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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'espressione ectopica mediata da virus di Neurod1 in seguito a ictus ischemico corticale. Neurod1 viene somministrato (1) utilizzando il sistema Cre-Flex AAV in topi wild-type durante la fase subacuta post-ictus (7 giorni) e (2) utilizzando un singolo vettore AAV in topi reporter condizionali durante la fase cronica post-ictus (21 giorni).

Abstract

L'espressione ectopica di fattori neurogeni in vivo è emersa come un approccio promettente per sostituire i neuroni persi nei modelli di malattia. L'uso di fattori di trascrizione neurali basici elica-loop-elica (bHLH) tramite sistemi di particelle simili a virus non propaganti, tra cui retrovirus, lentivirus e virus adeno-associati (AAV), è stato ampiamente riportato. Per gli esperimenti in vivo , gli AAV sono sempre più utilizzati a causa della loro bassa patogenicità e del potenziale di traducibilità. Questo protocollo descrive due sistemi AAV per studiare l'espressione ectopica di fattori di trascrizione in cellule trasdotte dopo ictus ischemico. In entrambi i sistemi, l'espressione di Neurod1 è controllata dal promotore corto GFAP (gfaABC(1)D), che è sovraregolato negli astrociti reattivi dopo l'ictus e nei neuroni endogeni quando combinato con l'espressione del fattore neurogeno. Nel modello di ictus ischemico descritto, l'ischemia focale è indotta iniettando endotelina-1 (ET-1) nella corteccia motoria dei topi, creando una lesione circondata da astrociti reattivi che esprimono GFAP e neuroni sopravvissuti. Iniezioni intracerebrali di AAV vengono eseguite per indurre ectopicamente l'espressione di Neurod1 nelle fasi subacuta (7 giorni) e cronica (21 giorni) post-ictus. Entro poche settimane dall'iniezione di AAV, un numero significativamente più elevato di neuroni tra le cellule trasdotte viene identificato nei topi che esprimono ectopicamente Neurod1 rispetto ai topi che ricevono virus di controllo AAV. Le strategie basate sull'AAV hanno utilizzato i risultati osservati replicati di un aumento del numero di neuroni che esprimono il gene reporter in un modello di ictus corticale da lieve a moderato. Questo protocollo stabilisce una piattaforma standard per esplorare gli effetti dell'espressione ectopica dei fattori di trascrizione forniti con sistemi basati su AAV, contribuendo alla comprensione dell'espressione del fattore neurogeno nel contesto dell'ictus.

Introduzione

L'ictus è una delle principali cause di disabilità in tutto il mondo1. Un ictus si verifica quando il flusso sanguigno al cervello viene interrotto. Ciò può verificarsi sia attraverso un ictus emorragico (~15% dei casi), in cui un vaso sanguigno nel cervello scoppia, sia attraverso un ictus ischemico, in cui il flusso sanguigno al cervello è bloccato1. Gli ictus ischemici sono i più diffusi e rappresentano ~85% dei casi di ictus1. Un ictus riduce l'apporto di glucosio e ossigeno al cervello, portando a una rapida morte delle cellule neuronali e a una compromissione della funzione neurale.

L'ictus ischemico porta alla perdita di cellule in pochi minuti nel nucleo della lesione attraverso meccanismi di eccitotossicità, stress ossidativo e nitrosativo, disregolazione del calcio, diffusione corticale, depolarizzazione, edema, rottura della barriera emato-encefalica (BEE) e infiammazione 2,3. Le cellule nelle regioni peri-infartuali vanno incontro a morte cellulare apoptotica entro poche ore e per giorni dopo l'ictus4. L'ambiente peri-infartuale è esposto a segnali pro- e anti-infiammatori che portano all'attivazione di microglia e astrociti (astrociti "reattivi"), che svolgono ruoli diversi dopo la lesione 5,6,7,8. Gli astrociti reattivi subiscono una serie di cambiamenti fenotipici che includono la sovraregolazione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e la formazione di un bordo attorno alla lesione entro pochi giorni dall'ictus che aiuta a limitare l'estensione della lesione e influisce sulla neuroplasticità all'interno del tessuto danneggiato 8,9,10.

La riprogrammazione cellulare diretta consente la conversione di un tipo di cellula matura in un diverso tipo di cellula matura senza passare attraverso uno stato pluripotente11. Trasformare le cellule cerebrali residenti in nuovi neuroni per sostituire quelli persi a causa di lesioni rappresenta una strada interessante per il ripristino del cervello. L'ictus è un bersaglio ideale per i trattamenti basati sulle cellule, data la necessità di metodi terapeutici per sostituire i neuroni persi, ampliare il periodo terapeutico e, in ultima analisi, facilitare il recupero funzionale. A tal fine, ci sono stati molti articoli che dimostrano la riprogrammazione da astrociti a neurone (AtN) in vitro e in vivo, utilizzando una varietà di fattori di trascrizione neurogenica basic-helix-loop-helix (bHLH), tra cui Ascl1, Neurog2, Neurod1 e, più recentemente, versioni mutate di Ascl1 (Ascl1-SA6) che hanno dimostrato una migliore efficacia di riprogrammazione 11,12,13,14. È importante considerare i numerosi fattori di progettazione sperimentale che possono influenzare i risultati, l'interpretazione e il confronto tra gli studi. Ghazale et al. hanno dimostrato che l'efficienza di riprogrammazione dell'AtN variava tra diversi ceppi di topo, sierotipi di AAV e promotori quando si utilizzava lo stesso fattore di trascrizionebHLH 14. Altre considerazioni, come il modello di lesione, la regione cerebrale, il dosaggio virale, i tempi di consegna del gene, il fattore di riprogrammazione e la modalità di consegna, influenzeranno i risultati. Recenti studi hanno dimostrato che i neuroni trasdotti preesistenti sono stati erroneamente interpretati come neuroni riprogrammati15,16. Sebbene i rapporti non neghino necessariamente che si verifichi la conversione di AtN, questi studi hanno evidenziato l'importanza di esperimenti ben controllati e diversi articoli hanno formulato raccomandazioni per i prossimi passi nel campo 15,17,18,19. Ciò che risulta evidente dalla letteratura è che l'espressione ectopica dei fattori di trascrizione bHLH può migliorare gli esiti funzionali in una varietà di modelli animali di malattia/lesione neurodegenerativa 13,20,21,22,23,24.

In questo caso, questo protocollo Neurod1, un fattore di trascrizione di interesse, è espresso ectopicamente nelle cellule trasdotte13,22. Viene utilizzato il modello ben consolidato di endotelina-1 (ET-1) dell'ictus ischemico alla corteccia sensomotoria nei topi adulti. L'iniezione di ET-1 porta a vasocostrizione locale che imita la fisiopatologia dell'ictus ischemico, inclusa la compromissione funzionale 22,23,25. Il promotore corto di GFAP comunemente impiegato (gfaABC(1)D) viene utilizzato per guidare l'espressione ectopica di Neurod1 nel sito della lesione e nella regione perilesionale utilizzando due strategie virali: (1) somministrazione di AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre in topi wild-type e (2) somministrazione di AAV5-GFAP-Neurod1-Cre in topi reporter tdTom-Cre. Per comprendere ulteriormente il potenziale di espressione ectopica di Neurod1 nel cervello danneggiato da ictus, gli AAV sono stati somministrati nella fase subacuta (7 giorni) o nella fase cronica (21 giorni), dopo l'ictus. In entrambi i paradigmi, sono stati trovati un numero significativamente maggiore di neuroni marcati entro poche settimane dall'espressione ectopica di Neurod1.

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Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dall'Animal Care Committee dell'Università di Toronto e aderisce alla Guida alla cura e all'uso degli animali da esperimento (2a edizione, Canadian Council on Animal Care, 2017). Per questo studio, il reporter tdTom-Cre wild-type (C57BL/6J) e transgenico (B6. Sono stati utilizzati ceppi di topo Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 . I topi avevano 7-9 settimane e includevano sia maschi che femmine. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Chirurgia dell'ictus con endotelina-1

NOTA: Tutti gli strumenti e i materiali chirurgici vengono sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Il telaio stereotassico viene sterilizzato con PREempt. Le siringhe vengono sterilizzate con PREempt, alcol al 70% e innescate con PBS sterile prima dell'intervento chirurgico. L'endotelina-1 (ET-1) viene immagazzinata nel ghiaccio durante l'intervento chirurgico.

  1. Prima di iniziare l'intervento, allestire l'area di recupero posizionando una gabbia pulita su un termoforo impostato a 37 °C. In alternativa, se si utilizza una lampada riscaldante, posizionare solo metà della gabbia sotto il fuoco.
    1. Per anestetizzare i topi usando l'isoflurano, seguire il protocollo approvato dal Comitato per la cura degli animali. Posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestetico e accendere l'ossigeno a 1-1,5 L/min, quindi regolare il vaporizzatore di isoflurano al 3%-5% per avviare l'anestesia.
  2. Rimuovi l'animale dalla camera una volta che si sdraia su un fianco e non può più stare in piedi, e posizionalo su una superficie pulita. Assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato confermando l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi prima e durante l'intervento.
    1. Fissare il cono nasale esteso dalla macchina anestetica sull'animale e regolare l'isoflurano all'1%-2% per il mantenimento. Ridurre al minimo l'esposizione all'isoflurano (5 minuti al 3%-5% per l'induzione e il tempo rimanente all'1%-2%), poiché la procedura può richiedere fino a 40 minuti per essere completata.
  3. Utilizzare tagliapeli di animali per rimuovere il pelo dal collo/dietro le orecchie al naso dell'animale per esporre la pelle del cranio per l'intervento chirurgico.
  4. Pesare l'animale e somministrare la dose appropriata di analgesico preoperatorio per via sottocutanea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) in base al peso.
  5. Applicare un unguento lubrificante per gli occhi su ciascun occhio del topo per prevenire l'essiccazione della cornea durante l'anestesia.
  6. Sterilizzare l'area della pelle tagliata dal pelo (passaggio 1.3) con etanolo al 70%, seguito da alcol clorexidina due volte per formare un campo chirurgico.
  7. Trasferisci il mouse su una cornice stereotassica del topo posizionando prima il naso nel cono stereotassico, quindi stabilizza il cranio con le barre auricolari. Tenere il mouse su un termoforo impostato a 37 °C per un supporto termico durante tutta la procedura chirurgica. Mantenere l'isoflurano all'1%-2% in modo che il topo mostri una frequenza respiratoria di 1 respiro/s.
  8. Se necessario, ripetere l'applicazione della lubrificazione oculare per prevenire l'essiccazione della cornea durante la procedura. Applicare un telo chirurgico sterile sul corpo del topo, sotto le orecchie, per estendere le dimensioni del campo sterile.
  9. Praticare un'incisione verticale parallela al piano sagittale dell'animale da dietro il punto medio degli occhi fino alla parte posteriore della testa (osso parietale) con una lama di bisturi #10. Esporre il cranio ritraendo delicatamente la pelle verso i lati.
  10. Usa un cotton fioc per interrompere la fascia sul cranio e lasciare che il cranio si asciughi per esporre il bregma.
  11. Installare i bracci del manipolatore con il supporto del trapano che trasporta un trapano stereotassico ad alta velocità con una punta da trapano da .018".
  12. Praticare 3 fori di fresatura (diametro .018") con un trapano stereotassico ad alta velocità alle coordinate nella corteccia sensomotoria destra a 2,25 mm lateralmente alla bregma e +0,0 mm rostrale, +1,0 mm rostrale e -1,0 mm caudale alla bregma.
  13. Sostituire il trapano con una siringa da 26 G con un ago lungo 0.375".
  14. Caricare nella siringa 1,5 μl di 400 μM di ET-1 disciolto in PBS sterile. Per garantire un buon flusso, rilasciare un piccolo volume di ET-1 fino a quando non si può osservare una goccia sulla punta dell'ago. Utilizzare un cotton fioc sterile per rimuovere l'eccesso prima di eseguire un'iniezione.
  15. Abbassare la punta dell'ago oltre il cranio nel foro centrale della bava (nella corteccia sensomotoria destra a + 0,0 mm anteriormente e 2,25 mm lateralmente alla bregma) senza forare la dura madre. Una volta allineato, abbassare l'ago di 1 mm nel cervello.
  16. Iniettare 1 μL di ET-1 erogando 0,1 μL alla volta. Spingere in avanti lo stantuffo della siringa Hamilton per erogare 0,1 μl e attendere un minuto prima di iniettare i successivi 0,1 μl, iniettare fino a quando non è stato erogato 1 μl.
    1. Dopo che gli ultimi 0,1 μl sono stati erogati (0,1 μl x 10 iniezioni = 1 μl totale), tenere l'ago in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso e quindi ritirarlo lentamente verso l'alto per rimuovere la siringa.
  17. Per assicurarsi che l'ago non si blocchi durante l'iniezione, rilasciare un piccolo volume di ET-1 fino a quando non si può osservare una goccia sulla punta dell'ago. Utilizzare un cotton fioc sterile per rimuovere l'eccesso prima di eseguire un'iniezione. Sterilizzare le siringhe prima di iniettare all'animale successivo PREempt, seguito da alcol al 70% e poi PBS sterile.
  18. Per chiudere la ferita, suturare insieme la pelle sovrastante del cranio utilizzando una sutura sterile in poliestere polisorbito 4-0.
  19. Somministrare un unguento antibiotico utilizzando un batuffolo di cotone sulla zona suturata per prevenire l'infezione post-operatoria.
  20. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico e trasferirlo in una gabbia per animali pulita e preriscaldata nell'area di recupero. Spegni il vaporizzatore di isoflurano e l'ossigeno.
  21. Tenere la gabbia sopra un termoforo per tutta la durata del recupero dall'anestesia. In alternativa, se si utilizza una lampada riscaldante, posizionare il mouse sul lato della gabbia sotto la lampada in modo che il mouse possa spostarsi sul lato freddo della gabbia quando si sveglia dall'anestesia per evitare il surriscaldamento. Monitora il mouse mentre esce dall'anestesia nei prossimi 5-10 minuti.
  22. Monitorare il mouse nei successivi 3 giorni (monitoraggio del peso), fornire assistenza post-operatoria (purè di cibo umido per garantire l'idratazione) e analgesici (2 mg/kg di meloxicam, 2 volte al giorno per via sottocutanea, per 2-3 giorni) in conformità con le normative stabilite dal comitato locale per la cura degli animali.

2. Somministrazione di virus adeno-associati (AAV) (7 giorni - modello subacuto o 21 giorni - modello cronico) dopo l'ictus

ATTENZIONE: Fare riferimento alle linee guida istituzionali sulla biosicurezza per lavorare con gli AAV. Secondo le linee guida dell'Università di Toronto, questo intervento chirurgico viene eseguito in una cabina di biosicurezza di livello 2 di contenimento.

NOTA: Tutti gli strumenti e i materiali chirurgici vengono sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Il telaio stereotassico viene sterilizzato con PREempt. Le siringhe sono sterilizzate con PREempt, alcol al 70% e innescate con PBS sterile. Gli AAV vengono conservati sul ghiaccio durante l'intervento chirurgico.

  1. Prima di iniziare l'intervento, allestire l'area di recupero posizionando una gabbia pulita su un termoforo impostato a 37 °C. In alternativa, se si utilizza una lampada riscaldante, posizionare solo metà della gabbia sotto il fuoco.
    1. Per anestetizzare i topi usando l'isoflurano, posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestetico e accendere l'ossigeno a 1-1,5 L/min, quindi regolare il vaporizzatore di isoflurano al 3%-5% per iniziare l'anestesia (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
  2. Rimuovi l'animale dalla camera una volta che si sdraia su un fianco e non può più stare su una superficie pulita. Assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato confermando l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi prima e durante l'intervento.
    1. Fissare il cono nasale esteso dalla macchina anestetica sull'animale e regolare l'isoflurano all'1%-2% per il mantenimento. Ridurre al minimo l'esposizione all'isoflurano (5 minuti al 3%-5% per l'induzione e il tempo rimanente all'1%-2%), poiché la procedura può richiedere fino a 40 minuti per essere completata.
  3. Pesare l'animale e somministrare la dose appropriata di analgesico preoperatorio per via sottocutanea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) in base al peso.
  4. Applicare un unguento lubrificante per gli occhi su ciascun occhio del topo per evitare che l'essiccazione corneale sia sotto anestesia.
  5. Sterilizzare l'area della pelle tagliata con etanolo al 70%, seguito da alcol clorexidina due volte per formare un campo chirurgico.
  6. Trasferisci il mouse su una cornice stereotassica del topo posizionando prima il naso nel cono stereotassico, quindi stabilizza il cranio con le barre auricolari. Tenere il mouse su un termoforo impostato a 37 °C per un supporto termico durante tutta la procedura chirurgica. Mantenere l'isoflurano all'1%-2% in modo che il topo visualizzi la frequenza respiratoria di 1 respiro/s.
  7. Se necessario, ripetere l'applicazione della lubrificazione oculare per prevenire l'essiccazione della cornea durante la procedura. Applicare un telo chirurgico sterile sul corpo del topo, sotto le orecchie, per estendere le dimensioni del campo sterile.
  8. Se ancora presente, tagliare i punti di sutura con un paio di forbici chirurgiche e rimuovere la crosta con un paio di pinze. Ritrarre la pelle per esporre il cranio.
    NOTA: Per il modello cronico potrebbe essere necessario asportare la pelle con lama di bisturi #10.
  9. Usa un cotton fioc sterile per asciugare il cranio e individuare i fori delle sbavature.
  10. Impostare i bracci manipolatori dell'apparato stereotassico con un portaaghi che trasporta una siringa da 26 G con un ago lungo 0,375".
  11. Caricare 3,4 μL di AAV (1 x 109 copie del genoma (GC)/μL per lo studio acuto; 1 x 1010 GC/μL per lo studio cronico) nella siringa. Per garantire che il flusso sia buono, rilasciare un piccolo volume di AAV fino a quando non si può osservare una goccia sulla punta dell'ago. Utilizzare un cotton fioc sterile per rimuovere l'eccesso prima di eseguire un'iniezione.
  12. Abbassare la punta dell'ago oltre il cranio nel primo foro di bava utilizzato per ET-1 (nella corteccia sensomotoria destra a + 0,0 anteriormente e 2,25 mm lateralmente alla bregma) senza forare la dura madre. Una volta allineato, abbassare l'ago di 1 mm nel cervello. (0 AP, +2,25 ML, -1,0 DV da bregma).
  13. Iniettare 1 μL di AAV (1 x 109 GC/μL per lo studio acuto; 1 x 1010 GC/μL per lo studio cronico) dispensando 0,1 μL alla volta. Spingere in avanti lo stantuffo della siringa Hamilton per erogare 0,1 μl e attendere un minuto prima di iniettare i successivi 0,1 μl; iniettare fino a quando non è stato erogato 1 μL. Dopo che gli ultimi 0,1 μl sono stati erogati (0,1 μl x 10 iniezioni = 1 μl totale), tenere l'ago in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso e quindi ritirarlo lentamente verso l'alto per rimuovere la siringa.
  14. Per assicurarsi che l'ago non si blocchi durante l'iniezione, rilasciare una piccola quantità di AAV fino a quando non si può osservare una goccia sulla punta dell'ago. Utilizzare un cotton fioc sterile per rimuovere l'eccesso prima di eseguire un'iniezione.
  15. Ripetere i passaggi 2.11-2.14 per le iniezioni di AAV nei due fori di bava rimanenti (nella corteccia sensomotoria destra a +1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV; e -1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV mm da bregma. Sterilizzare le siringhe prima di iniettare l'animale successivo con PREempt, seguito da alcol al 70% e infine PBS sterile.
  16. Per chiudere la ferita, suturare insieme la pelle sovrastante del cranio utilizzando una sutura sterile in poliestere polisorbito 4-0.
  17. Somministrare un unguento antibiotico utilizzando un batuffolo di cotone sull'area suturata per prevenire l'infezione post-operatoria.
  18. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico e trasferirlo in una gabbia per animali pulita e preriscaldata nell'area di recupero. Spegni il vaporizzatore di isoflurano e l'ossigeno.
  19. Tieni il mouse all'interno della gabbia e sterilizza l'esterno della gabbia con PREempt e alcol al 70% prima di posizionarlo sopra un termoforo per il recupero dall'anestesia.
    1. In alternativa, se si utilizza una lampada riscaldante, posizionare il mouse sul lato della gabbia sotto la lampada in modo che il mouse possa spostarsi sul lato freddo della gabbia quando si sveglia dall'anestesia per evitare il surriscaldamento. Monitora il mouse mentre esce dall'anestesia nei prossimi 5-10 minuti.
  20. Monitorare il mouse nei successivi 3 giorni (monitoraggio del peso), fornire assistenza post-operatoria (purè di cibo umido per garantire l'idratazione) e analgesici (2 mg/kg di meloxicam, 2 volte al giorno per via sottocutanea, per 2-3 giorni) in conformità con le normative stabilite dal comitato locale per la cura degli animali.

3. Preparazione e dissezione dei tessuti

  1. Per l'eutanasia del topo, iniettare intraperitonealmente il topo con tribromoetanolo (Avertin) (conc. 12,5 mg/mL, 250 mg/BW (kg)) e attendere 2-3 minuti per l'induzione completa. Assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato rimuovendo il topo dalla gabbia e confermando l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita.
  2. In una cappa aspirante, eseguire la perfusione transcardica26 con soluzione fisiologica seguita da paraformaldeide al 4%. Spruzzare la testa dell'animale soppresso con etanolo al 70% fino a quando non è in ammollo.
  3. Taglia la testa alla base del cranio usando un paio di forbici grandi. Taglia la pelle lungo la linea mediana dell'intero cranio usando le forbici dell'iride dritte da 4-1/2". Ritrarre la pelle per esporre il cranio.
  4. Dall'apertura della cavità spinale al collo, inserire le forbici dell'iride e tagliare il cranio lungo la sutura sagittale e interfrontale.
  5. Quindi inserire le forbici nelle due orbite oculari e tagliare la sutura frontale-nasale.
  6. Prestare particolare attenzione a non danneggiare il cervello. Aprire le placche craniche a sinistra e a destra fino a quando il cervello non è esposto.
  7. Trasferire il cervello in una fiala di scintillazione con paraformaldeide al 4%. Mantenere il cervello in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 4 ore.
  8. Il cervello viene quindi crioprotetto sostituendo il 4% di paraformaldeide con il 30% di saccarosio. Mantenere il cervello in saccarosio al 30% a 4 °C fino a quando il cervello non affonda sul fondo della fiala (~12 h).

4. Sezionamento di cervelli congelati

  1. Impostare la temperatura della camera del criostato tra -20 °C e -26 °C.
  2. Praticare un taglio coronale attraverso il cervelletto e attaccare la parte piatta e caudale del cervello su un mandrino criostato con composto a temperatura di taglio ottimale (OCT).
  3. Posizionare il mandrino con il cervello nel portadisco e allineare il bulbo olfattivo con la lama del coltello.
  4. Sezionare il cervello in fette coronali con uno spessore di 20 μm. Per evitare striature o linee di graffio sulle fette di cervello sezionate, posizionare un pezzo di nastro adesivo sulla piattaforma di sezionamento per creare un piccolo spazio tra la piastra anti-rotolamento e la piattaforma. È possibile utilizzare un pennello per regolare l'orientamento della sezione prima di catturarla su un vetrino caricato positivamente.
  5. Conservare i vetrini contenenti sezioni cerebrali a -20 °C.

5. Immunoistochimica e quantificazione

  1. Processare le sezioni per l'immunoistochimica utilizzando un anticorpo primario contro NeuN, un marcatore pan-neuronale, secondo i protocolli standard22,26.
  2. Scongelare le sezioni cerebrali crioconservate per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare le sezioni tre volte con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 minuti ciascuna.
  3. Incubare le sezioni in Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzarle.
  4. Preparare la soluzione bloccante (5% di siero normale di capra e 0,3% di Triton X-100 in PBS) e incubare le sezioni nella soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente.
  5. Diluire l'anticorpo primario, l'anti-NeuN di coniglio, in rapporto 1:500 nella soluzione bloccante. Incubare le sezioni con la soluzione di anticorpi primari per una notte a 4 °C.
  6. Lavare le sezioni tre volte con Triton X-100 allo 0,3% in PBS, per 5 minuti ogni lavaggio.
  7. Diluire l'anticorpo secondario, capra anti-coniglio 568 o 488, in un rapporto 1:1000 in PBS. Incubare le sezioni con la soluzione di anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
  8. Eseguire tre lavaggi con Triton X-100 allo 0,3% in PBS, per 5 minuti ciascuno. Incubare le sezioni con DAPI (1:10.000 in PBS) per 5 minuti a temperatura ambiente.
  9. Lavare le sezioni altre tre volte con PBS, per 5 minuti ciascuna. Montare le sezioni colorate su un vetrino con un mezzo di montaggio a fluorescenza e un vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare i vetrini montati durante la notte.
  10. Immagini di vetrini colorati utilizzando un obiettivo 20x con un microscopio confocale per ottenere viste delle cellule Reporter+ attorno alla lesione dell'ictus in 3 diverse sezioni coronali (tra le regioni anatomiche dell'incrocio del corpo calloso anteriormente e l'incrocio della commessura anteriore posteriormente) per ciascun animale.
    NOTA: La distanza della diffusione AAV varierà all'interno dell'emisfero. Tuttavia, in base alla nostra esperienza e all'analisi post-processazione tissutale delle cellule Reporter+, la diffusione dell'AAV generalmente si estende da circa +3 mm a -3 mm dal bregma. Devono essere quantificate le cellule reporter+ intorno alla lesione dell'ictus (identificate dall'assenza/colorazione sparsa di NeuN) nell'area tra il punto in cui il corpo calloso attraversa la linea mediana e la commessura anteriore si collega.
  11. Per la quantificazione dei neuroni trasdotti, eseguire l'analisi di colocalizzazione. Conta manualmente il numero di cellule doppie positive (Reporter+NeuN+) e il numero totale di cellule trasdotte (Reporter+) nelle fette di cervello. Per i risultati qui presentati, sono stati contati >3 campi visivi che circondano la lesione (mediale, laterale e inferiore) da 3 sezioni coronali per topo.

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Risultati

Esaminare gli esiti cellulari dell'espressione ectopica di Neurod1 guidata dal promotore di breve GFAP (gfaABC(1)D) in ceppi reporter tdTom-Cre wild-type (C57BL/6J) e transgenici (in particolare, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 due sistemi basati su AAV5 sono stati utilizzati in topi con ictus ET-1 (Figura 1A-C). In un modello subacuto di ictus, Neurod1 è s...

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Discussione

Questo protocollo descrive in dettaglio due sistemi AAV e modelli murini per studiare l'espressione ectopica di Neurod1 nel contesto di un modello di ictus corticale ET-1 lieve-moderato. Una serie di passaggi critici relativi all'ictus ET-1 sono importanti da considerare per la riproducibilità e la consistenza della lesione. I fori di fresatura devono essere praticati con cura senza forare la dura madre per evitare lesioni chirurgiche involontarie. È importante utilizzare punt...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Heart and Stroke Foundation, dall'Ontario Institute of Regenerative Medicine, dal Canada First Research Excellence Fund (Medicine by Design, MbD) e dal Connaught Innovation Award (Università di Toronto).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
#77 Drill Bit (.018”)David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb™ Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Needle Size 4 - 0 BraidedCovidienGL-881
Anti-NeuN Antibody (rabbit) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 MiceCharles River027
Chlorhexidine SolutionPartnarPCH-020
Contec™ PREempt™ RTU Disinfectant SolutionFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Feather Safety Razor Microtome BladesFeather12-631P
Fisherbrand Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-545M 
Fluorescence Mounting MediumAgilent TechnologiesS3023 
Hamilton SyringeHamilton Company7634-01
High Speed Stereotaxic DrillDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Polyderm Ointment USPTARO2181908
SOMNI Scientific™ The Animal Temperature Heating PadFisher Scientific04-777-177
Stereotaxic InstrumentsDavid Kopf InstrumentsModel 902
Superfrost Plus Microscope Slides, whiteFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice The Jackson Laboratory007914
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901806

Riferimenti

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