. F., Gardner, T. W. Retinal angiogenesis in development and disease. Nature. 438 (7070), 960-966 (2005).
  3. Mancuso, M. R., Kuhnert, F., Kuo,....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HUVEC 2D 3D Transcriptomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved