Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

Resumen

Este estudio presenta el ensayo bidimensional (2D) de migración de heridas por arañazo y el ensayo tridimensional (3D) de brotes esferoides, junto con sus respectivos métodos de análisis posteriores, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica, como ensayos adecuados para estudiar la angiogénesis in vitro.

Resumen

La angiogénesis desempeña un papel crucial en los procesos fisiológicos y patológicos del organismo, como el crecimiento tumoral o la enfermedad ocular neovascular. Una comprensión detallada de los mecanismos moleculares subyacentes y modelos de cribado fiables son esenciales para atacar las enfermedades de forma eficaz y desarrollar nuevas opciones terapéuticas. Se han desarrollado varios ensayos in vitro para modelar la angiogénesis, aprovechando las oportunidades que ofrece un entorno controlado para dilucidar los impulsores angiogénicos a nivel molecular y detectar dianas terapéuticas.

Este estudio presenta flujos de trabajo para investigar la angiogénesis in vitro utilizando células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Detallamos un ensayo de migración de heridas por arañazo que utiliza un sistema de imágenes de células vivas que mide la migración de células endoteliales en un entorno 2D y el ensayo de germinación de esferoides que evalúa la germinación de células endoteliales en un entorno 3D proporcionado por una matriz de colágeno. Además, describimos estrategias para la preparación de muestras que permitan análisis moleculares adicionales, como la transcriptómica, particularmente en el entorno 3D, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica. En conjunto, este marco ofrece a los científicos un conjunto de herramientas fiables y versátiles para llevar a cabo sus investigaciones científicas en ensayos de angiogénesis in vitro .

Introducción

La angiogénesis, que se refiere a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes¹, es un proceso crucial durante el desarrollo fisiológico y las condiciones patológicas. Es indispensable para proporcionar energía a tejidos altamente activos metabólicamente como la retina² o el sistema nervioso central en desarrollo³ y durante la curación de tejidos dañados⁴. La angiogénesis anormal, por otro lado, es la base de numerosas enfermedades. Los tumores sólidos, como el cáncer colorrectal o el cáncer de pulmón de células no pequeñas, facilitan su crecimiento....

Protocolo

1. Cultivo celular HUVEC

NOTA: Realice todos los pasos siguientes en condiciones de trabajo estériles (banco de trabajo estéril).

1. Expansión de los HUVC
   1. Para ambos ensayos de angiogénesis, utilice células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) agrupadas o células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC).
   2. Cultive las células hasta que alcancen el 90% de confluencia en un matraz T75 sin recubrimiento con medio de crecimiento de células endoteliales (EGM) antes de realizar una división. Realizar cambio de medio 3 veces por semana.
      NOTA: Para acelerar el crecimiento, el medio se puede....

Discusión

En este informe, presentamos un espectro de técnicas con lecturas funcionales y moleculares para estudiar la angiogénesis in vitro.

El ensayo de migración representa una técnica bien establecida que se utiliza en todos los campos del trabajo de laboratorio húmedo. Elegimos el enfoque de imágenes de células vivas disponible en el mercado para aprovechar el formato de 96 pocillos adecuado para experimentos de detección y dosis-respuesta, el tamaño de la herida estandarizado y.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493