Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

요약

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

초록

혈관신생은 종양 성장 또는 신생혈관 안질환을 포함한 신체 내 생리학적 및 병리학적 과정 모두에서 중요한 역할을 합니다. 근본적인 분자 메커니즘에 대한 자세한 이해와 신뢰할 수 있는 스크리닝 모델은 질병을 효과적으로 표적으로 삼고 새로운 치료 옵션을 개발하는 데 필수적입니다. 혈관신생을 모델링하기 위해 여러 in vitro assay가 개발되었으며, 분자 수준에서 혈관신생 동인을 규명하고 치료 표적을 스크리닝하기 위해 통제된 환경이 제공하는 기회를 활용하고 있습니다.

이 연구는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용하여 체외 에서 혈관 신생을 조사하기 위한 워크플로우를 제시합니다. 2D 설정에서 내피 세포 이동을 측정하는 라이브 셀 이미징 시스템을 활용한 스크래치 상처 이동 분석과 콜라겐 매트릭스가 제공하는 3D 설정에서 내피 세포 발아를 평가하는 스페로이드 발아 분석에 대해 자세히 설명합니다. 또한 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 3D 환경에서 전사체학(transcriptomics)과 같은 추가 분자 분석을 가능하게 하는 시료 전처리 전략을 간략하게 설명합니다. 전체적으로 이 프레임워크는 과학자들에게 체외 혈관신생 분석에 대한 과학적 연구를 추구할 수 있는 신뢰할 수 있고 다재다능한 도구 세트를 제공합니다.

서문

혈관신생술은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 형성되는 것을^{말하며1 생}리적 발달 및 병리학적 조건에서 중요한 과정이다. 이는 망막(retina)² 또는 발달 중인 중추신경계(central nervous system⁾³와 같이 대사 활동이 활발한 조직에 에너지를 공급하고, 손상된 조직⁴을 치유하는 과정에서 필수적이다. 반면에 비정상적인 혈관 신생은 수많은 질병의 기초가 됩니다. 대장암이나 비소세포폐암과 같은 고형암은 혈관신생을 촉진하여 종양의 성장과 필요한 에너지 공급을 촉진한다⁵. 암 외에도 당뇨병성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성과 같은 눈의 신생 혈관 질환은 선진국에서 실명의 주요 원인으로 비정상적인 혈관 성장의 결과입니다 ^6,7. 근본적인 발병 기전에 대한 자세한 이해는 예를 들어 혈관 증식성 안구 질환과 같은 병리학적 상태를 더 잘 제어하면서 상처 치유에서 생리적 혈관 신생을 향상시킬 수 있는 방법을 이해하는 데 중요합니다.

프로토콜

1. HUVEC 세포 배양

알림: 멸균 작업 조건(멸균 작업대)에서 다음 단계를 모두 수행하십시오.

1. HUVEC 확장
   1. 두 혈관신생 분석의 경우 통합형 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 또는 인간 미세혈관 내피 세포(HMVEC)를 사용합니다.
   2. 분할을 수행하기 전에 내피 세포 성장 배지(EGM)가 있는 코팅되지 않은 T75 플라스크에서 90% 합류점에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 일주일에 3번 미디엄 체인지를 실시합니다.
      알림: 성장을 촉진하기 위해 매체는 매일 교체할 수 있습니다. 여섯 번째 통로 이후에는 HUVEC을 사용하지 마십시오. 이 연구는 동일한 통로의 HUVEC으로 모든 실험을 실행한 결과 가장 일관된 결과를 받았습니다.
2. HUVEC 분할
   1. HUVEC이 T75 플라스크에서 원하는 합류점에 도달하면 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 헹구고 인큐베이터에서 2분 동안 0.5% 트립신으로 세포를 배양합니다.
      알림: 트립신에 장기간 노출되면 HUVEC 기능이 손상될 수 있습니다.
   2. 플라스크를 두드려 세포를 부드럽게 분리합니다. 역위상차 현미경으로 성공적인 분리를 확인....

토론

이 보고서에서는 in vitro에서 혈관신생을 연구하기 위한 기능적 및 분자적 판독과 함께 다양한 기법을 제시했습니다.

마이그레이션 분석은 습식 실험실 작업의 모든 분야에서 사용되는 잘 정립된 기술을 나타냅니다. 스크리닝 및 용량 반응 실험에 적합한 96웰 형식, WoundMaker 도구로 생성된 표준화되고 재현 가능한 상처 크기, 최대 24시간 동안 타임랩스 이미징을 통해 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493