JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول التعبير خارج الرحم بوساطة الفيروسية ل Neurod1 بعد السكتة الدماغية الإقفارية القشرية. يتم تسليم Neurod1 (1) باستخدام نظام Cre-Flex AAV في الفئران البرية خلال المرحلة تحت الحادة بعد السكتة الدماغية (7 أيام) و (2) باستخدام ناقل AAV واحد في الفئران المراسلة الشرطية خلال المرحلة المزمنة بعد السكتة الدماغية (21 يوما).

Abstract

ظهر التعبير خارج الرحم للعوامل العصبية في الجسم الحي كنهج واعد لاستبدال الخلايا العصبية المفقودة في نماذج الأمراض. تم الإبلاغ على نطاق واسع عن استخدام عوامل النسخ العصبية الأساسية الحلزونية الحلزونية (bHLH) عبر أنظمة الجسيمات الشبيهة بالفيروسات غير المنتشرة ، بما في ذلك الفيروسات القهقرية وفيروس العدسات والفيروس المرتبط بالغدة (AAV). بالنسبة للتجارب في الجسم الحي ، يتم استخدام AAVs بشكل متزايد بسبب انخفاض إمراضها وإمكانية الترجمة. يصف هذا البروتوكول نظامين من AAV للتحقيق في التعبير خارج الرحم لعوامل النسخ في الخلايا المنقولة بعد السكتة الدماغية الإقفارية. في كلا النظامين ، يتم التحكم في تعبير Neurod1 بواسطة محفز GFAP القصير (gfaABC (1) D) ، والذي يتم تنظيمه في الخلايا النجمية التفاعلية بعد السكتة الدماغية وكذلك في الخلايا العصبية الذاتية عند دمجه مع التعبير عن العامل العصبي. في نموذج السكتة الدماغية الإقفارية الموصوف ، يتم إحداث نقص التروية البؤري عن طريق حقن البطانة -1 (ET-1) في القشرة الحركية للفئران ، مما يخلق آفة محاطة بالخلايا النجمية التفاعلية التي تعبر عن GFAP والخلايا العصبية الباقية. يتم إجراء الحقن داخل المخ من AAV للحث خارج الرحم على التعبير عن Neurod1 في المراحل تحت الحادة (7 أيام) والمزمنة (21 يوما) بعد السكتة الدماغية. في غضون أسابيع بعد حقن AAV ، تم تحديد عدد أكبر بكثير من الخلايا العصبية بين الخلايا المنقولة في الفئران التي تعبر عن Neurod1 خارج الرحم مقارنة بالفئران التي تتلقى فيروسات التحكم في AAV. استخدمت الاستراتيجيات القائمة على AAV النتائج الملحوظة المكررة لزيادة أعداد الخلايا العصبية التي تعبر عن جين المراسل في نموذج السكتة الدماغية القشرية الخفيفة إلى المتوسطة. يضع هذا البروتوكول منصة قياسية لاستكشاف تأثيرات التعبير خارج الرحم لعوامل النسخ التي يتم تسليمها باستخدام الأنظمة القائمة على AAV ، مما يساهم في فهم التعبير عن العامل العصبي في سياق السكتة الدماغية.

Introduction

السكتة الدماغية هي سبب رئيسي للإعاقة في جميع أنحاءالعالم 1. تحدث السكتة الدماغية عندما يتعطل تدفق الدم إلى الدماغ. يمكن أن يحدث هذا إما من خلال السكتة الدماغية النزفية (~ 15٪ من الحالات) ، حيث ينفجر وعاء دموي في الدماغ ، أو من خلال السكتة الدماغية الإقفارية ، حيث يتم حظر تدفق الدم إلىالدماغ 1. السكتات الدماغية الإقفارية هي الأكثر انتشارا وتمثل ~ 85٪ من حالات السكتةالدماغية 1. تقلل السكتة الدماغية من توصيل الجلوكوز والأكسجين إلى الدماغ ، مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية بسرعة وضعف الوظيفة العصبية.

تؤدي السكتة الدماغية الإقفارية إلى فقدان الخلايا في غضون دقائق في قلب الآفة من خلال آليات السمية المثيرة ، والإجهاد التأكسدي والنتروزي ، وخلل تنظيم الكالسيوم ، وإزالة الاستقطاب القشري ، والوذمة ، واضطراب الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، والالتهاب2،3. تخضع الخلايا في المناطق المحيطة بالاحتشاء لموت الخلايا المبرمج في غضون ساعات ، ولعدة أيام ، بعد السكتةالدماغية 4. تتعرض بيئة ما حول الاحتشاء لإشارات مؤيدة ومضادة للالتهابات تؤدي إلى تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية (الخلايا النجمية "التفاعلية") ، والتي تلعب أدوارا متنوعة بعد الإصابة5،6،7،8. تخضع الخلايا النجمية التفاعلية لعدد من التغييرات المظهرية التي تشمل تنظيم البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، وتشكيل حدود حول الآفة في غضون أيام بعد السكتة الدماغية مما يساعد على الحد من مدى الآفة بالإضافة إلى التأثير على المرونة العصبية داخل الأنسجة المصابة8،9،10.

تسمح إعادة البرمجة الخلوية المباشرة بتحويل نوع واحد من الخلايا الناضجة إلى نوع خلية ناضجة مختلف دون المرور بحالة متعددة القدرات11. يمثل تحويل خلايا الدماغ المقيمة إلى خلايا عصبية جديدة لاستبدال تلك التي فقدت بسبب الإصابة وسيلة جذابة لاستعادة الدماغ. تعتبر السكتة الدماغية هدفا مثاليا للعلاجات القائمة على الخلايا ، نظرا لضرورة الأساليب العلاجية لاستبدال الخلايا العصبية المفقودة ، وتوسيع الإطار الزمني العلاجي ، وتسهيل التعافي الوظيفي في النهاية. تحقيقا لهذه الغاية ، كان هناك العديد من الأوراق التي توضح إعادة برمجة الخلايا النجمية للخلايا العصبية (AtN) في المختبر وفي الجسم الحي ، باستخدام مجموعة متنوعة من عوامل النسخ العصبية الأساسية الحلزونية الحلزونية (bHLH) ، بما في ذلك Ascl1 و Neurog2 و Neurod1 ومؤخرا ، الإصدارات المتحولة من Ascl1 (Ascl1-SA6) والتي أظهرت فعالية إعادة برمجةمحسنة 11،12،13،14. من المهم مراعاة العديد من عوامل التصميم التجريبية التي يمكن أن تؤثر على النتائج والتفسير والمقارنات بين الدراسات. غزال وآخرون أظهر أن كفاءة إعادة برمجة AtN تختلف بين سلالات الفئران المختلفة ، والأنماط المصلية AAV ، والمحفزات عند استخدام نفس عامل النسخ bHLH14. ستؤثر اعتبارات أخرى ، مثل نموذج الإصابة ، ومنطقة الدماغ ، والجرعات الفيروسية ، وتوقيت توصيل الجينات ، وعامل إعادة البرمجة ، وطريقة التسليم ، على النتائج. أظهرت التقارير الحديثة أن الخلايا العصبية المنقولة الموجودة مسبقا قد أسيء تفسيرها على أنها خلايا عصبية معاد برمجتها15،16. في حين أن التقارير لا تنفي بالضرورة حدوث تحويل AtN ، فقد سلطت هذه الدراسات الضوء على أهمية التجارب التي يتم التحكم فيها جيدا ، وقدمت العديد من الأوراق توصيات للخطوات التالية في هذا المجال15،17،18،19. ما يتضح من الأدبيات هو أن التعبير خارج الرحم لعوامل النسخ bHLH يمكن أن يحسن النتائج الوظيفية في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية لمرض / إصابة التنكس العصبي13،20،21،22،23،24.

هنا ، يتم التعبير عن هذا البروتوكول Neurod1 ، وهو عامل نسخ مثير للاهتمام ، خارج الرحم في الخلايا المنقولة13،22. يتم استخدام نموذج البطانة -1 (ET-1) الراسخ للسكتة الدماغية الإقفارية في القشرة الحسية الحركية في الفئران البالغة. يؤدي حقن ET-1 إلى تضيق الأوعية الموضعي الذي يحاكي الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية الإقفارية ، بما في ذلك الضعف الوظيفي22،23،25. يتم استخدام محفز GFAP القصير المستخدم بشكل شائع (gfaABC (1) D) لدفع التعبير خارج الرحم ل Neurod1 في موقع الإصابة والمنطقة المحيطة بالجفاف باستخدام استراتيجيتين فيروسيتين: (1) AAV5-CAG-Flex:: GFP + AAV5-GFAP-Neurod1-Cre في الفئران البرية و (2) توصيل AAV5-GFAP-Neurod1-Cre في الفئران المراسلة tdTom-Cre. لفهم إمكانية التعبير خارج الرحم ل Neurod1 في الدماغ المصاب بالسكتة الدماغية ، تم تسليم AAVs في المرحلة تحت الحادة (7 أيام) ، أو في المرحلة المزمنة (21 يوما) ، بعد السكتة الدماغية. في كلا النموذجين ، تم العثور على المزيد من الخلايا العصبية المسماة بشكل ملحوظ في غضون أسابيع بعد تعبير Neurod1 خارج الرحم.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية في جامعة تورنتو ويلتزم بدليل رعاية واستخدام التجارب (الطبعة الثانية ، المجلس الكندي لرعاية ، 2017). في هذه الدراسة ، من النوع البري (C57BL / 6J) ومراسل tdTom-Cre المعدل وراثيا (B6. تم استخدام Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J) 22 سلالة من الفأر. كانت الفئران تتراوح أعمارها بين 7 و 9 أسابيع وشملت كلا من الذكور والإناث. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. جراحة السكتة الدماغية بطانة الرحمن -1

ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات والمواد الجراحية بواسطة الأوتوكلاف قبل الجراحة. يتم تعقيم الإطار التجسيمي باستخدام PREempt. يتم تعقيم المحاقن باستخدام PREempt ، 70٪ كحول ، ويتم تحضيرها باستخدام PBS معقم قبل الجراحة. يتم تخزين Endothelin-1 (ET-1) على الجليد طوال الجراحة.

  1. قبل بدء الجراحة ، قم بإعداد منطقة التعافي عن طريق وضع قفص نظيف على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، إذا تم استخدام مصباح تسخين ، ضع نصف القفص فقط تحت الحرارة.
    1. لتخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران ، اتبع البروتوكول المعتمد من قبل لجنة رعاية. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير وقم بتشغيل الأكسجين على 1-1.5 لتر / دقيقة ، ثم اضبط مبخر الأيزوفلوران على 3٪ -5٪ لبدء التخدير.
  2. أخرج من الغرفة بمجرد وضعه على جانبه ولم يعد قادرا على الوقوف ، وضعه على سطح نظيف. تأكد من تخدير بشكل كاف عن طريق التأكد من عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم قبل الجراحة وأثناءها.
    1. قم بتأمين مخروط الأنف الممتد من جهاز التخدير على واضبط الأيزوفلوران على 1٪ -2٪ للصيانة. قلل من التعرض للأيزوفلوران (5 دقائق عند 3٪ -5٪ للتحريض والوقت المتبقي عند 1٪ -2٪) ، حيث يمكن أن يستغرق الإجراء ما يصل إلى 40 دقيقة حتى يكتمل.
  3. استخدم أدوات تشذيب شعر لإزالة الفراء من الرقبة / خلف الأذنين إلى أنف لكشف الجلد على الجمجمة لإجراء الجراحة.
  4. يجب وزن وإعطاء الجرعة المناسبة من مسكن ما قبل الجراحة تحت الجلد (ميلوكسيكام (2.0 ملغم/كغ)) بناء على الوزن.
  5. ضع مرهم تشحيم العين على كل عين من عيني الفأر لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
  6. عقيم منطقة الجلد المقطوع بالفراء (الخطوة 1.3) بنسبة 70٪ إيثانول ، متبوعا بكحول الكلورهيكسيدين مرتين لتشكيل مجال جراحي.
  7. انقل الماوس إلى إطار تجسيمي للماوس عن طريق وضع أنفه أولا في مخروط الأنف التجسيمي ، ثم قم بتثبيت الجمجمة بقضبان الأذن. احتفظ بالماوس على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية للحصول على الدعم الحراري طوال عملية الجراحة. حافظ على الأيزوفلوران عند 1٪ -2٪ بحيث يعرض الفأر معدل تنفس 1 نفس / ثانية.
  8. كرر تطبيق تزييت العين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية إذا لزم الأمر. ضع ستارة جراحية معقمة على جسم الفأر ، أسفل الأذنين ، لتمديد حجم المجال المعقم.
  9. قم بعمل شق رأسي مواز للمستوى السهمي للحيوان من خلف منتصف العينين إلى مؤخرة الرأس (العظم الجداري) بشفرة مشرط # 10. كشف الجمجمة عن طريق سحب الجلد برفق نحو الجانبين.
  10. استخدم طرف Q لتعطيل اللفافة على الجمجمة والسماح للجمجمة بالجفاف لكشف البريجما.
  11. قم بإعداد أذرع مناور مع حامل مثقاب يحمل مثقابا تجسيما عالي السرعة مع مثقاب .018 بوصة.
  12. قم بحفر 3 ثقوب لدغ (قطر .018 بوصة) باستخدام مثقاب تجسيمي عالي السرعة عند الإحداثيات في القشرة الحسية الحركية اليمنى عند 2.25 مم جانبيا إلى بريجما و +0.0 مم منقارية و +1.0 مم منقارية و -1.0 مم ذيلية إلى بريجما.
  13. استبدل المثقاب بحقنة 26 جرام بإبرة بطول 0.375 بوصة.
  14. قم بتحميل 1.5 ميكرولتر من 400 ميكرومتر ET-1 مذاب في PBS معقم في المحقنة. لضمان تدفق جيد ، حرر حجما صغيرا من ET-1 حتى يمكن ملاحظة قطرة عند طرف الإبرة. استخدم طرف Q معقم لمسح الفائض قبل إجراء الحقن.
  15. اخفض طرف الإبرة بعد الجمجمة في فتحة الأزيز الوسطى (في القشرة الحسية الحركية اليمنى عند + 0.0 أمامي و 2.25 مم جانبي إلى بريجما) دون ثقب الأم الجافية. بمجرد محاذاة الإبرة 1 مم في الدماغ.
  16. حقن 1 ميكرولتر من ET-1 عن طريق توزيع 0.1 ميكرولتر في المرة الواحدة. ادفع مكبس حقنة هاميلتون للأمام لتوزيع 0.1 ميكرولتر وانتظر لمدة دقيقة قبل حقن 0.1 ميكرولتر التالي ، وحقن حتى يتم توزيع 1 ميكرولتر.
    1. بعد الاستغناء عن 0.1 ميكرولتر النهائي (0.1 ميكرولتر × 10 حقن = إجمالي 1 ميكرولتر) ، احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 10 دقائق لمنع التدفق العكسي ثم اسحب ببطء لأعلى لإزالة المحقنة.
  17. لضمان عدم انسداد الإبرة أثناء الحقن ، حرر حجما صغيرا من ET-1 حتى يمكن ملاحظة قطرة عند طرف الإبرة. استخدم طرف Q معقم لمسح الفائض قبل إجراء الحقن. عقم المحاقن قبل حقن التالي ب PREempt ، متبوعا ب 70٪ كحول ، ثم PBS معقم.
  18. لإغلاق الجرح ، قم بخياطة الجلد المغطى بالجمجمة معا باستخدام خياطة معقمة بوليستر 4-0.
  19. قم بتطبيق مرهم المضادات الحيوية باستخدام قطعة قطن على المنطقة المخيطة لمنع عدوى ما بعد الجراحة.
  20. قم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي وانقله إلى قفص سكن نظيف ومسخن مسبقا في منطقة الاسترداد. قم بإيقاف تشغيل مبخر الأيزوفلوران والأكسجين.
  21. احتفظ بالقفص فوق وسادة التدفئة طوال مدة التعافي من التخدير. بدلا من ذلك ، إذا كنت تستخدم مصباح تسخين ، ضع الماوس على جانب القفص أسفل المصباح حتى يتمكن الماوس من الانتقال إلى الجانب البارد من القفص أثناء استيقاظه من التخدير لمنع ارتفاع درجة الحرارة. راقب الماوس عند خروجه من التخدير في 5-10 دقائق القادمة.
  22. مراقبة الفأر على مدار الأيام الثلاثة القادمة (مراقبة الوزن) ، وتقديم رعاية ما بعد الجراحة (طعام مهروس رطب لضمان الترطيب) ، والمسكنات (2 مجم / كجم ميلوكسيكام ، مرتين يوميا تحت الجلد ، لمدة 2-3 أيام) وفقا للوائح التي وضعتها لجنة رعاية المحلية.

2. ولادة الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) (7 أيام - نموذج تحت الحاد أو 21 يوما - نموذج مزمن) بعد السكتة الدماغية

تنبيه: راجع إرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية للعمل مع AAVs. وفقا للإرشادات في جامعة تورنتو ، يتم إجراء هذه الجراحة في خزانة السلامة البيولوجية من المستوى 2 للاحتواء.

ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات والمواد الجراحية بواسطة الأوتوكلاف قبل الجراحة. يتم تعقيم الإطار التجسيمي باستخدام PREempt. يتم تعقيم المحاقن باستخدام PREempt ، 70٪ كحول ، ويتم تحضيرها باستخدام PBS المعقم. يتم تخزين AAVs على الجليد طوال الجراحة.

  1. قبل بدء الجراحة ، قم بإعداد منطقة التعافي عن طريق وضع قفص نظيف على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، إذا تم استخدام مصباح تسخين ، ضع نصف القفص فقط تحت الحرارة.
    1. لتخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران ، ضع الفأر في غرفة تحريض التخدير وقم بتشغيل الأكسجين إلى 1-1.5 لتر / دقيقة ، ثم اضبط مبخر الأيزوفلوران على 3٪ -5٪ لبدء التخدير (باتباع البروتوكولات المعتمدة بشكل علمي).
  2. أخرج من الغرفة بمجرد وضعه على جانبه ولم يعد بإمكانه الوقوف على سطح نظيف. تأكد من تخدير بشكل كاف عن طريق التأكد من عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم قبل الجراحة وأثناءها.
    1. قم بتأمين مخروط الأنف الممتد من جهاز التخدير على واضبط الأيزوفلوران على 1٪ -2٪ للصيانة. قلل من التعرض للأيزوفلوران (5 دقائق عند 3٪ -5٪ للتحريض والوقت المتبقي عند 1٪ -2٪) ، حيث يمكن أن يستغرق الإجراء ما يصل إلى 40 دقيقة حتى يكتمل.
  3. يجب وزن وإعطاء الجرعة المناسبة من مسكن ما قبل الجراحة تحت الجلد (ميلوكسيكام (2.0 ملغم/كغ)) بناء على الوزن.
  4. ضع مرهم زيوت التشحيم للعين على كل عين من عيني الفأر لمنع جفاف القرنية من التخدير.
  5. عقيم منطقة الجلد المقصوصة بالفراء بنسبة 70٪ إيثانول ، متبوعا بكحول الكلورهيكسيدين مرتين لتشكيل مجال جراحي.
  6. انقل الماوس إلى إطار تجسيمي للماوس عن طريق وضع أنفه أولا في مخروط الأنف التجسيمي ، ثم قم بتثبيت الجمجمة بقضبان الأذن. احتفظ بالماوس على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية للحصول على الدعم الحراري طوال عملية الجراحة. حافظ على الأيزوفلوران عند 1٪ -2٪ بحيث يعرض الفأر معدل التنفس 1 نفس / ثانية.
  7. كرر تطبيق تزييت العين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية إذا لزم الأمر. ضع ستارة جراحية معقمة على جسم الفأر ، أسفل الأذنين ، لتوسيع حجم المجال المعقم.
  8. إذا كان لا يزال موجودا ، فقم بقطع الغرز بزوج من المقص الجراحي وإزالة الجرب بزوج من الملقط. اسحب الجلد لكشف الجمجمة.
    ملاحظة: بالنسبة للنموذج المزمن ، قد يكون من الضروري استئصال الجلد بشفرة مشرط # 10.
  9. استخدم طرف Q معقم لتجفيف الجمجمة وتحديد موقع فتحات الأزيز.
  10. قم بإعداد أذرع مناور للجهاز التجسيمي مع حامل إبرة يحمل حقنة 26 G بإبرة بطول 0.375 بوصة.
  11. قم بتحميل 3.4 ميكرولتر من AAV (1 × 109 نسخ جينوم (GC) / ميكرولتر للدراسة الحادة ؛ 1 × 1010 GC / ميكرولتر للدراسة المزمنة) في المحقنة. للتأكد من أن التدفق جيد ، حرر كمية صغيرة من AAV حتى يمكن ملاحظة قطرة عند طرف الإبرة. استخدم طرف Q معقم لمسح الفائض قبل إجراء الحقن.
  12. اخفض طرف الإبرة بعد الجمجمة في ثقب الأزيز الأول المستخدم ل ET-1 (في القشرة الحسية الحركية اليمنى عند + 0.0 أمامي و 2.25 مم جانبي إلى بريجما) دون ثقب الأم الجافية. بمجرد محاذاة الإبرة 1 مم في الدماغ. (0 نقطة وصول ، +2.25 مل ، −1.0 DV من بريجما).
  13. حقن 1 ميكرولتر من AAV (1 × 109 GC / ميكرولتر للدراسة الحادة ؛ 1 × 1010 GC / ميكرولتر للدراسة المزمنة) عن طريق توزيع 0.1 ميكرولتر في المرة الواحدة. ادفع مكبس حقنة هاميلتون للأمام لتوزيع 0.1 ميكرولتر وانتظر دقيقة قبل حقن 0.1 ميكرولتر التالي ؛ حقن حتى يتم صرف 1 ميكرولتر. بعد الاستغناء عن 0.1 ميكرولتر النهائي (0.1 ميكرولتر × 10 حقن = إجمالي 1 ميكرولتر) ، احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 10 دقائق لمنع التدفق العكسي ثم اسحب ببطء لأعلى لإزالة المحقنة.
  14. لضمان عدم انسداد الإبرة أثناء الحقن ، حرر حجما صغيرا من AAV حتى يمكن ملاحظة قطرة عند طرف الإبرة. استخدم طرف Q معقم لمسح الفائض قبل إجراء الحقن.
  15. كرر الخطوات 2.11-2.14 لحقن AAV في فتحتي الأزيز المتبقيين (في القشرة الحسية الحركية اليمنى عند +1 AP ، +2.25 مل ، −1.0 DV ؛ و −1 AP ، +2.25 مل ، −1.0 DV من bregma. تعقيم المحاقن قبل حقن التالي ب PREempt ، متبوعا ب 70٪ كحول ، وأخيرا PBS معقم.
  16. لإغلاق الجرح ، قم بخياطة الجلد المغطى بالجمجمة معا باستخدام خياطة معقمة بوليستر 4-0.
  17. يجب تطبيق مرهم المضادات الحيوية باستخدام قطعة قطن على المنطقة المخيطة للوقاية من العدوى بعد الجراحة.
  18. قم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي وانقله إلى قفص سكن نظيف ومسخن مسبقا في منطقة الاسترداد. قم بإيقاف تشغيل مبخر الأيزوفلوران والأكسجين.
  19. احتفظ بالماوس داخل القفص وقم بتعقيم الجزء الخارجي من القفص باستخدام PREempt و 70٪ كحول قبل وضعه فوق وسادة التدفئة للتعافي من التخدير.
    1. بدلا من ذلك ، إذا كنت تستخدم مصباح تسخين ، فضع الماوس على جانب القفص أسفل المصباح حتى يتمكن الماوس من الانتقال إلى الجانب البارد من القفص أثناء استيقاظه من التخدير لمنع ارتفاع درجة الحرارة. راقب الماوس عند خروجه من التخدير في 5-10 دقائق القادمة.
  20. راقب الفأر على مدار الأيام الثلاثة القادمة (مراقبة الوزن) ، وقدم رعاية ما بعد الجراحة (طعام مهروس رطب لضمان الترطيب) ، والمسكنات (2 مجم / كجم ميلوكسيكام ، مرتين يوميا تحت الجلد ، لمدة 2-3 أيام) وفقا للوائح التي وضعتها لجنة رعاية المحلية.

3. تحضير الأنسجة وتشريحها

  1. للقتل الرحيم للفأر ، قم بحقن الفأر داخل الصفاق بثلاثي البروم الإيثانول (أفيرتين) (conc. 12.5 مجم / مل ، 250 مجم / وزن أبيض (كجم)) واترك 2-3 دقائق للحث الكامل. تأكد من تخدير بشكل كاف عن طريق إخراج الفأر من القفص والتأكد من عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.
  2. في غطاء الدخان ، قم بإجراء نضح عبر القلب26 مع محلول ملحي متبوعا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد. رش رأس القتل الرحيم بنسبة 70٪ من الإيثانول حتى ينقع.
  3. قطع الرأس من قاعدة الجمجمة باستخدام زوج من المقص الكبير. اقطع الجلد على طول خط الوسط للجمجمة بأكملها باستخدام مقص قزحية مستقيم مقاس 4-1 / 2 بوصة. اسحب الجلد لكشف الجمجمة.
  4. من فتحة التجويف الشوكي في الرقبة ، أدخل مقص القزحية واقطع الجمجمة على طول الخيط السهمي وبين الجبهة.
  5. ثم أدخل المقص في تجويف العين واقطع خياطة الأنف الأمامية.
  6. احرص بشكل خاص على عدم إتلاف الدماغ. افتح صفائح الجمجمة إلى اليسار واليمين حتى ينكشف الدماغ.
  7. انقل الدماغ إلى قارورة تلألؤ تحتوي على 4٪ بارافورمالدهايد. احتفظ بالدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات.
  8. ثم يتم حماية الدماغ بالتبريد عن طريق استبدال 4٪ بارافورمالدهيد بنسبة 30٪ سكروز. حافظ على الدماغ في 30٪ سكروز عند 4 درجات مئوية حتى يغرق الدماغ في قاع القارورة (~ 12 ساعة).

4. تقسيم الأدمغة المجمدة

  1. اضبط درجة حرارة غرفة التبريد بين -20 درجة مئوية إلى -26 درجة مئوية.
  2. قم بعمل قطع إكليلي عبر المخيخ وقم بتوصيل الجزء الذيلي المسطح من الدماغ بظرف ناظم البرد بمركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT).
  3. ضع ظرف الظرف مع الدماغ في حامل القرص وقم بمحاذاة البصلة الشمية بشفرة السكين.
  4. قسم الدماغ إلى شرائح إكليلية بسمك 20 ميكرومتر. لتجنب الخطوط أو خطوط الخدش على شرائح الدماغ المجزأة ، ضع قطعة من الشريط على منصة التقسيم لإنشاء فجوة صغيرة بين اللوحة المضادة للتدحرج والمنصة. يمكن استخدام فرشاة الرسم لضبط اتجاه القسم قبل التقاطه على شريحة زجاجية موجبة الشحنة.
  5. قم بتخزين الشرائح التي تحتوي على أقسام الدماغ عند -20 درجة مئوية.

5. الكيمياء المناعية والقياس الكمي

  1. قم بمعالجة أقسام الكيمياء النسيجية المناعية باستخدام جسم مضاد أولي ضد NeuN ، وهي علامة عموم الخلايا العصبية ، وفقا للبروتوكولات القياسية22،26.
  2. قم بإذابة أقسام الدماغ المحفوظة بالتبريد لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأقسام ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  3. احتضان الأقسام في 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للنفاذ.
  4. تحضير محلول الحجب (5٪ مصل ماعز عادي و 0.3٪ Triton X-100 في PBS) واحتضان الأقسام في محلول الحجب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تمييع الجسم المضاد الأساسي ، الأرانب المضادة ل NeuN ، بنسبة 1: 500 في محلول الحظر. احتضان الأقسام بمحلول الجسم المضاد الأساسي طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  6. اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام 0.3٪ Triton X-100 في PBS ، لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
  7. تمييع الجسم المضاد الثانوي ، الماعز المضاد للأرانب 568 أو 488 ، بنسبة 1: 1000 في PBS. احتضان الأقسام بمحلول الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
  8. قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 0.3٪ Triton X-100 في PBS ، لمدة 5 دقائق لكل منها. احتضان الأقسام باستخدام DAPI (1: 10,000 في PBS) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. اغسل الأقسام ثلاث مرات أخرى باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها. قم بتركيب الأقسام الملونة على شريحة زجاجية مع وسيط تثبيت مضان وغطاء زجاجي. اترك الشرائح المثبتة تجف طوال الليل.
  10. صورة ملطخة الشرائح باستخدام هدف 20x مع مجهر متحد البؤر للحصول على مناظر لخلايا Reporter + حول آفة السكتة الدماغية في 3 أقسام إكليلية مختلفة (بين المناطق التشريحية لعبور الجسم الثفني الأمامي للأمام وعبور العمولة الأمامية للخلف) لكل.
    ملاحظة: ستختلف مسافة انتشار AAV داخل نصف الكرة الأرضية. ومع ذلك ، بناء على خبرتنا وتحليل ما بعد معالجة الأنسجة لخلايا Reporter + ، يمتد انتشار AAV بشكل عام إلى حوالي +3 مم إلى -3 مم من بريجما. يجب تحديد الخلايا المراسلة + حول آفة السكتة الدماغية (كما هو محدد من خلال غياب / تلطيخ متفرق ل NeuN) في المنطقة الواقعة بين المكان الذي يعبر فيه الجسم الثفني خط الوسط واتصال المسار الأمامي.
  11. لقياس كمية الخلايا العصبية المنقولة ، قم بإجراء تحليل التجميع. احسب يدويا عدد الخلايا الإيجابية المزدوجة (Reporter + NeuN +) والعدد الإجمالي للخلايا المنقولة (Reporter +) في شرائح الدماغ. للحصول على النتائج الواردة هنا ، تم حساب >3 مجالات رؤية تحيط بالآفة (الإنسية والجانبية والسفلية) من 3 أقسام إكليلية لكل فأر.

النتائج

لفحص النتائج الخلوية لتعبير المحفز القصير GFAP (gfaABC (1) D) ، والتعبير Neurod1 خارج الرحم في النوع البري (C57BL / 6J) وفي سلالات مراسل tdTom-Cre المعدلة وراثيا (على وجه التحديد ، B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J) 22 تم استخدام نظامين يستندان إلى AAV5 في الفئران المصابة بالسك?...

Discussion

يفصل هذا البروتوكول نظامين من AAV ونماذج الفئران للتحقيق في التعبير خارج الرحم ل Neurod1 في سياق نموذج السكتة الدماغية القشرية ET-1 المعتدل المعتدل. من المهم مراعاة عدد من الخطوات الحاسمة المتعلقة بسكتة الدماغة ET-1 من أجل قابلية تكرار واتساق الإصابة. يجب حفر ثقوب الأزيز بع...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة القلب والسكتة الدماغية ، ومعهد أونتاريو للطب التجديدي ، وصندوق كندا الأول للتميز البحثي (الطب حسب التصميم ، MBD) ، وجائزة Connaught للابتكار (جامعة تورنتو).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#77 Drill Bit (.018”)David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb™ Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Needle Size 4 - 0 BraidedCovidienGL-881
Anti-NeuN Antibody (rabbit) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 MiceCharles River027
Chlorhexidine SolutionPartnarPCH-020
Contec™ PREempt™ RTU Disinfectant SolutionFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Feather Safety Razor Microtome BladesFeather12-631P
Fisherbrand Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-545M 
Fluorescence Mounting MediumAgilent TechnologiesS3023 
Hamilton SyringeHamilton Company7634-01
High Speed Stereotaxic DrillDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Polyderm Ointment USPTARO2181908
SOMNI Scientific™ The Animal Temperature Heating PadFisher Scientific04-777-177
Stereotaxic InstrumentsDavid Kopf InstrumentsModel 902
Superfrost Plus Microscope Slides, whiteFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice The Jackson Laboratory007914
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901806

References

  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609 (2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507 (2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087 (2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071 (2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531 (2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717 (2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490 (2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663 (2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107 (2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105 (2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786 (2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102 (2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856 (2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310 (2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59 (2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401 (2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115 (2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244 (2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

AAV Neurod1 BHLH GFAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved