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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit l’expression ectopique de Neurod1 à médiation virale après un AVC ischémique cortical. Neurod1 est administré (1) à l’aide du système AAV Cre-Flex chez des souris de type sauvage pendant la phase subaiguë post-AVC (7 jours) et (2) à l’aide d’un seul vecteur AAV chez des souris rapporteures conditionnelles pendant la phase chronique post-AVC (21 jours).

Résumé

L’expression ectopique de facteurs neurogènes in vivo est apparue comme une approche prometteuse pour remplacer les neurones perdus dans des modèles de maladies. L’utilisation de facteurs de transcription neuraux basic helix-loop-helix (bHLH) via des systèmes de particules pseudo-virales non propagateurs, y compris les rétrovirus, les lentivirus et les virus adéno-associés (AAV), a été largement rapportée. Pour les expériences in vivo , les AAV sont de plus en plus utilisés en raison de leur faible pathogénicité et de leur potentiel de traductibilité. Ce protocole décrit deux systèmes AAV pour étudier l’expression ectopique des facteurs de transcription dans les cellules transduites après un AVC ischémique. Dans les deux systèmes, l’expression de Neurod1 est contrôlée par le promoteur court GFAP (gfaABC(1)D), qui est régulé à la hausse dans les astrocytes réactifs après un AVC ainsi que dans les neurones endogènes lorsqu’il est combiné à l’expression du facteur neurogène. Dans le modèle d’AVC ischémique décrit, l’ischémie focale est induite par l’injection d’endothéline-1 (ET-1) dans le cortex moteur de souris, créant une lésion entourée d’astrocytes réactifs exprimant GFAP et de neurones survivants. Des injections intracérébrales d’AAV sont effectuées pour induire ectopiquement l’expression de Neurod1 dans les phases subaiguës (7 jours) et chroniques (21 jours) post-AVC. Dans les semaines qui suivent l’injection d’AAV, un nombre significativement plus élevé de neurones parmi les cellules transduites est identifié chez les souris exprimant extopiquement Neurod1 par rapport aux souris recevant des virus de contrôle AAV. Les stratégies basées sur l’AAV utilisées ont reproduit les résultats observés d’un nombre accru de neurones exprimant le gène rapporteur dans un modèle d’AVC cortical léger à modéré. Ce protocole établit une plate-forme standard pour explorer les effets de l’expression ectopique des facteurs de transcription délivrés avec des systèmes basés sur l’AAV, contribuant ainsi à la compréhension de l’expression des facteurs neurogènes dans le contexte de l’AVC.

Introduction

L’AVC est l’une des principales causes d’invalidité dans le monde1. Un accident vasculaire cérébral se produit lorsque le flux sanguin vers le cerveau est perturbé. Cela peut se produire soit par un accident vasculaire cérébral hémorragique (~15 % des cas), où un vaisseau sanguin dans le cerveau éclate, soit par un accident vasculaire cérébral ischémique, où le flux sanguin vers le cerveau est bloqué1. Les accidents vasculaires cérébraux ischémiques sont les plus fréquents et représentent ~85 % des cas d’accident vasculaire cérébral1. Un accident vasculaire cérébral réduit l’apport de glucose et d’oxygène au cerveau, entraînant une mort rapide des cellules neuronales et une altération de la fonction neuronale.

L’AVC ischémique entraîne la perte de cellules en quelques minutes au cœur de la lésion par des mécanismes d’excitotoxicité, de stress oxydatif et nitrosatif, de dérégulation calcique, de dépolarisation de l’étalement cortical, d’œdème, de perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et d’inflammation 2,3. Les cellules des régions péri-infarctus subissent une mort cellulaire apoptotique dans les heures et les jours qui suivent l’AVC4. L’environnement péri-infarctus est exposé à des signaux pro- et anti-inflammatoires qui conduisent à l’activation de la microglie et des astrocytes (astrocytes « réactifs »), qui jouent divers rôles après une blessure 5,6,7,8. Les astrocytes réactifs subissent un certain nombre de changements phénotypiques qui comprennent la régulation positive de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et la formation d’une bordure autour de la lésion dans les jours suivant l’AVC qui aide à limiter l’étendue de la lésion et affecte la neuroplasticité dans le tissu blessé 8,9,10.

La reprogrammation cellulaire directe permet de convertir un type de cellule mature en un autre type de cellule mature sans passer par un état pluripotent11. Transformer les cellules cérébrales résidentes en nouveaux neurones pour remplacer ceux perdus à cause des blessures présente une voie attrayante pour la restauration du cerveau. L’AVC est une cible idéale pour les traitements cellulaires, étant donné la nécessité de disposer de méthodes thérapeutiques pour remplacer les neurones perdus, élargir le délai thérapeutique et, en fin de compte, faciliter la récupération fonctionnelle. À cette fin, de nombreux articles ont démontré la reprogrammation de l’astrocyte au neurone (AtN) in vitro et in vivo, en utilisant une variété de facteurs de transcription neurogènes basic-helix-loop-helix (bHLH), y compris Ascl1, Neurog2, Neurod1 et plus récemment, des versions mutées d’Ascl1 (Ascl1-SA6) qui ont démontré une efficacité de reprogrammation améliorée 11,12,13,14 . Il est important de tenir compte des nombreux facteurs de conception expérimentale qui peuvent avoir une incidence sur les résultats, l’interprétation et les comparaisons entre les études. Ghazale et al. ont démontré que l’efficacité de reprogrammation de l’AtN variait entre différentes souches de souris, sérotypes AAV et promoteurs lors de l’utilisation du même facteurde transcription bHLH 14. D’autres considérations, telles que le modèle de lésion, la région du cerveau, le dosage viral, le moment de l’administration des gènes, le facteur de reprogrammation et le mode d’administration, auront une incidence sur les résultats. Des rapports récents ont démontré que les neurones transduits préexistants ont été interprétés à tort comme des neurones reprogrammés15,16. Bien que les rapports ne nient pas nécessairement que la conversion AtN se produit, ces études ont souligné l’importance d’expériences bien contrôlées, et plusieurs articles ont formulé des recommandations pour les prochaines étapes dans le domaine 15,17,18,19. Ce qui ressort de la littérature, c’est que l’expression ectopique des facteurs de transcription bHLH peut améliorer les résultats fonctionnels dans une variété de modèles animaux de maladies/lésions neurodégénératives 13,20,21,22,23,24.

Ici, ce protocole Neurod1, un facteur de transcription d’intérêt, est exprimé de manière ectopique dans les cellules transduites13,22. Le modèle endothéline-1 (ET-1) bien établi de l’AVC ischémique au cortex sensorimoteur chez les souris adultes est utilisé. L’injection d’ET-1 entraîne une vasoconstriction locale imitant la physiopathologie de l’AVC ischémique, y compris une déficience fonctionnelle 22,23,25. Le promoteur de la GFAP courte (gfaABC(1)D) couramment utilisé est utilisé pour piloter l’expression ectopique de Neurod1 au site de la lésion et dans la région périlésionnelle à l’aide de deux stratégies virales : (1) l’administration d’AAV5-CAG-Flex ::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre chez les souris de type sauvage et (2) l’administration d’AAV5-GFAP-Neurod1-Cre chez les souris rapporteures tdTom-Cre. Pour mieux comprendre le potentiel d’expression ectopique de Neurod1 dans le cerveau blessé par un AVC, les AAV ont été administrés dans la phase subaiguë (7 jours) ou dans la phase chronique (21 jours) après l’AVC. Dans les deux paradigmes, un nombre significativement plus élevé de neurones marqués a été trouvé dans les semaines suivant l’expression ectopique de Neurod1.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux de l’Université de Toronto et est conforme au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation (2e édition, Conseil canadien de protection des animaux, 2017). Pour cette étude, le rapporteur tdTom-Cre de type sauvage (C57BL/6J) et transgénique (B6. Des souches de souris Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 ont été utilisées. Les souris étaient âgées de 7 à 9 semaines et comprenaient des mâles et des femelles. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Chirurgie de l’AVC de l’endothéline-1

REMARQUE : Tous les instruments et matériaux chirurgicaux sont stérilisés par autoclave avant l’opération. Le cadre stéréotaxique est stérilisé avec PREempt. Les seringues sont stérilisées avec PREempt, 70 % d’alcool, et amorcées avec du PBS stérile avant l’opération. L’endothéline-1 (ET-1) est stockée sur de la glace tout au long de la chirurgie.

  1. Avant de commencer l’opération, aménagez la zone de récupération en plaçant une cage propre sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Alternativement, si une lampe chauffante est utilisée, placez seulement la moitié de la cage sous la chaleur.
    1. Pour anesthésier des souris à l’aide d’isoflurane, suivez le protocole approuvé par le Comité de protection des animaux. Placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésique et allumez l’oxygène à 1-1,5 L/min, puis ajustez le vaporisateur d’isoflurane à 3 %-5 % pour initier l’anesthésie.
  2. Retirez l’animal de la chambre une fois qu’il est couché sur le côté et qu’il ne peut plus se tenir debout, et placez-le sur une surface propre. Assurez-vous que l’animal est correctement anesthésié en confirmant l’absence de réflexe de pincement de l’orteil avant et pendant la chirurgie.
    1. Fixez le cône nasal prolongé de l’appareil d’anesthésie sur l’animal et ajustez l’isoflurane à 1 % à 2 % pour l’entretien. Minimisez l’exposition à l’isoflurane (5 min à 3 % à 5 % pour l’induction et le reste à 1 % à 2 %), car la procédure peut prendre jusqu’à 40 min.
  3. Utilisez des tondeuses à poils d’animaux pour enlever la fourrure du cou/derrière les oreilles jusqu’au nez de l’animal afin d’exposer la peau du crâne pour la chirurgie.
  4. Peser l’animal et administrer la dose appropriée d’analgésique préopératoire par voie sous-cutanée (méloxicam (2,0 mg/kg)) en fonction du poids.
  5. Appliquez une pommade lubrifiante pour les yeux sur chaque œil de la souris pour prévenir la dessiccation de la cornée pendant l’anesthésie.
  6. Stérilisez la zone de la peau coupée (étape 1.3) avec de l’éthanol à 70 %, suivi de deux fois de l’alcool de chlorhexidine pour former un champ chirurgical.
  7. Transférez la souris sur un cadre stéréotaxique de souris en plaçant d’abord son nez dans le cône de nez stéréotaxique, puis stabilisez le crâne avec des barres d’oreille. Gardez la souris sur un coussin chauffant réglé à 37 °C pour un soutien thermique tout au long de la procédure chirurgicale. Maintenez l’isoflurane à 1 % à 2 % afin que la souris affiche une fréquence respiratoire de 1 respiration/s.
  8. Répétez l’application de lubrification oculaire pour prévenir la dessiccation de la cornée pendant la procédure si nécessaire. Appliquez un champ chirurgical stérile sur le corps de la souris, sous les oreilles, pour augmenter la taille du champ stérile.
  9. Faites une incision verticale parallèle au plan sagittal de l’animal de l’arrière du milieu des yeux vers l’arrière de la tête (os pariétal) avec une lame de scalpel #10. Explicez le crâne en rétractant doucement la peau vers les côtés.
  10. Utilisez un coton-tige pour perturber le fascia sur le crâne et laissez le crâne sécher pour exposer le bregma.
  11. Installez des bras manipulateurs avec porte-perceuse transportant une perceuse stéréotaxique à grande vitesse avec un foret de 0,018 po.
  12. Percez 3 trous de bavure (0,018" de diamètre) avec une perceuse stéréotaxique à grande vitesse aux coordonnées du cortex sensorimoteur droit à 2,25 mm latéralement au bregma et +0,0 mm rostral, +1,0 mm rostral et -1,0 mm caudal au bregma.
  13. Remplacez la perceuse par une seringue de 26 G avec une aiguille de 0,375" de long.
  14. Chargez dans la seringue 1,5 μL d’ET-1 400 μM dissous dans du PBS stérile. Pour assurer un bon écoulement, libérez un petit volume d’ET-1 jusqu’à ce qu’une goutte puisse être observée à la pointe de l’aiguille. Utilisez un coton-tige stérile pour essuyer l’excédent avant d’effectuer une injection.
  15. Abaissez la pointe de l’aiguille au-delà du crâne dans le trou de la meule centrale (dans le cortex sensorimoteur droit à + 0,0 en avant et à 2,25 mm latéralement du bregma) sans percer la dure-mère. Une fois alignée, abaissez l’aiguille de 1 mm dans le cerveau.
  16. Injectez 1 μL d’ET-1 en distribuant 0,1 μL à la fois. Poussez le piston de la seringue Hamilton vers l’avant pour distribuer 0,1 μL et attendez une minute avant d’injecter les 0,1 μL suivants, injectez jusqu’à ce que 1 μL ait été distribué.
    1. Une fois que le dernier 0,1 μL a été distribué (0,1 μL x 10 injections = 1 μL au total), maintenez l’aiguille en place pendant 10 minutes pour éviter le reflux, puis retirez-la lentement vers le haut pour retirer la seringue.
  17. Pour vous assurer que l’aiguille ne se bloque pas pendant l’injection, relâchez un petit volume de l’ET-1 jusqu’à ce qu’une goutte puisse être observée à la pointe de l’aiguille. Utilisez un coton-tige stérile pour essuyer l’excédent avant d’effectuer une injection. Stérilisez les seringues avant d’injecter à l’animal suivant avec PREempt, suivi d’alcool à 70 %, puis de PBS stérile.
  18. Pour fermer la plaie, suturez la peau sus-jacente du crâne à l’aide d’une suture stérile en polyester polysorb 4-0.
  19. Administrez une pommade antibiotique à l’aide d’un coton-tige sur la zone suturée pour prévenir l’infection postopératoire.
  20. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et transférez-la dans une cage d’hébergement propre et préchauffée dans la zone de récupération. Éteignez le vaporisateur d’isoflurane et l’oxygène.
  21. Gardez la cage sur un coussin chauffant pendant toute la durée de la récupération de l’anesthésie. Alternativement, si vous utilisez une lampe chauffante, placez la souris sur le côté de la cage sous la lampe afin que la souris puisse se déplacer vers le côté froid de la cage lorsqu’elle se réveille de l’anesthésie pour éviter la surchauffe. Surveillez la souris à la sortie de l’anesthésie dans les 5 à 10 prochaines minutes.
  22. Surveiller la souris pendant les 3 prochains jours (surveillance du poids), fournir des soins postopératoires (purée humide pour assurer l’hydratation) et des analgésiques (2 mg/kg de méloxicam, 2 fois par jour par voie sous-cutanée, pendant 2-3 jours) conformément aux réglementations établies par le comité local de protection des animaux.

2. Administration du virus adéno-associé (AAV) (7 jours - modèle subaigu ou 21 jours - modèle chronique) après l’AVC

ATTENTION : Reportez-vous aux lignes directrices de l’établissement en matière de biosécurité pour travailler avec les AAV. Selon les lignes directrices de l’Université de Toronto, cette chirurgie est pratiquée dans une enceinte de biosécurité de niveau de confinement 2.

REMARQUE : Tous les instruments et matériaux chirurgicaux sont stérilisés par autoclave avant l’opération. Le cadre stéréotaxique est stérilisé avec PREempt. Les seringues sont stérilisées avec PREempt, 70 % d’alcool, et amorcées avec du PBS stérile. Les AAV sont stockés sur de la glace tout au long de l’opération.

  1. Avant de commencer l’opération, aménagez la zone de récupération en plaçant une cage propre sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Alternativement, si une lampe chauffante est utilisée, placez seulement la moitié de la cage sous la chaleur.
    1. Pour anesthésier des souris à l’aide d’isoflurane, placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésique et allumez l’oxygène à 1-1,5 L/min, puis ajustez le vaporisateur d’isoflurane à 3 %-5 % pour initier l’anesthésie (en suivant les protocoles approuvés par l’institut).
  2. Retirez l’animal de la chambre une fois qu’il est couché sur le côté et qu’il ne peut plus se tenir sur une surface propre. Assurez-vous que l’animal est correctement anesthésié en confirmant l’absence de réflexe de pincement de l’orteil avant et pendant la chirurgie.
    1. Fixez le cône nasal prolongé de l’appareil d’anesthésie sur l’animal et ajustez l’isoflurane à 1 % à 2 % pour l’entretien. Minimisez l’exposition à l’isoflurane (5 min à 3 % à 5 % pour l’induction et le reste à 1 % à 2 %), car la procédure peut prendre jusqu’à 40 min.
  3. Peser l’animal et administrer la dose appropriée d’analgésique préopératoire par voie sous-cutanée (méloxicam (2,0 mg/kg)) en fonction du poids.
  4. Appliquez une pommade lubrifiante pour les yeux sur chaque œil de la souris pour éviter que la dessiccation de la cornée ne soit sous anesthésie.
  5. Stérilisez la zone de la peau coupée avec de l’éthanol à 70 %, suivi de deux fois de l’alcool de chlorhexidine pour former un champ chirurgical.
  6. Transférez la souris sur un cadre stéréotaxique de souris en plaçant d’abord son nez dans le cône de nez stéréotaxique, puis stabilisez le crâne avec des barres d’oreille. Gardez la souris sur un coussin chauffant réglé à 37 °C pour un soutien thermique tout au long de la procédure chirurgicale. Maintenez l’isoflurane à 1 %-2 % afin que la souris affiche une fréquence respiratoire de 1 respiration/s.
  7. Répétez l’application de lubrification oculaire pour prévenir la dessiccation de la cornée pendant la procédure si nécessaire. Appliquez un champ chirurgical stérile sur le corps de la souris, sous les oreilles, pour augmenter la taille du champ stérile.
  8. S’il est toujours présent, coupez les sutures avec une paire de ciseaux chirurgicaux et retirez la croûte avec une paire de pinces. Rétractez la peau pour exposer le crâne.
    REMARQUE : Pour le modèle chronique, il peut être nécessaire d’exciser la peau avec la lame de scalpel #10.
  9. Utilisez un coton-tige stérile pour sécher le crâne et localiser les trous de bavure.
  10. Installez les bras manipulateurs de l’appareil stéréotaxique avec un porte-aiguille portant une seringue de 26 G avec une aiguille de 0,375" de long.
  11. Chargez 3,4 μL d’AAV (1 x 109 copies du génome (GC)/μL pour l’étude aiguë ; 1 x 1010 GC/μL pour l’étude chronique) dans la seringue. Pour s’assurer que l’écoulement est bon, libérez un petit volume d’AAV jusqu’à ce qu’une goutte puisse être observée à la pointe de l’aiguille. Utilisez un coton-tige stérile pour essuyer l’excédent avant d’effectuer une injection.
  12. Abaissez la pointe de l’aiguille au-delà du crâne dans le premier trou de fraise utilisé pour ET-1 (dans le cortex sensorimoteur droit à + 0,0 antérieur et 2,25 mm latéral au bregma) sans perforer la dure-mère. Une fois alignée, abaissez l’aiguille de 1 mm dans le cerveau. (0 PA, +2,25 ML, -1,0 DV de bregma).
  13. Injecter 1 μL d’AAV (1 x 109 GC/μL pour l’étude aiguë ; 1 x10 10 GC/μL pour l’étude chronique) en distribuant 0,1 μL à la fois. Poussez le piston de la seringue Hamilton vers l’avant pour distribuer 0,1 μL et attendez une minute avant d’injecter les 0,1 μL suivants ; injecter jusqu’à ce que 1 μL ait été distribué. Une fois que le dernier 0,1 μL a été distribué (0,1 μL x 10 injections = 1 μL au total), maintenez l’aiguille en place pendant 10 minutes pour éviter le reflux, puis retirez-la lentement vers le haut pour retirer la seringue.
  14. Pour vous assurer que l’aiguille ne se bloque pas pendant l’injection, libérez un petit volume d’AAV jusqu’à ce qu’une goutte puisse être observée à la pointe de l’aiguille. Utilisez un coton-tige stérile pour essuyer l’excédent avant d’effectuer une injection.
  15. Répétez les étapes 2.11 à 2.14 pour les injections d’AAV dans les deux trous de bavure restants (dans le cortex sensorimoteur droit à +1 PA, +2,25 ML, -1,0 DV ; et -1 PA, +2,25 ML, -1,0 DV mm à partir de bregma. Stérilisez les seringues avant d’injecter à l’animal suivant avec PREempt, suivi d’alcool à 70 %, et enfin de PBS stérile.
  16. Pour fermer la plaie, suturez la peau sus-jacente du crâne à l’aide d’une suture stérile en polyester polysorb 4-0.
  17. Administrez une pommade antibiotique à l’aide d’un coton-tige sur la zone suturée pour prévenir l’infection postopératoire.
  18. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et transférez-la dans une cage d’hébergement propre et préchauffée dans la zone de récupération. Éteignez le vaporisateur d’isoflurane et l’oxygène.
  19. Gardez la souris à l’intérieur de la cage et stérilisez l’extérieur de la cage avec PREempt et de l’alcool à 70 % avant de la placer sur un coussin chauffant pour récupérer de l’anesthésie.
    1. Alternativement, si vous utilisez une lampe chauffante, placez la souris sur le côté de la cage sous la lampe afin que la souris puisse se déplacer vers le côté froid de la cage lorsqu’elle se réveille de l’anesthésie pour éviter la surchauffe. Surveillez la souris à la sortie de l’anesthésie dans les 5 à 10 prochaines minutes.
  20. Surveillez la souris pendant les 3 prochains jours (surveillance du poids), fournissez des soins postopératoires (purée humide pour assurer l’hydratation) et des analgésiques (2 mg/kg de méloxicam, 2 fois par jour par voie sous-cutanée, pendant 2 à 3 jours) conformément aux réglementations établies par le comité local de protection des animaux.

3. Préparation et dissection des tissus

  1. Pour euthanasier la souris, injectez par voie intrapéritonéale du tribromoéthanol (Avertin) (conc. 12,5 mg/mL, 250 mg/p.c. (kg)) et attendez 2 à 3 minutes pour une induction complète. Assurez-vous que l’animal est correctement anesthésié en retirant la souris de la cage et en confirmant l’absence de réflexe de pincement des orteils.
  2. Dans une hotte, effectuer une perfusion transcardique26 avec une solution saline suivie de 4 % de paraformaldéhyde. Vaporisez la tête de l’animal euthanasié avec de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’elle soit trempée.
  3. Coupez la tête à la base du crâne à l’aide d’une paire de gros ciseaux. Ouvrez la peau le long de la ligne médiane de tout le crâne à l’aide de ciseaux à iris droits de 4-1/2 po. Rétractez la peau pour exposer le crâne.
  4. À partir de l’ouverture de la cavité vertébrale au niveau du cou, insérez les ciseaux de l’iris et coupez à travers le crâne le long de la suture sagittale et interfrontale.
  5. Insérez ensuite des ciseaux dans les deux orbites et coupez la suture fronto-nasale.
  6. Faites particulièrement attention à ne pas endommager le cerveau. Ouvrez les plaques crâniennes à gauche et à droite jusqu’à ce que le cerveau soit exposé.
  7. Transférez le cerveau dans un flacon à scintillation avec 4 % de paraformaldéhyde. Maintenir le cerveau dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 4 h.
  8. Le cerveau est ensuite cryoprotégé en remplaçant 4 % de paraformaldéhyde par 30 % de saccharose. Conserver le cerveau dans 30 % de saccharose à 4 °C jusqu’à ce que le cerveau coule au fond du flacon (~12 h).

4. Sectionner des cerveaux congelés

  1. Réglez la température de la chambre du cryostat entre -20 °C et -26 °C.
  2. Faites une coupe coronale à travers le cervelet et fixez la partie plate et caudale du cerveau sur un mandrin de cryostat avec un composé de température de coupe optimale (OCT).
  3. Placez le mandrin avec le cerveau dans le support de disque et alignez le bulbe olfactif avec la lame du couteau.
  4. Sectionnez le cerveau en tranches coronales d’une épaisseur de 20 μm. Pour éviter les traînées ou les rayures sur les tranches de cerveau sectionnées, placez un morceau de ruban adhésif sur la plate-forme de sectionnement pour créer un petit espace entre la plaque anti-roulis et la plate-forme. Un pinceau peut être utilisé pour ajuster l’orientation de la section avant de la capturer sur une lame de verre chargée positivement.
  5. Conservez les lames contenant des sections cérébrales à -20 °C.

5. Immunohistochimie et quantification

  1. Traiter les coupes pour l’immunohistochimie à l’aide d’un anticorps primaire contre NeuN, un marqueur pan-neuronal, selon les protocoles standard22,26.
  2. Décongeler des sections de cerveau cryoconservées pendant 5 minutes à température ambiante. Lavez les sections trois fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 minutes chacune.
  3. Incuber les sections dans 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 20 min à température ambiante pour perméabiliser.
  4. Préparez la solution bloquante (5 % de sérum de chèvre normal et 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS) et incubez les sections dans la solution bloquante pendant 1 h à température ambiante.
  5. Diluer l’anticorps primaire, anti-NeuN de lapin, dans un rapport de 1:500 dans la solution de blocage. Incuber les sections avec la solution d’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C.
  6. Lavez les sections trois fois avec 0,3 % de Triton X-100 dans PBS, pendant 5 minutes à chaque lavage.
  7. Diluer l’anticorps secondaire, chèvre anti-lapin 568 ou 488, à un rapport de 1:1000 dans le PBS. Incuber les sections avec la solution d’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante, à l’abri de la lumière.
  8. Effectuez trois lavages avec 0,3 % de Triton X-100 dans PBS, pendant 5 min chacun. Incuber les sections avec du DAPI (1:10 000 en PBS) pendant 5 min à température ambiante.
  9. Lavez les sections trois fois de plus avec du PBS, pendant 5 minutes chacune. Montez les sections tachées sur une lame de verre à l’aide d’un support de montage à fluorescence et d’une lamelle en verre. Laissez sécher les lames montées pendant la nuit.
  10. Imagez des lames colorées à l’aide d’un objectif 20x avec un microscope confocal pour obtenir des vues des cellules Reporter+ autour de la lésion de l’AVC dans 3 coupes coronales différentes (entre les régions anatomiques du croisement du corps calleux antérieurement et le croisement de la commissure antérieure postérieurement) pour chaque animal.
    REMARQUE : La distance de propagation de l’AAV variera à l’intérieur de l’hémisphère. Cependant, sur la base de notre expérience et de l’analyse post-traitement tissulaire des cellules Reporter+, la propagation de l’AAV s’étend généralement sur environ +3 mm à -3 mm du bregma. Les cellules rapporteures + autour de la lésion de l’AVC (identifiées par l’absence/la coloration clairsemée de NeuN) dans la zone située entre l’endroit où le corps calleux croise la ligne médiane et la commissure antérieure se connecte, doivent être quantifiées.
  11. Pour la quantification des neurones transduits, effectuez une analyse de colocalisation. Comptez manuellement le nombre de cellules doublement positives (Reporter+NeuN+) et le nombre total de cellules transduites (Reporter+) dans les coupes de cerveau. Pour les résultats ici, >3 champs de vision ont été comptés autour de la lésion (médiale, latérale et inférieure) à partir de 3 coupes coronales par souris.

Résultats

Examiner les résultats cellulaires de l’expression ectopique de Neurod1 induite par le promoteur GFAP court (gfaABC(1)D) dans les souches rapporteures de type sauvage (C57BL/6J) et transgéniques (en particulier, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 deux systèmes basés sur AAV5 ont été utilisés chez des souris blessées par un AVC ET-1 (Figure 1A-C). Dans un modè...

Discussion

Ce protocole détaille deux systèmes AAV et des modèles murins pour étudier l’expression ectopique de Neurod1 dans le contexte d’un modèle d’AVC cortical ET-1 léger-modéré. Il est important de prendre en compte un certain nombre d’étapes critiques relatives à l’AVC ET-1 pour assurer la reproductibilité et l’uniformité de la lésion. Les trous de bavure doivent être soigneusement percés sans perforer la dure-mère pour éviter les blessures chirurgicales ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par la Fondation des maladies du cœur et de l’AVC, l’Institut de médecine régénérative de l’Ontario, le Fonds d’excellence en recherche Apogée Canada (Medicine by Design, MbD) et le Prix d’innovation Connaught (Université de Toronto).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
#77 Drill Bit (.018”)David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb™ Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Needle Size 4 - 0 BraidedCovidienGL-881
Anti-NeuN Antibody (rabbit) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 MiceCharles River027
Chlorhexidine SolutionPartnarPCH-020
Contec™ PREempt™ RTU Disinfectant SolutionFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Feather Safety Razor Microtome BladesFeather12-631P
Fisherbrand Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-545M 
Fluorescence Mounting MediumAgilent TechnologiesS3023 
Hamilton SyringeHamilton Company7634-01
High Speed Stereotaxic DrillDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Polyderm Ointment USPTARO2181908
SOMNI Scientific™ The Animal Temperature Heating PadFisher Scientific04-777-177
Stereotaxic InstrumentsDavid Kopf InstrumentsModel 902
Superfrost Plus Microscope Slides, whiteFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice The Jackson Laboratory007914
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901806

Références

  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609 (2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507 (2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087 (2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071 (2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531 (2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717 (2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490 (2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663 (2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107 (2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105 (2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786 (2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102 (2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856 (2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310 (2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59 (2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401 (2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115 (2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244 (2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334 (2019).

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