Sistemas AAV y modelos murinos para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en células transducidas en momentos subagudos y crónicos posteriores al ictus isquémico

Resumen

Este protocolo describe la expresión ectópica mediada por virus de Neurod1 después de un accidente cerebrovascular isquémico cortical. Neurod1 se administra (1) utilizando el sistema Cre-Flex AAV en ratones de tipo salvaje durante la fase subaguda posterior al accidente cerebrovascular (7 días) y (2) utilizando un solo vector AAV en ratones reporteros condicionales durante la fase crónica posterior al accidente cerebrovascular (21 días).

Resumen

La expresión ectópica de factores neurogénicos in vivo ha surgido como un enfoque prometedor para reemplazar las neuronas perdidas en modelos de enfermedad. El uso de factores de transcripción básicos neuronales de hélice-bucle-hélice (bHLH) a través de sistemas de partículas similares a virus que no se propagan, incluidos retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados (AAV), ha sido ampliamente reportado. Para experimentos in vivo , los AAV se utilizan cada vez más debido a su baja patogenicidad y potencial de traducibilidad. Este protocolo describe dos sistemas AAV para investigar la expresión ectópica de factores de transcripción en células transducidas después de un accidente cerebrovascular isquémico. En ambos sistemas, la expresión de Neurod1 está controlada por el promotor corto GFAP (gfaABC(1)D), que se regula al alza en los astrocitos reactivos después del accidente cerebrovascular, así como en las neuronas endógenas cuando se combina con la expresión del factor neurogénico. En el modelo de accidente cerebrovascular isquémico descrito, la isquemia focal se induce mediante la inyección de endotelina-1 (ET-1) en la corteza motora de ratones, creando una lesión rodeada de astrocitos reactivos que expresan GFAP y neuronas supervivientes. Las inyecciones intracerebrales de AAV se realizan para inducir ectópicamente la expresión de Neurod1 en las fases subaguda (7 días) y crónica (21 días) después del accidente cerebrovascular. A las pocas semanas de la inyección de AAV, se identifica un número significativamente mayor de neuronas entre las células transducidas en los ratones que expresan ectópicamente Neurod1 en comparación con los ratones que reciben virus de control de AAV. Las estrategias basadas en AAV utilizadas replicaron los resultados observados de un mayor número de neuronas que expresan el gen reportero en un modelo de accidente cerebrovascular cortical de leve a moderado. Este protocolo establece una plataforma estándar para explorar los efectos de la expresión ectópica de factores de transcripción administrados con sistemas basados en AAV, lo que contribuye a la comprensión de la expresión de factores neurogénicos en el contexto del accidente cerebrovascular.

Introducción

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de discapacidad en todo el mundo¹. Un accidente cerebrovascular ocurre cuando se interrumpe el flujo sanguíneo al cerebro. Esto puede ocurrir a través de un accidente cerebrovascular hemorrágico (~15% de los casos), donde se rompe un vaso sanguíneo en el cerebro, o a través de un accidente cerebrovascular isquémico, donde el flujo sanguíneo al cerebro^{se bloquea}. Los accidentes cerebrovasculares isquémicos son los más prevalentes y representan ~ 85% de los casos de accidente cerebrovascular¹. Un accidente cerebrovascular reduce el suministro de glucosa y oxígeno al cerebro, lo que provoca una muerte rápida de las células neuronales y un deterioro de la función neuronal.

El accidente cerebrovascular isquémico conduce a la pérdida de células en cuestión de minutos en el núcleo de la lesión a través de mecanismos de excitotoxicidad, estrés oxidativo y nitrosativo, desregulación del calcio, despolarización cortical, diseminación, edema, ruptura de la barrera hematoencefálica (BHE) e inflamación ^2,3. Las células de las regiones periinfarto sufren la muerte celular apoptótica en cuestión de horas, y durante días, después del accidente cerebrovascular⁴. El ambiente periinfarto está expuesto a señales proinflamatorias y antiinflamatorias que conducen a la activación de la microglía y los astrocitos (astrocitos "reactivos"), que desempeñan diversas funciones después de una lesión 5,6,7,8. Los astrocitos reactivos experimentan una serie de cambios fenotípicos que incluyen la regulación positiva de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la formación de un borde alrededor de la lesión a los pocos días después del accidente cerebrovascular que ayuda a limitar la extensión de la lesión, así como afecta la neuroplasticidad dentro del tejido lesionado ^8,9,10.

La reprogramación celular directa permite la conversión de un tipo de célula madura en un tipo de célula madura diferente sin pasar por un estado pluripotente¹¹. Convertir las células cerebrales residentes en nuevas neuronas para sustituir a las perdidas por lesiones presenta una vía atractiva para la restauración del cerebro. El ictus es un objetivo ideal para los tratamientos basados en células, dada la necesidad de métodos terapéuticos para reemplazar las neuronas perdidas, ampliar el marco terapéutico y, en última instancia, facilitar la recuperación funcional. Con este fin, ha habido muchos trabajos que demuestran la reprogramación de astrocito a neurona (AtN) in vitro e in vivo, utilizando una variedad de factores de transcripción neurogénica básicos-hélice-bucle-hélice (bHLH), incluyendo Ascl1, Neurog2, Neurod1 y, más recientemente, versiones mutadas de Ascl1 (Ascl1-SA6) que demostraron una mejor eficacia de reprogramación 11,12,13,14. Es importante tener en cuenta los muchos factores de diseño experimental que pueden afectar los resultados, la interpretación y las comparaciones entre estudios. Ghazale et al. demostraron que la eficiencia de reprogramación de AtN varió entre diferentes cepas de ratón, serotipos de AAV y promotores cuando se utilizó el mismo factor de transcripción bHLH¹⁴. Otras consideraciones, como el modelo de lesión, la región del cerebro, la dosis viral, el momento de la administración de genes, el factor de reprogramación y el modo de administración, afectarán los resultados. Informes recientes han demostrado que las neuronas transducidas preexistentes han sido malinterpretadas como neuronas reprogramadas^15,16. Si bien los informes no niegan necesariamente que ocurra la conversión de AtN, estos estudios han resaltado la importancia de experimentos bien controlados, y varios artículos han propuesto recomendaciones para los próximos pasos en el campo 15,17,18,19. Lo que se desprende de la literatura es que la expresión ectópica de los factores de transcripción bHLH puede mejorar los resultados funcionales en una variedad de modelos animales de enfermedad/lesión neurodegenerativa 13,20,21,22,23,24.

En este trabajo, este protocolo Neurod1, un factor de transcripción de interés, se expresa ectópicamente en células transducidas^13,22. Se utiliza el modelo bien establecido de endotelina-1 (ET-1) de accidente cerebrovascular isquémico a la corteza sensoriomotora en ratones adultos. La inyección de ET-1 conduce a una vasoconstricción local que imita la fisiopatología del accidente cerebrovascular isquémico, incluyendo deterioro funcional 22,23,25. El promotor de GFAP corto comúnmente empleado (gfaABC(1)D) se utiliza para impulsar la expresión ectópica de Neurod1 en el sitio de la lesión y la región perilesional utilizando dos estrategias virales: (1) administración de AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre en ratones de tipo salvaje y (2) administración de AAV5-GFAP-Neurod1-Cre en ratones reporteros tdTom-Cre. Para comprender mejor el potencial de expresión ectópica de Neurod1 en el cerebro lesionado por accidente cerebrovascular, se administraron AAV en la fase subaguda (7 días) o en la fase crónica (21 días), después del accidente cerebrovascular. En ambos paradigmas, se encontraron significativamente más neuronas marcadas a las pocas semanas de la expresión ectópica de Neurod1.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Toronto y se adhiere a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (^2ª Edición, Consejo Canadiense de Cuidado Animal, 2017). Para este estudio, el tdTom-Cre reportero de tipo salvaje (C57BL/6J) y transgénico (B6. Se utilizaron cepas de ratón Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J)²² . Los ratones tenían entre 7 y 9 semanas de edad e incluían tanto machos como hembras. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cirugía de accidente cerebrovascular con endotelina-1

NOTA: Todos los instrumentos y materiales quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes de la cirugía. El marco estereotáxico se esteriliza con PREempt. Las jeringas se esterilizan con PREempt, alcohol al 70 % y se preparan con PBS estéril antes de la cirugía. La endotelina-1 (ET-1) se almacena en hielo durante toda la cirugía.

1. Antes de comenzar la cirugía, configure el área de recuperación colocando una jaula limpia sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 ° C. Alternativamente, si se está utilizando una lámpara de calefacción, coloque solo la mitad de la jaula bajo el calor.
   1. Para anestesiar ratones con isoflurano, siga el protocolo aprobado por el Comité de Cuidado Animal. Coloque el ratón en la cámara de inducción anestésica y encienda el oxígeno a 1-1,5 L/min, luego ajuste el vaporizador de isoflurano a 3%-5% para iniciar la anestesia.
2. Retire al animal de la cámara una vez que se acueste de lado y ya no pueda ponerse de pie, y colóquelo sobre una superficie limpia. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado confirmando la ausencia de un reflejo de pinzamiento del dedo del pie antes y durante la cirugía.
   1. Asegure el cono de la nariz extendido desde la máquina de anestesia en el animal y ajuste el isoflurano al 1%-2% para el mantenimiento. Minimice la exposición al isoflurano (5 min al 3%-5% para la inducción y el tiempo restante al 1%-2%), ya que el procedimiento puede tardar hasta 40 min en completarse.
3. Use recortadoras de pelo de animales para quitar el pelo desde el cuello/detrás de las orejas hasta la nariz del animal para exponer la piel del cráneo para la cirugía.
4. Pesar al animal y administrar la dosis adecuada de analgésico preoperatorio por vía subcutánea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) en función del peso.
5. Aplique un ungüento lubricante ocular en cada ojo del ratón para prevenir la desecación de la córnea durante la anestesia.
6. Esterilice el área de la piel recortada por el pelo (paso 1.3) con etanol al 70%, seguido de alcohol de clorhexidina dos veces para formar un campo quirúrgico.
7. Transfiera el mouse a un marco estereotáxico de ratón colocando primero su nariz en el cono de la nariz estereotáxica, luego estabilice el cráneo con barras en las orejas. Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 °C para obtener soporte térmico durante todo el procedimiento quirúrgico. Mantenga el isoflurano al 1%-2% para que el ratón muestre una frecuencia respiratoria de 1 respiración/s.
8. Repita la aplicación de lubricante ocular para prevenir la desecación de la córnea durante el procedimiento si es necesario. Aplique un paño quirúrgico estéril en el cuerpo del ratón, debajo de las orejas, para ampliar el tamaño del campo estéril.
9. Haga una incisión vertical paralela al plano sagital del animal desde detrás del punto medio de los ojos hasta la parte posterior de la cabeza (hueso parietal) con una hoja de bisturí # 10. Exponga el cráneo retrayendo suavemente la piel hacia los lados.
10. Use un hisopo para romper la fascia en el cráneo y permitir que el cráneo se seque para exponer el bregma.
11. Configure los brazos del manipulador con el soporte del taladro que lleva un taladro estereotáxico de alta velocidad con una broca de .018".
12. Taladre 3 orificios de rebaba (.018" de diámetro) con un taladro estereotáxico de alta velocidad en las coordenadas de la corteza sensoriomotora derecha a 2.25 mm lateral al bregma y +0.0 mm rostral, +1.0 mm rostral y -1.0 mm caudal al bregma.
13. Reemplace el taladro con una jeringa de 26 G con una aguja de 0.375" de largo.
14. Cargue 1,5 μL de 400 μM ET-1 disuelto en PBS estéril en la jeringa. Para asegurar un buen flujo, libere un pequeño volumen de ET-1 hasta que se pueda observar una gota en la punta de la aguja. Use un hisopo estéril para limpiar el exceso antes de realizar una inyección.
15. Baje la punta de la aguja más allá del cráneo en el orificio central de la fresa (en la corteza sensoriomotora derecha a + 0,0 anterior y 2,25 mm lateral al bregma) sin perforar la duramadre. Una vez alineado, baje la aguja 1 mm en el cerebro.
16. Inyecte 1 μL de ET-1 dispensando 0,1 μL a la vez. Empuje el émbolo de la jeringa Hamilton hacia adelante para dispensar 0,1 μL y espere un minuto antes de inyectar los siguientes 0,1 μL, inyecte hasta que se haya dispensado 1 μL.
    1. Después de que se hayan dispensado los últimos 0,1 μL (0,1 μL x 10 inyecciones = 1 μL en total), mantenga la aguja en su lugar durante 10 minutos para evitar el reflujo y luego retírela lentamente hacia arriba para retirar la jeringa.
17. Para asegurarse de que la aguja no se bloquee durante la inyección, suelte un pequeño volumen de ET-1 hasta que se pueda observar una gota en la punta de la aguja. Use un hisopo estéril para limpiar el exceso antes de realizar una inyección. Esterilice las jeringas antes de inyectar al siguiente animal con PREempt, seguido de alcohol al 70% y luego PBS estéril.
18. Para cerrar la herida, sutura la piel suprayacente del cráneo con una sutura estéril de poliéster polysorb 4-0.
19. Administre la pomada antibiótica con un hisopo de algodón en el área suturada para prevenir la infección postoperatoria.
20. Retire el ratón del marco estereotáxico y transfiéralo a una jaula de alojamiento de animales limpia y precalentada en el área de recuperación. Apague el vaporizador de isoflurano y el oxígeno.
21. Mantenga la jaula encima de una almohadilla térmica durante la recuperación de la anestesia. Alternativamente, si usa una lámpara de calefacción, coloque al ratón en el lado de la jaula debajo de la lámpara para que el ratón pueda moverse al lado frío de la jaula mientras se despierta de la anestesia para evitar el sobrecalentamiento. Monitoree el ratón a medida que sale de la anestesia en los próximos 5 a 10 minutos.
22. Monitorizar al ratón durante los próximos 3 días (control de peso), proporcionar cuidados postoperatorios (comida húmeda triturada para garantizar la hidratación) y analgésicos (2 mg/kg de meloxicam, 2 veces al día por vía subcutánea, durante 2-3 días) de acuerdo con las normas establecidas por el comité local de cuidado de animales.

2. Parto por virus adenoasociados (AAV) (7 días - modelo subagudo o 21 días - modelo crónico) después de un accidente cerebrovascular

PRECAUCIÓN: Consulte las pautas institucionales de bioseguridad para trabajar con AAV. De acuerdo con las pautas de la Universidad de Toronto, esta cirugía se realiza en un gabinete de bioseguridad de nivel 2 de contención.

NOTA: Todos los instrumentos y materiales quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes de la cirugía. El marco estereotáxico se esteriliza con PREempt. Las jeringas se esterilizan con PREempt, alcohol al 70% y se preparan con PBS estéril. Los AAV se almacenan en hielo durante toda la cirugía.

1. Antes de comenzar la cirugía, configure el área de recuperación colocando una jaula limpia sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 ° C. Alternativamente, si se está utilizando una lámpara de calefacción, coloque solo la mitad de la jaula bajo el calor.
   1. Para anestesiar ratones con isoflurano, coloque el ratón en la cámara de inducción anestésica y encienda el oxígeno a 1-1,5 L/min, luego ajuste el vaporizador de isoflurano a 3%-5% para iniciar la anestesia (siguiendo los protocolos aprobados por la institución).
2. Retire al animal de la cámara una vez que se acueste de lado y ya no pueda pararse sobre una superficie limpia. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado confirmando la ausencia de un reflejo de pinzamiento del dedo del pie antes y durante la cirugía.
   1. Asegure el cono de la nariz extendido desde la máquina de anestesia en el animal y ajuste el isoflurano al 1%-2% para el mantenimiento. Minimice la exposición al isoflurano (5 min al 3%-5% para la inducción y el tiempo restante al 1%-2%), ya que el procedimiento puede tardar hasta 40 min en completarse.
3. Pesar al animal y administrar la dosis adecuada de analgésico preoperatorio por vía subcutánea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) en función del peso.
4. Aplique ungüento lubricante para los ojos en cada ojo del ratón para evitar la desecación de la córnea al estar bajo anestesia.
5. Esterilice el área de la piel recortada con etanol al 70%, seguido de alcohol de clorhexidina dos veces para formar un campo quirúrgico.
6. Transfiera el mouse a un marco estereotáxico de ratón colocando primero su nariz en el cono de la nariz estereotáxica, luego estabilice el cráneo con barras en las orejas. Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 °C para obtener soporte térmico durante todo el procedimiento quirúrgico. Mantenga el isoflurano al 1%-2% para que el ratón muestre una frecuencia respiratoria de 1 respiración/s.
7. Repita la aplicación de lubricante ocular para prevenir la desecación de la córnea durante el procedimiento si es necesario. Aplique un paño quirúrgico estéril en el cuerpo del ratón, debajo de las orejas, para extender el tamaño del campo estéril.
8. Si aún está presente, corte las suturas con un par de tijeras quirúrgicas y retire la costra con un par de pinzas. Retrae la piel para exponer el cráneo.
   NOTA: Para el modelo crónico puede ser necesario extirpar la piel con la hoja de bisturí #10.
9. Use un hisopo estéril para secar el cráneo y localizar los agujeros de las rebabas.
10. Coloque los brazos manipuladores del aparato estereotáxico con un portaagujas que lleve una jeringa de 26 G con una aguja de 0,375" de largo.
11. Cargue 3,4 μL de AAV (1 x 10⁹ Genome Copies(GC)/μL para estudio agudo; 1 x 10¹⁰ GC/μL para estudio crónico) en la jeringa. Para asegurarse de que el flujo sea bueno, libere un pequeño volumen de AAV hasta que se pueda observar una gota en la punta de la aguja. Use un hisopo estéril para limpiar el exceso antes de realizar una inyección.
12. Baje la punta de la aguja más allá del cráneo en el primer orificio de rebaba utilizado para ET-1 (en la corteza sensoriomotora derecha a + 0,0 anterior y 2,25 mm lateral al bregma) sin perforar la duramadre. Una vez alineado, baje la aguja 1 mm en el cerebro. (0 AP, +2.25 ML, −1.0 DV de bregma).
13. Inyecte 1 μL de AAV (1 x 10⁹ GC/μL para el estudio agudo; 1 x 10¹⁰ GC/μL para el estudio crónico) dispensando 0,1 μL a la vez. Empuje el émbolo de la jeringa Hamilton hacia adelante para dispensar 0,1 μL y espere un minuto antes de inyectar los siguientes 0,1 μL; inyectar hasta que se haya dispensado 1 μL. Después de que se hayan dispensado los últimos 0,1 μL (0,1 μL x 10 inyecciones = 1 μL en total), mantenga la aguja en su lugar durante 10 minutos para evitar el reflujo y luego retírela lentamente hacia arriba para retirar la jeringa.
14. Para asegurarse de que la aguja no se bloquee durante la inyección, libere un pequeño volumen del AAV hasta que se pueda observar una gota en la punta de la aguja. Use un hisopo estéril para limpiar el exceso antes de realizar una inyección.
15. Repita los pasos 2.11-2.14 para las inyecciones de AAV en los dos orificios de fresa restantes (en la corteza sensoriomotora derecha a +1 AP, +2.25 ML, −1.0 DV; y −1 AP, +2.25 ML, −1.0 DV mm de bregma. Esterilice las jeringas antes de inyectar al siguiente animal con PREempt, seguido de alcohol al 70% y, finalmente, PBS estéril.
16. Para cerrar la herida, sutura la piel suprayacente del cráneo con una sutura estéril de poliéster polysorb 4-0.
17. Administre una pomada antibiótica con un hisopo de algodón en el área suturada para prevenir la infección postoperatoria.
18. Retire el ratón del marco estereotáxico y transfiéralo a una jaula de alojamiento de animales limpia y precalentada en el área de recuperación. Apague el vaporizador de isoflurano y el oxígeno.
19. Mantenga el ratón dentro de la jaula y esterilice el exterior de la jaula con PREempt y alcohol al 70% antes de colocarlo encima de una almohadilla térmica para recuperarse de la anestesia.
    1. Alternativamente, si usa una lámpara de calentamiento, coloque al ratón en el lado de la jaula debajo de la lámpara para que el ratón pueda moverse al lado frío de la jaula mientras se despierta de la anestesia para evitar el sobrecalentamiento. Monitoree el ratón a medida que sale de la anestesia en los próximos 5 a 10 minutos.
20. Monitorizar al ratón durante los próximos 3 días (control de peso), proporcionar cuidados postoperatorios (puré húmedo para asegurar la hidratación) y analgésicos (2 mg/kg de meloxicam, 2 veces al día por vía subcutánea, durante 2-3 días) de acuerdo con las normas establecidas por el comité local de cuidado de animales.

3. Preparación y disección de tejidos

1. Para sacrificar al ratón, inyecte intraperitonealmente al ratón con tribromoetanol (Avertin) (conc. 12,5 mg/mL, 250 mg/PC(kg)) y espere de 2 a 3 minutos para la inducción completa. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado retirando al ratón de la jaula y confirmando la ausencia de un reflejo de pellizco del dedo del pie.
2. En una campana extractora, realizar perfusión transcárdica²⁶ con solución salina seguida de paraformaldehído al 4%. Rocíe la cabeza del animal sacrificado con etanol al 70% hasta que se empape.
3. Corta la cabeza en la base del cráneo con un par de tijeras grandes. Corta la piel a lo largo de la línea media de todo el cráneo con unas tijeras rectas de iris de 4-1/2". Retrae la piel para exponer el cráneo.
4. Desde la abertura de la cavidad espinal en el cuello, inserte las tijeras de iris y corte a través del cráneo a lo largo de la sutura sagital e interfrontal.
5. A continuación, inserte unas tijeras en las dos cuencas de los ojos y corte la sutura frontal-nasal.
6. Tenga especial cuidado de no dañar el cerebro. Abra las placas del cráneo hacia la izquierda y hacia la derecha hasta que el cerebro quede expuesto.
7. Transfiera el cerebro a un frasco de centelleo con paraformaldehído al 4%. Mantener el cerebro en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 4 h.
8. A continuación, el cerebro se crioprotege sustituyendo un 4% de paraformaldehído por un 30% de sacarosa. Mantener el cerebro en sacarosa al 30% a 4 °C hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del vial (~12 h).

4. Seccionar cerebros congelados

1. Ajuste la temperatura de la cámara de criostato entre -20 °C y -26 °C.
2. Haga un corte coronal a través del cerebelo y fije la parte plana y caudal del cerebro a un mandril de criostato con compuesto de temperatura de corte óptima (OCT).
3. Coloque el mandril con el cerebro en el soporte del disco y alinee el bulbo olfativo con la hoja del cuchillo.
4. Cortar el cerebro en rodajas coronales de 20 μm de grosor. Para evitar rayas o líneas de arañazos en las rebanadas de cerebro seccionadas, coloque un trozo de cinta adhesiva en la plataforma de sección para crear un pequeño espacio entre la placa antivuelco y la plataforma. Se puede usar un pincel para ajustar la orientación de la sección antes de capturarla en un portaobjetos de vidrio cargado positivamente.
5. Guarde los portaobjetos que contengan secciones de cerebro a -20 °C.

5. Inmunohistoquímica y cuantificación

1. Procesar las secciones para inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo primario contra NeuN, un marcador panneuronal, de acuerdo con los protocolos estándar^22,26.
2. Descongele las secciones de cerebro criopreservadas durante 5 minutos a temperatura ambiente. Lave las secciones tres veces con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos cada una.
3. Incubar las secciones en Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 20 min a temperatura ambiente para que se permearan.
4. Preparar la solución de bloqueo (5% de suero de cabra normal y 0,3% de Triton X-100 en PBS) e incubar las secciones en la solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Diluir el anticuerpo primario, anti-NeuN de conejo, en una proporción de 1:500 en la solución de bloqueo. Incubar las secciones con la solución de anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
6. Lave las secciones tres veces con Triton X-100 al 0,3% en PBS, durante 5 minutos cada lavado.
7. Diluir el anticuerpo secundario, cabra anti-conejo 568 o 488, en una proporción de 1:1000 en PBS. Incubar las secciones con la solución de anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente, protegidos de la luz.
8. Realizar tres lavados con Triton X-100 al 0,3% en PBS, durante 5 min cada uno. Incubar las secciones con DAPI (1:10.000 en PBS) durante 5 min a temperatura ambiente.
9. Lave las secciones tres veces más con PBS, durante 5 minutos cada una. Monte las secciones manchadas en un portaobjetos de vidrio con un medio de montaje de fluorescencia y un cubreobjetos de vidrio. Deje que los portaobjetos montados se sequen durante la noche.
10. Imágenes de portaobjetos teñidos utilizando un objetivo de 20x con un microscopio confocal para obtener vistas de las células Reporter+ alrededor de la lesión del ictus en 3 secciones coronales diferentes (entre las regiones anatómicas del cruce del cuerpo calloso anterior y el cruce de la comisura anterior posterior) para cada animal.
    NOTA: La distancia de la propagación del AAV variará dentro del hemisferio. Sin embargo, según nuestra experiencia y el análisis posterior al procesamiento de tejidos de las células Reporter+, la propagación de AAV generalmente abarca aproximadamente +3 mm a -3 mm desde bregma. Se deben cuantificar las células Reporter+ alrededor de la lesión del accidente cerebrovascular (identificadas por la ausencia/tinción escasa de NeuN) en el área entre donde el cuerpo calloso cruza la línea media y las conexiones de la comisura anterior.
11. Para la cuantificación de las neuronas transducidas, realice un análisis de colocalización. Cuente manualmente el número de células dobles positivas (Reporter+NeuN+) y el número total de células transducidas (Reporter+) en cortes de cerebro. Para los resultados en este trabajo, se contaron >3 campos de visión alrededor de la lesión (medial, lateral e inferior) de 3 secciones coronales por ratón.

Resultados

Examinar los resultados celulares de la expresión ectópica de Neurod1 impulsada por el promotor corto de GFAP (gfaABC(1)D) en cepas reporteras de tdTom-Cre de tipo salvaje (C57BL/6J) y transgénicas (específicamente, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J)²² se utilizaron dos sistemas basados en AAV5 en ratones lesionados por ET-1 (Figura 1A-C). En un modelo subagudo de acc...

Discusión

Este protocolo detalla dos sistemas de AAV y modelos de ratón para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en el contexto de un modelo de accidente cerebrovascular cortical ET-1 leve-moderado. Es importante tener en cuenta una serie de pasos críticos relacionados con el accidente cerebrovascular ET-1 para la reproducibilidad y la consistencia de la lesión. Los orificios de las rebabas deben perforarse con cuidado sin perforar la duramadre para evitar lesiones quirúrgic...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#77 Drill Bit (.018”)	David Kopf Instruments	8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCre	Vector Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb™ Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Needle Size 4 - 0 Braided	Covidien	GL-881
Anti-NeuN Antibody (rabbit)	Millipore Sigma	ABN78
C57BL/6 Mice	Charles River	027
Chlorhexidine Solution	Partnar	PCH-020
Contec™ PREempt™ RTU Disinfectant Solution	Fisher Scientific	29-636-6212
Cryostat	Thermo Scientific	HM525 NX
Endothelin 1	Millipore Sigma	05-23-3800-0.5MG
Feather Safety Razor Microtome Blades	Feather	12-631P
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-545M
Fluorescence Mounting Medium	Agilent Technologies	S3023
Hamilton Syringe	Hamilton Company	7634-01
High Speed Stereotaxic Drill	David Kopf Instruments	1474
Metacam Solution (Meloxicam)	Boehringer Ingelheim
O.C.T Compound	Fisher Scientific	23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCre	Vector Builder	P190924-1001suq
Polyderm Ointment USP	TARO	2181908
SOMNI Scientific™ The Animal Temperature Heating Pad	Fisher Scientific	04-777-177
Stereotaxic Instruments	David Kopf Instruments	Model 902
Superfrost Plus Microscope Slides, white	Fisherbrand	12-550-15
tdTomato Reporter Mice	The Jackson Laboratory	007914
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806