Untersuchung der Angiogenese auf funktioneller und molekularer Ebene durch Nutzung des Scratch Wound Migration Assay und des Spheroid Sprouting Assay

Zusammenfassung

In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

Zusammenfassung

Die Angiogenese spielt eine entscheidende Rolle sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Prozessen im Körper, einschließlich Tumorwachstum oder neovaskulären Augenerkrankungen. Ein detailliertes Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und zuverlässige Screening-Modelle sind unerlässlich, um Krankheiten effektiv zu bekämpfen und neue Therapieoptionen zu entwickeln. Es wurden mehrere In-vitro-Assays entwickelt, um die Angiogenese zu modellieren, wobei die Möglichkeiten einer kontrollierten Umgebung genutzt werden, um angiogene Treiber auf molekularer Ebene aufzuklären und nach therapeutischen Zielen zu suchen.

In dieser Studie werden Arbeitsabläufe für die Untersuchung der Angiogenese in vitro anhand von humanen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) vorgestellt. Wir beschreiben einen Assay zur Migration von Kratzwunden unter Verwendung eines Lebendzell-Bildgebungssystems, das die Migration von Endothelzellen in einer 2D-Umgebung misst, und den Sphäroid-Spross-Assay, bei dem das Keimen von Endothelzellen in einer 3D-Umgebung durch eine Kollagenmatrix bewertet wird. Darüber hinaus skizzieren wir Strategien für die Probenvorbereitung, um weitere molekulare Analysen wie Transkriptomik, insbesondere im 3D-Umfeld, einschließlich RNA-Extraktion sowie Immunzytochemie, zu ermöglichen. Insgesamt bietet dieses Framework Wissenschaftlern ein zuverlässiges und vielseitiges Instrumentarium, um ihre wissenschaftlichen Untersuchungen in In-vitro-Angiogenese-Assays zu verfolgen.

Einleitung

Die Angiogenese, d. h. die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden^{1, ist} ein entscheidender Prozess während der physiologischen Entwicklung und bei pathologischen Zuständen. Es ist unverzichtbar für die Energieversorgung von stark metabolisch aktiven Geweben wie der Netzhaut² oder dem sich entwickelnden Zentralnervensystem³ und während der Heilung von geschädigtem Gewebe⁴. Eine krankhafte Angiogenese hingegen ist die Grundlage für zahlreiche Krankheiten. Solide Tumoren, wie z.B. Darmkrebs oder nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, erleichtern deren Wachstum und die notwendige Energiezufuhr, indem sie die Angiogenese fördern⁵. Neben Krebs sind neovaskuläre Erkrankungen des Auges wie die diabetische Retinopathie oder die altersbedingte Makuladegeneration, die in den Industrieländern die Hauptursachen für Erblindung darstellen, auf ein aberrantes Gefäßwachstum^{zurückzuführen 6,7}. Ein detailliertes Verständnis des zugrundeliegenden Pathomechanismus ist entscheidend, um zu verstehen, wie die physiologische Angiogenese verbessert werden kann, z. B. bei der Wundheilung bei gleichzeitiger besserer Kontrolle pathologischer Zustände wie vasoproliferativen Augenerkrankungen.

Auf zellulärer Ebene werden vaskuläre Endothelzellen durch verschiedene Signalmoleküle in der Angiogenese aktiviert, wodurch die Zellproliferation und -migration eingeleitet^{wird 8}. Die Zellen organisieren sich anschließend in einer Hierarchie, wobei nicht-proliferierende Spitzenzellen an der Vorderkante des sich entwickelnden Gefäßastes⁸ Filopodien bilden. Daneben folgen schnell vermehrende Stielzellen den Spitzenzellen und tragen zur Bildung des entstehenden Gefäßes bei. Anschließend werden andere Zelltypen, wie Perizyten oder glatte Muskelzellen, rekrutiert, um den entstehenden Ast^{weiter zu stabilisieren 9}.

Um molekulare Prozesse auf der Ebene der vaskulären Endothelzellen zu erforschen, wurden zahlreiche In-vitro-Protokolle entwickelt und kürzlich überprüft¹⁰. Diese Assays lassen sich in der Regel in zwei Kategorien einteilen: einfachere, aber skalierbare 2D-Ansätze und ausgefeiltere 3D-Protokolle. In einem kürzlich durchgeführten Projekt haben wir eine umfassende vergleichende Analyse zwischen dem 2D-Scratch-Wund-Migrationsassay und dem 3D-Sphäroid-Spkeim-Assay¹¹ durchgeführt, um das Ausmaß ihrer Unterschiede und ihre Fähigkeit, verschiedene Aspekte der Angiogenese zu modellieren¹², zu bewerten.

Während beide den Vorteil bieten, zuverlässig und einfach zu implementieren zu sein, war der 3D-Sphäroid-Keimungsassay auf molekularer Ebene im Vergleich zu In-vivo-Daten, wie z. B. metabolischen Schaltern oder Zell-Matrix-Interaktionen, vorteilhaft bei der Behandlung wichtiger Aspekte der Angiogenese. Da in vitro Angiogenese-Assays verwendet werden, um das angiomodulatorische Potenzial der Signalwege¹³ zu bewerten und nach Therapeutika zu suchen, ist die Übertragbarkeit der in vitro Ergebnisse auf in vivo von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus bleibt die Möglichkeit von Omics-basierten Analysen auf RNA- und Proteinebene zur Charakterisierung der molekularen Veränderungen als Reaktion auf eine gezielte Modulation angiogener Prozesse unter kontrollierten Bedingungen ein wichtiger Vorteil im Vergleich zu in vivo-Settings ^14,15.

In dieser Veröffentlichung stellen wir wichtige Assays zur Erforschung von Fragen im Zusammenhang mit der Angiogenese durch die Verwendung eines Live-Cell-Imaging-Migrationsassays und eines Sphäroid-Spross-Assays vor, einschließlich nachfolgender molekularer Analysen wie RNA-Sequenzierung für die transkriptomische Analyse und Immunhistochemie auf Proteinebene.

Protokoll

1. HUVEC-Zellkultur

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Arbeitsbedingungen (sterile Arbeitsbank) durch.

1. Ausbau der HUVECs
   1. Verwenden Sie für beide Angiogenese-Assays gepoolte humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) oder humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVECs).
   2. Kultivieren Sie die Zellen bis zu 90 % Konfluenz in einem unbeschichteten T75-Kolben mit Endothelzellwachstumsmedium (EGM), bevor Sie einen Split durchführen. Führen Sie 3 Mal pro Woche einen Mediumwechsel durch.
      HINWEIS: Um das Wachstum zu beschleunigen, kann das Medium täglich gewechselt werden. Verwenden Sie HUVECs nicht über den sechsten Durchgang hinaus. Die Studie erhielt die konsistentesten Ergebnisse, wenn alle Experimente mit HUVECs der gleichen Passage durchgeführt wurden.
2. Aufteilen von HUVECs
   1. Wenn die HUVECs die gewünschte Konfluenz im T75-Kolben erreicht haben, spülen Sie sie einmal mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie die Zellen anschließend 2 Minuten lang mit 0,5 % Trypsin im Inkubator.
      HINWEIS: Eine längere Exposition gegenüber Trypsin kann die HUVEC-Funktion beeinträchtigen.
   2. Lösen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie auf den Kolben klopfen. Bestätigen Sie die erfolgreiche Ablösung unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop.
   3. Fügen Sie 8 mL EGM hinzu, geben Sie die Lösung in ein Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 250 x g für 3 Minuten.
   4. Wenn eine Zellzählung erforderlich ist, resuspendieren Sie die Zellen in 5 mL EGM und verwenden Sie eine Neubauer-Kammer. Andernfalls fügen Sie 40 mL EGM hinzu und verteilen Sie es auf 4 frische T75-Zellkulturflaschen.

2. Assay zur Migration von Kratzwunden

HINWEIS: Der Scratch-Wound-Migrationstest benötigt eine Dauer von 3 Tagen (Abbildung 1). Führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Arbeitsbedingungen (sterile Arbeitsbank) durch.

1. Plattierung und Aushungern von Zellen (Tag 1)
   1. Mit einer speziellen 96-Well-Platte für die Bildgebung lebender Zellen können 20.000 HUVECs in 100 μl EGM pro Well ausgesät werden. Lassen Sie die Zellen 6 Stunden im Inkubator ruhen.
      HINWEIS: Es ist ratsam, die Zellzahlen unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Geschwindigkeit des Wachstums von vaskulären Endothelzellen zwischen Lieferanten und Labors zu optimieren. Ziel ist es, am nächsten Tag eine perfekte Monoschicht zu erreichen, bevor der Scratch eingeleitet wird. Überbevölkerte Vertiefungen können das Verhalten von Endothelzellen verändern, z. B. durch Kontakthemmung¹⁶, während eine unvollständige Monoschicht die Analyse drastisch behindert.
   2. Hungern Sie alle Vertiefungen über Nacht mit 100 μl EBM pro Vertiefung, ergänzt mit 2 % FBS.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Zellmonoschicht nicht zu beschädigen, insbesondere wenn Sie eine Mehrkanalpipette verwenden.
2. Vorbereitung von Stimulationslösungen (Tag 2)
   1. Verdünnen Sie die gewünschten Substanzen und Kontrollen in Basalmedium (EBM) für das Wachstum von Endothelzellen, das mit 2 % FBS ergänzt wird. Verwenden Sie für jede Vertiefung 100 μl Lösung.
      HINWEIS: EBM, ergänzt mit 2 % FBS, dient als Negativkontrolle, während rekombinanter humaner vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) bei 25 ng/ml als Positivkontrolle verwendet werden kann. Bei Verwendung von 96-Well-Platten wird empfohlen, die Experimente mit einem Minimum an technischen Replikaten (4 Wells mit identischen Bedingungen) zu planen, obwohl empfohlen wird, 8 Wells für optimale Ergebnisse zu verwenden. Bemühen Sie sich, potenzielle Kanten- oder Eckeneffekte bei der Planung des Layouts zu minimieren.
3. Erstellen des Scratchs (Tag 2)
   1. Überprüfen Sie Zellen unter einem Mikroskop, um eine konfluente Zellmonoschicht und die Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen. Positionieren Sie die 96-Well-Platte in einem 96-Well-Wickelwerkzeug und erzeugen Sie den Kratzer, indem Sie den Hebel des Geräts nach unten drücken. Heben Sie den Deckel des Wundmacherwerkzeugs vorsichtig ab, bevor Sie den Hebel loslassen, um doppeltes Kratzen zu vermeiden.
   2. Waschen Sie alle Vertiefungen zweimal mit 200 μl EBM pro Vertiefung, ergänzt mit 2 % FBS. Bestätigen Sie unter dem Mikroskop, dass Schmutz erfolgreich entfernt wurde.
4. Zellstimulation (Tag 2)
   1. Pro Vertiefung werden 100 μl der vorbereiteten Stimulations- oder Kontrolllösungen zugegeben.
5. Bildgebung (Tag 2-3)
   1. Erfassen Sie Bilder einmal pro Stunde für einen Zeitraum von bis zu 24 Stunden mit einem automatisierten Zeitplan, der vom Mikroskop für die Bildgebung lebender Zellen bereitgestellt wird.
      HINWEIS: Um eine gute Bildqualität zu gewährleisten, scannen Sie jede Vertiefung sofort nach dem Transfer in den Inkubator, in dem sich das Lebendzell-Imaging-System befindet. Eine 30-minütige Eingewöhnungszeit im Inkubator verhilft zu einer besseren Bildqualität. Die Mikroskopsoftware ist so programmiert, dass sie ein Bild pro Stunde für jede Vertiefung an der Mittellinie des definierten Kratzers aufnimmt.
6. Wenn kein Wundmacher-Tool und kein Live-Cell-Imager vorhanden sind, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
   1. Verwenden Sie eine Pipettenspitze in einer 24-Well-Platte, um einen Kratzer zu verursachen. Nehmen Sie in bestimmten Abständen Bilder mit einem klassischen Zellkulturmikroskop auf. Verwenden Sie zu diesem Zweck ein motorisiertes Mikroskop, das mit präzisen x- und y-Tracking-Funktionen ausgestattet ist. Dies ermöglicht eine automatische Positionierung und gewährleistet eine konsistente Bilderfassung an vordefinierten Orten.
      HINWEIS: Wenn eine manuelle Bildgebung erforderlich ist, ist es eine praktikable Option, nur T0 sowie einen Zeitpunkt "x" Stunden nach der Behandlung abzubilden. Im beschriebenen Protokoll mit HUVECs war der Zeitpunkt T12 (12 h nach der Stimulation) ein attraktiver Zeitpunkt mit einer klaren Trennung zwischen negativer und VEGF-stimulierter positiver Kontrolle. Es wird jedoch empfohlen, anfängliche Zeitverlaufsexperimente mit Bildgebung alle 2 h oder 1 h durchzuführen, um den optimalen Zeitpunkt für die spezifischen experimentellen Einstellungen in jedem Labor zu bestimmen.
7. Analyse (Tag 3)
   1. Die Software für das Mikroskop zur Bildgebung lebender Zellen kann eine direkte Analyse der aufgenommenen Bilder ermöglichen. Definieren Sie Masken, die den Zellrasen, den anfänglichen Kratzer und die relative Wunddichte abgrenzen. Bestimmen Sie Zellgrenzen basierend auf Kontrastunterschieden.
      HINWEIS: Für Experimente, die mit HUVECs durchgeführt wurden, wurde eine Segmentierungsanpassung von 1,6, eine Lochdatei von 500 μm², eine angepasste Größe von 1 Pixel, eine Fläche >500 μm und eine Exzentrizität >0,6 verwendet. Eine gründliche visuelle Überprüfung der Zelldetektionsparameter im Vergleich zu tatsächlichen Bildern ist unerlässlich. Mit optimierten Konfigurationen berechnet die Software automatisch die relative Wunddichte (RWD) über die Zeit und generiert entsprechende zeitliche Diagramme mit der Standardabweichung (SD) der technischen Replikate. Diese Daten können dann für statistische Analysen verwendet werden.

3. RNA-Extraktion mit 2D-kultivierten Zellen

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte bis Schritt 3.3 unter sterilen Arbeitsbedingungen (sterile Arbeitsbank) durch.

1. Zellen plattieren (Tag 1)
   1. HUVECs werden gemäß Schritt 1.2 des HUVEC-Zellkulturprotokolls abgenommen.
   2. Keimen Sie 50.000 Zellen pro Well in einer 12-Well-Platte mit 2 mL EGM pro Well.
   3. Wechseln Sie das Medium nach 6 h auf EBM mit 2 % FBS (Starving Media) für das Hungern über Nacht.
2. Behandlung der Zellen (Tag 2)
   1. Verwässerte Wirkstoffe von Interesse an EBM, ergänzt mit 2% FBS. Ersetzen Sie das Hungermedium durch die vorbereitete Verdünnung und inkubieren Sie die Zellen für die gewünschte Zeit in einem Inkubator.
3. RNA-Extraktion (Tag 2-3)
   1. Lysieren Sie die Zellen mit 750 μl Trizol pro Vertiefung und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler.
   2. Resuspendieren Sie die Proben einige Male mit einer 1000-μl-Pipette und lagern Sie sie dann in speziellen RNA-Röhrchen mit geringer Bindung (Volumen 1,5 mL). Bei -80 °C lagern.

4. Immunzytochemie mit 2D-kultivierten Zellen

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte bis Schritt 4.4 unter sterilen Arbeitsbedingungen (steriler Arbeitsplatz) durch.

1. Vorbereitung von Deckgläsern
   1. 100 Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm in 5%igem Kaliumhydroxid in Methanol in einem 50-ml-Röhrchen 30 Minuten lang inkubieren, während die aufgetragene Lösung geschüttelt wird.
      HINWEIS: Dies ist ein sehr wichtiger Schritt zur Deprotonierung der Oberfläche der Deckgläser und zur Verbesserung der Bedingungen für Beschichtung und Kultur. An dieser Stelle ist es sehr zu empfehlen, darauf zu achten, dass die Deckgläser gut im Medium verteilt sind und nicht trocken und verklebt werden.
   2. Waschen Sie die Deckgläser 30 Minuten lang 4 Mal mit demineralisiertem Wasser.
   3. Nach dem Waschen zur Lagerung in 70%ige Isopropyllösung umfüllen.
2. Beschichtung von Deckgläsern
   1. Lehnen Sie die Deckgläser einzeln an die Wand einer quadratischen Petrischale, um die Verdampfung von Isopropylalkohol zu ermöglichen.
   2. Nach 5 Minuten die Deckgläser in eine 24-Well-Platte (ein Deckglas pro Well) übertragen. 1 ml einer Lösung von 10 mg/ml Kollagen I in PBS auf jede Vertiefung geben und 60 Minuten bei 37 °C inkubieren.
   3. Waschen Sie dann die Deckgläser 4-5 Mal für 5 Minuten mit PBS.
3. Zellen kultivieren
   1. Nehmen Sie HUVECs gemäß den in Schritt 1.2 des HUVEC-Zellkulturprotokolls beschriebenen Verfahren ab.
   2. Keimen Sie 50.000 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte mit 2 mL EGM pro Well.
   3. Wechseln Sie nach 6 Stunden das Medium auf EBM mit 2 % FBS, damit sich die Zellen an die Vertiefung anheften und die Zellen über Nacht aushungern können.
   4. Am nächsten Tag wurden verwässerte Wirkstoffe von Interesse an EBM mit 2% FBS ergänzt. Ersetzen Sie die hungernde Lösung in Vertiefungen durch die vorbereitete Verdünnung und inkubieren Sie die Zellen für die gewünschte Zeit in einem Inkubator.
4. Fixierung und Blockierung
   1. Kultivieren Sie die Zellen für die gewünschte Zeit und waschen Sie die Zellen dann 5 Minuten lang mit PBS.
   2. Fixieren Sie die Zellen mit 2% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
   3. 3-4 Mal 5 Minuten lang mit PBS waschen.
   4. Inkubieren Sie Proben mit einem Blockierungspuffer, der 5 % normales Ziegenserum (NGS) und 0,1 % Triton-X-100 in PBS enthält, für 1 h bei RT.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt ist es wichtig, die Proben zu waschen, um sicherzustellen, dass PFA vollständig entfernt wird. Wählen Sie die Spezies des Serums basierend auf der Herkunft des Sekundärantikörpers.
5. Färbung
   1. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 °C im Blockierungspuffer mit dem Primärantikörper.
   2. Um am nächsten Tag ungebundene Primärantikörper zu entfernen, waschen Sie die Proben 3-4 Mal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
   3. Anschließend werden die Proben 1 h lang bei RT mit dem entsprechenden Sekundärantikörper und Phalloidin-FITC, zusammen im Blockierungspuffer verdünnt, inkubiert.
   4. Weitere 3-4 Mal waschen.
   5. Drehen Sie die Deckgläser mit einem kleinen Tröpfchen DAPI-haltigem Eindeckmedium auf die Objektträger, lassen Sie sie im Dunkeln trocknen und versiegeln Sie sie mit Nagellack. Lagern Sie die Proben im Dunkeln bei 4 °C.

5. Sphäroid-Keimungs-Assay

HINWEIS: Der Sphäroidkeimungstest benötigt 3 Tage, um abgeschlossen zu werden (Abbildung 2). Führen Sie alle folgenden Schritte bis Schritt 5.7 unter sterilen Arbeitsbedingungen (sterile Arbeitsbank) durch.

1. Erzeugung von Sphäroiden in hängenden Tropfen (Tag 1)
   1. Nehmen Sie HUVECs gemäß den in Schritt 1.2 des HUVEC-Zellkulturprotokolls beschriebenen Verfahren ab.
   2. Kombinieren Sie 200.000 Zellen mit 8 mL EGM und 2 mL Methocel-Stammlösung, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. In der Zusatzdatei 1 finden Sie Anweisungen zur Herstellung der Methokel-Stammlösung.
   3. Geben Sie 25 μl Tröpfchen der Lösung auf die umgekehrte Innenfläche einer großen, quadratischen Petrischale. Drehen Sie den Deckel vorsichtig um 180° und positionieren Sie ihn so auf dem Boden des Zellkulturgefäßes, dass die Tröpfchen hängen. Stellen Sie das Gefäß über Nacht in einen Zellkultur-Inkubator.
2. Bereiten Sie das Kollagen-Gel vor (Tag 2)
   1. Mischen Sie gründlich 2,3 mL Rattenschwanzkollagen Typ I mit 0,280 mL 10x Medium 199, bis die Mischung einen gleichmäßigen Gelbton erreicht. Halten Sie diese Mischung während des gesamten Prozesses auf Eis.
3. Titrieren Sie das Kollagengel (Tag 2)
   1. Titrieren Sie das Gemisch, um einen physiologischen pH-Wert zu erreichen, der durch eine orange Farbe gekennzeichnet ist, mit NaOH (2 N).
   2. Geben Sie 50 μl HEPES-Puffer in das Endprodukt.
      HINWEIS: Um einen optimalen Dynamikbereich für den Assay zu gewährleisten, ist es unerlässlich, sich so nah wie möglich an einen physiologischen pH-Wert anzunähern. Verschiedene Chargen von Kollagen können unterschiedliche Mengen an NaOH erfordern. Halten Sie die Mischung während des gesamten Prozesses streng auf Eis und mischen Sie sie die ganze Zeit homogen.
4. Ernte von Sphäroiden (Tag 2)
   1. Spülen Sie hängende Tropfen von den Zellkulturdeckeln mit 20 mL PBS ab.
   2. Die Lösung wird 7 min lang bei 250 x g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Sphäroide in 0,1 mL FBS und 0,4 mL EGM, indem Sie vorsichtig auf das Röhrchen klopfen.
   3. 2 ml Methocel-Stammlösung zugeben und gründlich mischen. Verwenden Sie eine Pipette mit einem Fassungsvermögen von mindestens 5 ml, um eine Beschädigung der Sphäroide zu vermeiden.
5. Hinzufügen von Sphäroiden zur 3D-Kollagenmatrix (Tag 2)
   1. Geben Sie 2 ml der vorbereiteten Kollagenmischung zu den resuspendierten Sphäroiden und mischen Sie sie gründlich.
   2. Geben Sie 0,5 mL der resultierenden Mischung in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einem Zellinkubator.
6. Stimulation von Sphäroiden in einer 3D-Kollagenmatrix (Tag 2)
   1. Bereiten Sie eine Verdünnung der gewünschten Substanzen in EBM vor. Verwenden Sie für jede Vertiefung 100 μl Lösung.
      HINWEIS: EBM dient als Negativkontrolle, während der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) bei 25 ng/ml (Endkonzentration in 500 μl Kollagenmatrix und 100 μl EBM-Schicht) als Positivkontrolle verwendet werden kann.
   2. Inkubieren Sie für die gewünschte Zeit.
      HINWEIS: In einem Standard-Assay werden 18-24 Stunden empfohlen, aber das Timing muss in jedem Labor sorgfältig optimiert werden.
7. Bildgebung von Sphäroiden (Tag 3)
   1. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop und eine Bildgebungsplattform, um Bilder aller Sphäroide aufzunehmen, die nicht mit dem Bohrlochrand oder miteinander in Kontakt kommen oder Anzeichen von Schäden aufweisen. Behalten Sie konsistente Einstellungen und Zoomstufen für alle Bedingungen bei.
8. Analyse (Tag 3)
   1. Verwenden Sie das Messwerkzeug in ImageJ Fiji, um die Länge aller Sprossen von jedem Sphäroid in jedem Bild zu bestimmen.
      HINWEIS: Verwenden Sie das in der Zusatzdatei 2 bereitgestellte Plugin, das die Analyse effizienter macht und eine Ausgabe .txt Datei generiert.
   2. Importieren Sie die Daten in eine Tabelle, R oder eine andere bevorzugte Software und verwenden Sie die durchschnittliche kumulative Länge aller Sprossen pro Sphäroid als Messwert für jede Bedingung.
      HINWEIS: Die Ergebnisse verschiedener Gele können nicht in Form von absoluten Keimlängen kombiniert werden. Die Daten aus jeder Behandlungsgruppe müssen auf die EBM- oder VEGF-Kontrollgruppe (relative Keimlänge) normalisiert werden, bevor die Daten zusammengeführt werden können.

6. RNA-Extraktion mit 3D-kultivierten Zellen

1. Sphäroid-Keimungs-Assay
   1. Führen Sie den Sphäroidkeimungstest wie in Abschnitt 5 beschrieben durch.
2. Lyse von Kollagengel
   1. Waschen Sie die Sphäroidgele 5 Minuten lang mit warmem PBS.
   2. Schneiden Sie die Sphäroidgele in Viertel und geben Sie alle 4 Viertel in ein 50-ml-Röhrchen. Verwenden Sie ein Skalpell für die mechanische Dissektion der Gele.
   3. Behandeln Sie die Gelproben mit einer Lyselösung (enthält 2 mg/ml Kollagenase D in PBS) und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang bei 37 °C auf einem Shaker.
   4. Waschen Sie die Gele vorsichtig mit PBS, ergänzt durch 2 mM EDTA, um die Reaktion des Lysepuffers zu stoppen.
3. RNA-Extraktion
   1. Resuspendieren Sie die lysierten Gele in 750 μl Trizol und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang, um eine ausreichende RNA-Extraktion zu gewährleisten, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
   2. Resuspendieren Sie die Proben einige Male mit einer 1000-μl-Pipette und überführen Sie die Proben in spezifische niedrig bindende RNA-Röhrchen (Volumen 1,5 mL). Lagern Sie die Proben bei -80 °C.

7. Immunzytochemie von Sphäroiden in einer 3D-Kollagenmatrix

1. Sphäroid-Keimungs-Assay
   1. Führen Sie den Sphäroidkeimungstest wie in Abschnitt 5 beschrieben durch.
2. Fixierung und Blockierung
   1. Fixieren Sie die Gele mit 4% PFA in PBS für 1 h.
      HINWEIS: Um eine gute Fixierung der Zellen im Gel zu gewährleisten, müssen die Gele nach dem Spülen mit PBS vorsichtig mit einem Skalpell und einer Pinzette an den Seiten der Vertiefungen abgelöst werden.
   2. Waschen Sie die Gele vorsichtig 3-4 Mal mit PBS und lösen Sie sie dann vollständig von der Oberfläche der Wells und geben Sie sie in neue 24-Well-Platten.
   3. Inkubieren Sie die Gele 1 h lang bei RT mit der Blockierungslösung (enthält 5 % NGS und 0,1 % Triton-X-100 in PBS) auf einem Orbitalschüttler.
3. Färbung
   1. Die Proben werden über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler inkubiert, wobei der Primärantikörper in Blockpuffer verdünnt wird.
      HINWEIS: Das Drehen der Gele während dieser Inkubation verbesserte die Färbequalität nicht.
   2. Waschen Sie die Gele am nächsten Tag sanft 4-5 Mal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
   3. Der entsprechende Sekundärantikörper, verdünnt mit Phalloidin-FITC, wird über Nacht bei 4 °C in einem Orbitalschüttler in einem Orbitalschüttler in einem Blockpuffer inkubiert.
   4. Führen Sie 4-5 zusätzliche Waschschritte mit PBS durch.
   5. Übertragen Sie die Gele auf Objektträger und montieren Sie sie mit zwei Tropfen DAPI-haltigem Eindeckmedium auf einem Deckglas, das auf jedes Gel gelegt wird. Lassen Sie die Proben trocknen, bevor Sie sie mit Nagellack versiegeln und lagern Sie sie im Dunkeln bei 4 °C.
4. Mikroskopie
   1. Bilden Sie alle Proben auf einem konfokalen Mikroskop ab. Verwenden Sie das 20-fache Ziel und konzentrieren Sie sich auf den interessierenden Bereich. Erfassen Sie Bilder sowohl als Z-Stapel als auch als einzelne Bilder in der Fokusebene.
      HINWEIS: Die Aufnahme von Bildern des Z-Stapels und der Fokusebene in mehreren Abschnitten der 3D-Probe ist unerlässlich, um die vollständige Darstellung zu erfassen, insbesondere bei dicken 3D-Proben.

8. Humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Netzhaut (HRMVECs)

HINWEIS: Alle beschriebenen Schritte können auch mit mikrovaskulären Endothelzellen durchgeführt werden, z. B. mit humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMVECs). In diesem Fall muss das Medium auf ein spezifisches mikrovaskuläres Endothelzellmedium umgestellt werden, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthält, um es zu kultivieren, sowie für bestimmte Schritte in jedem Assay. Die HRMVEC-spezifischen Unterschiede zu den Assay-Protokollen sind im Folgenden aufgeführt:

1. Kratzwund-Assay
   1. Kultivieren Sie Zellen in 10% FBS mikrovaskulärem Endothelzellmedium anstelle von EGM.
   2. 20.000 Zellen/Mulde säen.
   3. Lassen Sie die Zellen nicht über Nacht verhungern.
   4. Nachdem Sie den Scratch durchgeführt haben, wechseln Sie das Medium auf ein basales Endothelzellmedium mit 5 % FBS anstelle von EBM mit 2 % FBS.
2. Immunzytochemie von 2D-kultivierten HRMVECs
   1. Kultivieren Sie die Zellen in 10% mikrovaskulärem Endothelzellmedium anstelle von EGM.
   2. Lassen Sie die Zellen nicht über Nacht verhungern.
   3. Wechseln Sie das Medium direkt vor der Behandlung auf EBM + 5 % FBS anstelle von EBM + 2 % FBS.
3. Sphäroid-Keimungs-Assay
   1. Besiedeln Sie die Zellen als hängende Tropfen mit mikrovaskulärem Endothelzellmedium, das 10 % FBS anstelle von EGM enthält.
4. Immunzytochemie von Sphäroiden in einer 3D-Kollagenmatrix
   1. Besiedeln Sie die Zellen als hängende Tropfen mit mikrovaskulärem Endothelzellmedium, das 10 % FBS anstelle von EGM enthält.

Ergebnisse

Für den Migrationsassay ist es entscheidend, die Bilder, die zum Zeitpunkt t = 0 h aufgenommen wurden, gründlich zu untersuchen, um sicherzustellen, dass das Vorhandensein einer vollständig ausgebildeten Zellmonoschicht vom System genau erkannt wird (Abbildung 1B). Zusätzlich sollte die Klarheit und Geradheit des Kratzrandes bestätigt werden (Abbildung 1B). Der zellfreie Bereich sollte weitestgehend frei von Schmutz sein. Am Ende des Assays sollte eine Grup...

Diskussion

In diesem Bericht haben wir ein Spektrum von Techniken mit funktionellen und molekularen Messwerten vorgestellt, um die Angiogenese in vitro zu untersuchen.

Der Migrationsassay stellt eine etablierte Technik dar, die in allen Bereichen der Nasslaborarbeit eingesetzt wird. Wir haben uns für den kommerziell erhältlichen Ansatz der Lebendzellbildgebung entschieden, um die Vorteile des 96-Well-Formats zu nutzen, das für Screening- und Dosis-Wirkungs-Experimente geeignet ist, der stan...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493