Untersuchung der Angiogenese auf funktioneller und molekularer Ebene durch Nutzung des Scratch Wound Migration Assay und des Spheroid Sprouting Assay

Zusammenfassung

In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

Zusammenfassung

Die Angiogenese spielt eine entscheidende Rolle sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Prozessen im Körper, einschließlich Tumorwachstum oder neovaskulären Augenerkrankungen. Ein detailliertes Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und zuverlässige Screening-Modelle sind unerlässlich, um Krankheiten effektiv zu bekämpfen und neue Therapieoptionen zu entwickeln. Es wurden mehrere In-vitro-Assays entwickelt, um die Angiogenese zu modellieren, wobei die Möglichkeiten einer kontrollierten Umgebung genutzt werden, um angiogene Treiber auf molekularer Ebene aufzuklären und nach therapeutischen Zielen zu suchen.

In dieser Studie werden Arbeitsabläufe für die Untersuchung der Angiogenese in vitro anhand von humanen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) vorgestellt. Wir beschreiben einen Assay zur Migration von Kratzwunden unter Verwendung eines Lebendzell-Bildgebungssystems, das die Migration von Endothelzellen in einer 2D-Umgebung misst, und den Sphäroid-Spross-Assay, bei dem das Keimen von Endothelzellen in einer 3D-Umgebung durch eine Kollagenmatrix bewertet wird. Darüber hinaus skizzieren wir Strategien für die Probenvorbereitung, um weitere molekulare Analysen wie Transkriptomik, insbesondere im 3D-Umfeld, einschließlich RNA-Extraktion sowie Immunzytochemie, zu ermöglichen. Insgesamt bietet dieses Framework Wissenschaftlern ein zuverlässiges und vielseitiges Instrumentarium, um ihre wissenschaftlichen Untersuchungen in In-vitro-Angiogenese-Assays zu verfolgen.

Einleitung

Die Angiogenese, d. h. die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden^{1, ist} ein entscheidender Prozess während der physiologischen Entwicklung und bei pathologischen Zuständen. Es ist unverzichtbar für die Energieversorgung von stark metabolisch aktiven Geweben wie der Netzhaut² oder dem sich entwickelnden Zentralnervensystem³ und während der Heilung von geschädigtem Gewebe⁴. Eine krankhafte Angiogenese hingegen ist die Grundlage für zahlreiche Krankheiten. Solide Tumoren, wie z.B. Darmkrebs oder nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, erleichtern deren Wachstum und die notw....

Protokoll

1. HUVEC-Zellkultur

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Arbeitsbedingungen (sterile Arbeitsbank) durch.

1. Ausbau der HUVECs
   1. Verwenden Sie für beide Angiogenese-Assays gepoolte humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) oder humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVECs).
   2. Kultivieren Sie die Zellen bis zu 90 % Konfluenz in einem unbeschichteten T75-Kolben mit Endothelzellwachstumsmedium (EGM), bevor Sie einen Split durchführen. Führen Sie 3 Mal pro Woche einen Mediumwechsel durch.
      HINWEIS: Um das Wachstum zu beschleunigen, kann das Medium täglich gewechselt werden. Verwenden Sie....

Diskussion

In diesem Bericht haben wir ein Spektrum von Techniken mit funktionellen und molekularen Messwerten vorgestellt, um die Angiogenese in vitro zu untersuchen.

Der Migrationsassay stellt eine etablierte Technik dar, die in allen Bereichen der Nasslaborarbeit eingesetzt wird. Wir haben uns für den kommerziell erhältlichen Ansatz der Lebendzellbildgebung entschieden, um die Vorteile des 96-Well-Formats zu nutzen, das für Screening- und Dosis-Wirkungs-Experimente geeignet ist, der stan.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493