JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הביטוי החוץ רחמי בתיווך ויראלי של Neurod1 לאחר שבץ איסכמי קליפת המוח. Neurod1 מועבר (1) באמצעות מערכת Cre-Flex AAV בעכברים מסוג בר במהלך השלב התת-חריף לאחר שבץ מוחי (7 ימים) ו-(2) באמצעות וקטור AAV יחיד בעכברים מדווחים מותנים במהלך השלב הכרוני שלאחר השבץ (21 ימים).

Abstract

ביטוי חוץ רחמי של גורמים נוירוגניים in vivo התגלה כגישה מבטיחה להחלפת נוירונים אבודים במודלים של מחלות. השימוש בגורמי שעתוק סליל-לולאה סליל בסיסיים עצביים (bHLH) באמצעות מערכות חלקיקים דמויות וירוס שאינן מתפשטות, כולל רטרו-וירוס, לנטי-וירוס ווירוס הקשור לאדנו (AAV), דווח בהרחבה. עבור ניסויים in vivo , נעשה שימוש הולך וגובר ב-AAVs בשל הפתוגניות הנמוכה שלהם ופוטנציאל התרגום. פרוטוקול זה מתאר שתי מערכות AAV לחקירת הביטוי החוץ רחמי של גורמי שעתוק בתאים שעברו התמרה לאחר שבץ איסכמי. בשתי המערכות, ביטוי Neurod1 נשלט על ידי מקדם ה-GFAP הקצר (gfaABC(1)D), אשר מווסת באסטרוציטים תגובתיים לאחר שבץ מוחי כמו גם בנוירונים אנדוגניים בשילוב עם ביטוי גורמים נוירוגניים. במודל השבץ האיסכמי המתואר, איסכמיה מוקדית נגרמת על ידי הזרקת אנדותלין-1 (ET-1) לקליפת המוח המוטורית של עכברים, ויוצרת נגע מוקף באסטרוציטים המבטאים GFAP תגובתיים ונוירונים ששרדו. זריקות תוך מוחיות של AAV מבוצעות כדי לגרום לביטוי אקטופי של Neurod1 בשלבים התת-חריפים (7 ימים) והכרוניים (21 ימים) לאחר שבץ מוחי. תוך שבועות לאחר הזרקת AAV, מספר גבוה משמעותית של נוירונים בקרב תאים מתמרים מזוהה בעכברים המבטאים Neurod1 באופן אקטופי בהשוואה לעכברים המקבלים נגיפי בקרת AAV. האסטרטגיות המבוססות על AAV השתמשו בתוצאות נצפות משוכפלות של מספר מוגבר של נוירונים המבטאים את הגן המדווח במודל של שבץ קליפת המוח קל עד בינוני. פרוטוקול זה קובע פלטפורמה סטנדרטית לבחינת ההשפעות של ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק המועברים במערכות מבוססות AAV, התורם להבנת ביטוי הגורמים הנוירוגניים בהקשר של שבץ מוחי.

Introduction

שבץ מוחי הוא גורם מוביל לנכות ברחבי העולם1. שבץ מוחי מתרחש כאשר זרימת הדם למוח מופרעת. זה יכול להתרחש באמצעות שבץ דימומי (~15% מהמקרים), שבו כלי דם במוח מתפוצץ, או באמצעות שבץ איסכמי, שבו זרימת הדם למוח נחסמת1. שבץ איסכמי הוא השכיח ביותר ומהווים ~85% ממקרי השבץ1. שבץ מוחי מפחית את אספקת הגלוקוז והחמצן למוח, מה שמוביל למוות מהיר של תאי עצב ולפגיעה בתפקוד העצבי.

שבץ איסכמי מוביל לאובדן תאים תוך דקות בליבת הנגע באמצעות מנגנונים של אקסיטוטוקסיות, מתח חמצוני וניטרוזטיבי, חוסר ויסות סידן, דפולריזציה מתפשטת בקליפת המוח, בצקת, שיבוש מחסום הדם-מוח (BBB) ודלקת 2,3. תאים באזורי האוטם עוברים מוות של תאים אפופטוטיים תוך שעות, ובמשך ימים, לאחר שבץמוחי 4. הסביבה הפרי-אוטמית חשופה לאותות פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתיים המובילים להפעלת מיקרוגליה ואסטרוציטים (אסטרוציטים "תגובתיים"), הממלאים תפקידים מגוונים לאחר פציעה 5,6,7,8. אסטרוציטים תגובתיים עוברים מספר שינויים פנוטיפיים הכוללים ויסות מוגבר של חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP), והיווצרות גבול סביב הנגע תוך ימים לאחר השבץ המוחי המסייע להגביל את היקף הנגע וכן משפיע על הנוירופלסטיות בתוך הרקמה הפגועה 8,9,10.

תכנות מחדש תאי ישיר מאפשר המרה של סוג תא בוגר אחד לסוג תא בוגר אחר מבלי לעבור מצב פלוריפוטנטי11. הפיכת תאי מוח תושבים לנוירונים חדשים כדי להחליף את אלה שאבדו בפציעה מהווה דרך אטרקטיבית לשיקום המוח. שבץ מוחי הוא יעד אידיאלי לטיפולים מבוססי תאים, בהתחשב בצורך בשיטות טיפוליות להחלפת נוירונים שאבדו, להרחיב את מסגרת הזמן הטיפולית ובסופו של דבר להקל על התאוששות תפקודית. לשם כך, היו מאמרים רבים המדגימים תכנות מחדש של אסטרוציטים לנוירון (AtN) במבחנה וב-vivo, תוך שימוש במגוון גורמי שעתוק נוירוגניים בסיסיים, כולל Ascl1, Neurog2, Neurod1 ולאחרונה, גרסאות מוטנטיות של Ascl1 (Ascl1-SA6) שהראו יעילות תכנות מחדש משופרת 11,12,13,14. חשוב לקחת בחשבון את גורמי תכנון הניסוי הרבים שיכולים להשפיע על תוצאות, פרשנות והשוואות בין מחקרים. Ghazale et al. הראו שיעילות התכנות מחדש של AtN השתנתה בין זני עכברים שונים, סרוטיפים של AAV ומקדמים כאשר השתמשו באותו גורם שעתוק bHLH14. שיקולים אחרים, כגון מודל הפגיעה, אזור המוח, מינון ויראלי, תזמון העברת הגנים, גורם התכנות מחדש ואופן המסירה, ישפיעו על התוצאות. דיווחים אחרונים הראו כי נוירונים מתמרים קיימים פורשו באופן שגוי כתאי עצב מתוכנתים מחדש15,16. בעוד שהדיווחים אינם שוללים בהכרח את העובדה שמתרחשת המרה של AtN, מחקרים אלה הדגישו את החשיבות של ניסויים מבוקרים היטב, ומספר מאמרים הציגו המלצות לצעדים הבאים בתחום 15,17,18,19. מה שברור מהספרות הוא שהביטוי החוץ רחמי של גורמי שעתוק bHLH יכול לשפר את התוצאות התפקודיות במגוון מודלים של בעלי חיים של מחלה/פציעה ניוונית 13,20,21,22,23,24.

כאן, פרוטוקול זה Neurod1, גורם שעתוק מעניין, מתבטא באופן אקטופי בתאים מותמרים13,22. נעשה שימוש במודל האנדותלין-1 (ET-1) המבוסס היטב של שבץ איסכמי לקליפת המוח התחושתית-מוטורית בעכברים בוגרים. הזרקת ET-1 מובילה להתכווצות כלי דם מקומית המחקה את הפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי, כולל ליקוי תפקודי 22,23,25. מקדם ה-GFAP הקצר הנפוץ (gfaABC(1)D) משמש להנעת הביטוי החוץ רחמי של Neurod1 באתר הפגיעה ובאזור הפרילסיוני באמצעות שתי אסטרטגיות ויראליות: (1) אספקת AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre בעכברים מסוג בר ו-(2) אספקת AAV5-GFAP-Neurod1-Cre בעכברים מדווחים tdTom-Cre. כדי להבין עוד יותר את הפוטנציאל לביטוי חוץ רחמי של Neurod1 במוח שנפגע משבץ מוחי, AAVs הועברו בשלב התת-חריף (7 ימים), או בשלב הכרוני (21 ימים), לאחר שבץ מוחי. בשתי הפרדיגמות, נמצאו באופן משמעותי יותר נוירונים מסומנים תוך שבועות לאחר ביטוי חוץ רחמי של Neurod1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת טורונטו ועומד במדריך לטיפול ושימוש בחיות ניסוי (מהדורה שנייה, המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים, 2017). עבור מחקר זה, מדווח tdTom-Cre מסוג בר (C57BL/6J) וטרנסגני tdTom-Cre (B6. נעשה שימוש בזני עכברים Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 זני עכברים. העכברים היו בני 7-9 שבועות וכללו זכרים ונקבות כאחד. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. ניתוח שבץ מוחי אנדותלין-1

הערה: כל המכשירים והחומרים הכירורגיים עוברים חיטוי על ידי חיטוי לפני הניתוח. המסגרת הסטריאוטקסית מעוקרת באמצעות PREempt. המזרקים מעוקרים עם PREempt, 70% אלכוהול, ומוכנים עם PBS סטרילי לפני הניתוח. אנדותלין-1 (ET-1) מאוחסן על קרח לאורך כל הניתוח.

  1. לפני תחילת הניתוח, הגדר את אזור ההתאוששות על ידי הנחת כלוב נקי על כרית חימום המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס. לחלופין, אם משתמשים במנורת חימום, הניחו רק מחצית מהכלוב מתחת לחום.
    1. כדי להרדים עכברים באמצעות איזופלורן, עקוב אחר הפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים. הנח את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה והפעל את החמצן ל-1-1.5 ליטר לדקה, ולאחר מכן כוונן את מכשיר האידוי איזופלורן ל-3%-5% כדי להתחיל בהרדמה.
  2. הוציאו את החיה מהתא ברגע שהיא שוכבת על צדה ואינה יכולה עוד לעמוד, והניחו אותה על משטח נקי. ודא שהחיה מורדמת כראוי על ידי אישור היעדר רפלקס צביטה בבוהן לפני ובמהלך הניתוח.
    1. אבטח את חרוט האף המורחב ממכונת ההרדמה על החיה והתאם איזופלורן ל-1%-2% לצורך תחזוקה. צמצם את החשיפה לאיזופלורן (5 דקות ב-3%-5% לאינדוקציה והזמן הנותר ב-1%-2%), מכיוון שההליך יכול להימשך עד 40 דקות.
  3. השתמש בגוזמי שיער של בעלי חיים כדי להסיר פרווה מהצוואר/מאחורי האוזניים לאף החיה כדי לחשוף את העור על הגולגולת לניתוח.
  4. יש לשקול את בעל החיים ולתת את המינון המתאים של משכך כאבים טרום ניתוחי תת עורי (מלוקסיקם (2.0 מ"ג/ק"ג)) בהתאם למשקל.
  5. יש למרוח משחת סיכה לעיניים על כל עין של העכבר כדי למנוע התייבשות בקרנית במהלך ההרדמה.
  6. עקר את אזור העור קצוץ הפרווה (שלב 1.3) עם 70% אתנול, ולאחר מכן אלכוהול כלורהקסידין פעמיים ליצירת שדה ניתוח.
  7. העבירו את העכבר למסגרת סטריאוטקסית של עכבר על ידי הנחת אפו תחילה בחרוט האף הסטריאוטקסי, ואז ייצבו את הגולגולת בעזרת מוטות אוזניים. שמור את העכבר על כרית חימום מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס לתמיכה תרמית לאורך כל הליך הניתוח. שמור על איזופלורן ב-1%-2% כך שהעכבר יציג קצב נשימה של נשימה אחת לשנייה.
  8. יש לחזור על מריחת סיכוך העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית במהלך ההליך במידת הצורך. מרחו וילון כירורגי סטרילי על גוף העכבר, מתחת לאוזניים, כדי להרחיב את גודל השדה הסטרילי.
  9. בצע חתך אנכי במקביל למישור הסגיטלי של החיה מאחורי נקודת האמצע של העיניים לחלק האחורי של הראש (עצם קודקודית) בעזרת להב אזמל #10. חשוף את הגולגולת על ידי נסיגה עדינה של העור לצדדים.
  10. השתמש בקצה Q כדי לשבש את הפאשיה על הגולגולת ולאפשר לגולגולת להתייבש כדי לחשוף ברגמה.
  11. הגדר זרועות מניפולטור עם מחזיק מקדחה הנושא מקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוהה עם מקדח 0.018 אינץ'.
  12. קדחו 3 חורי קוצים (קוטר 0.018 אינץ') עם מקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוהה בקואורדינטות בקליפת המוח התחושתית-מוטורית הימנית ב-2.25 מ"מ לרוחב לברגמה ו-+0.0 מ"מ רוסטרל, +1.0 מ"מ רוסטרל ו-1.0 מ"מ זנב לברגמה.
  13. החלף את המקדחה במזרק 26 גרם עם מחט באורך 0.375 אינץ'.
  14. טען 1.5 מיקרוליטר של 400 מיקרומטר ET-1 מומס ב-PBS סטרילי לתוך המזרק. כדי להבטיח זרימה טובה, שחרר נפח קטן של ET-1 עד שניתן להבחין בטיפה בקצה המחט. השתמש ב-Q-tip סטרילי כדי לנגב את העודפים לפני ביצוע ההזרקה.
  15. הורד את קצה המחט מעבר לגולגולת בחור הקוצים האמצעי (בקליפת המוח התחושתית-מוטורית הימנית ב-+ 0.0 קדמי ו-2.25 מ"מ לרוחב לברגמה) מבלי לנקב את הדורה מאטר. לאחר היישור, הורידו את המחט 1 מ"מ לתוך המוח.
  16. הזרקת 1 μL של ET-1 על ידי הוצאת 0.1 μL בכל פעם. דחוף את הבוכנה של מזרק המילטון קדימה כדי להוציא 0.1 מיקרוליטר והמתן דקה לפני הזרקת 0.1 מיקרוליטר הבא, הזריק עד להוצאת 1 מיקרוליטר.
    1. לאחר הוצאת ה-0.1 מיקרוליטר הסופי (0.1 מיקרוליטר x 10 זריקות = 1 מיקרוליטר בסך הכל), שמור את המחט במקומה למשך 10 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת ולאחר מכן משוך לאט כלפי מעלה כדי להסיר את המזרק.
  17. כדי להבטיח שהמחט לא תיחסם במהלך ההזרקה, שחרר נפח קטן של ה-ET-1 עד שניתן יהיה להבחין בטיפה בקצה המחט. השתמש ב-Q-tip סטרילי כדי לנגב את העודפים לפני ביצוע ההזרקה. עקר מזרקים לפני הזרקת PREempt לבעל החיים הבא, ואחריו 70% אלכוהול, ולאחר מכן PBS סטרילי.
  18. כדי לסגור את הפצע, תפר את העור שמעל הגולגולת יחד באמצעות תפר סטרילי פוליאסטר 4-0.
  19. יש לתת משחה אנטיביוטית באמצעות צמר גפן על האזור התפור כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח.
  20. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והעבר אותו לכלוב דיור בעלי חיים נקי ומחומם מראש באזור ההתאוששות. כבה את מכשיר האידוי והחמצן של איזופלורן.
  21. שמור את הכלוב על גבי כרית חימום למשך ההחלמה מההרדמה. לחלופין, אם אתה משתמש במנורת חימום, הנח את העכבר בצד הכלוב מתחת למנורה כך שהעכבר יוכל לעבור לצד הקריר של הכלוב כשהוא מתעורר מההרדמה כדי למנוע התחממות יתר. עקוב אחר העכבר כשהוא יוצא מההרדמה ב-5-10 הדקות הבאות.
  22. עקוב אחר העכבר במהלך 3 הימים הבאים (ניטור משקל), ספק טיפול לאחר הניתוח (צ'או מחית לח כדי להבטיח הידרציה) ומשככי כאבים (2 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם, פעמיים ביום תת עורית, למשך 2-3 ימים) בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים.

2. אספקת נגיף אדנו (AAV) (7 ימים - מודל תת-חריף או 21 ימים - מודל כרוני) לאחר שבץ מוחי

זהירות: עיין בהנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות לעבודה עם AAVs. על פי ההנחיות באוניברסיטת טורונטו, ניתוח זה מבוצע בארון בטיחות ביולוגית ברמה 2.

הערה: כל המכשירים והחומרים הכירורגיים עוברים חיטוי על ידי חיטוי לפני הניתוח. המסגרת הסטריאוטקסית מעוקרת באמצעות PREempt. מזרקים מעוקרים עם PREempt, 70% אלכוהול, ומוכנים ב-PBS סטרילי. AAV מאוחסנים על קרח לאורך כל הניתוח.

  1. לפני תחילת הניתוח, הגדר את אזור ההתאוששות על ידי הנחת כלוב נקי על כרית חימום המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס. לחלופין, אם משתמשים במנורת חימום, הניחו רק מחצית מהכלוב מתחת לחום.
    1. כדי להרדים עכברים באמצעות איזופלורן, הנח את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה והפעל את החמצן ל-1-1.5 ליטר לדקה, ולאחר מכן כוונן את מכשיר האידוי איזופלורן ל-3%-5% כדי להתחיל הרדמה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על פי החוק).
  2. הסר את החיה מהתא ברגע שהיא שוכבת על צדה ואינה יכולה עוד לעמוד על משטח נקי. ודא שהחיה מורדמת כראוי על ידי אישור היעדר רפלקס צביטה בבוהן לפני ובמהלך הניתוח.
    1. אבטח את חרוט האף המורחב ממכונת ההרדמה על החיה והתאם איזופלורן ל-1%-2% לצורך תחזוקה. צמצם את החשיפה לאיזופלורן (5 דקות ב-3%-5% לאינדוקציה והזמן הנותר ב-1%-2%), מכיוון שההליך יכול להימשך עד 40 דקות.
  3. יש לשקול את בעל החיים ולתת את המינון המתאים של משכך כאבים טרום ניתוחי תת עורי (מלוקסיקם (2.0 מ"ג/ק"ג)) בהתאם למשקל.
  4. מרחו משחת סיכה לעיניים על כל עין של העכבר כדי למנוע ייבוש בקרנית תחת הרדמה.
  5. עקר את אזור העור קצוץ הפרווה עם 70% אתנול, ולאחר מכן אלכוהול כלורהקסידין פעמיים ליצירת שדה ניתוח.
  6. העבירו את העכבר למסגרת סטריאוטקסית של עכבר על ידי הנחת אפו תחילה בחרוט האף הסטריאוטקסי, ואז ייצבו את הגולגולת בעזרת מוטות אוזניים. שמור את העכבר על כרית חימום מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס לתמיכה תרמית לאורך כל הליך הניתוח. שמור על איזופלורן ב-1%-2% כך שהעכבר יציג את קצב הנשימה של נשימה אחת לשנייה.
  7. יש לחזור על מריחת סיכוך העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית במהלך ההליך במידת הצורך. מרחו וילון כירורגי סטרילי על גוף העכבר, מתחת לאוזניים, כדי להרחיב את גודל השדה הסטרילי.
  8. אם עדיין קיים, חותכים תפרים עם מספריים כירורגיים ומסירים את הגלד בעזרת זוג מלקחיים. משוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
    הערה: עבור הדגם הכרוני ייתכן שיהיה צורך לכרות את העור עם להב אזמל #10.
  9. השתמש בקצה Q סטרילי כדי לייבש את הגולגולת ולאתר חורי קוצים.
  10. הגדר זרועות מניפולטור של המנגנון הסטריאוטקסי עם מחזיק מחט הנושא מזרק 26 גרם עם מחט באורך 0.375 אינץ'.
  11. טען 3.4 מיקרוליטר של AAV (1 x 109 עותקי גנום (GC)/μL למחקר חריף; 1 x 1010 GC/μL למחקר כרוני) לתוך המזרק. כדי להבטיח שהזרימה טובה, שחרר נפח קטן של AAV עד שניתן להבחין בטיפה בקצה המחט. השתמש ב-Q-tip סטרילי כדי לנגב את העודפים לפני ביצוע ההזרקה.
  12. הורד את קצה המחט מעבר לגולגולת בחור הקוצים הראשון המשמש ל-ET-1 (בקליפת המוח התחושתית-מוטורית הימנית ב-+ 0.0 קדמי ו-2.25 מ"מ לרוחב לברגמה) מבלי לנקב את הדורה מאטר. לאחר היישור, הורידו את המחט 1 מ"מ לתוך המוח. (0 AP, +2.25 מ"ל, -1.0 DV מברגמה).
  13. הזרקו 1 מיקרוליטר של AAV (1 x 109 GC/μL למחקר אקוטי; 1 x 1010 GC/μL למחקר כרוני) על ידי הוצאת 0.1 מיקרוליטר בכל פעם. דחוף את הבוכנה של מזרק המילטון קדימה כדי להוציא 0.1 מיקרוליטר והמתן דקה לפני הזרקת 0.1 מיקרוליטר הבא; להזריק עד להוצאת 1 מיקרוליטר. לאחר הוצאת ה-0.1 מיקרוליטר הסופי (0.1 מיקרוליטר x 10 זריקות = 1 מיקרוליטר בסך הכל), שמור את המחט במקומה למשך 10 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת ולאחר מכן משוך לאט כלפי מעלה כדי להסיר את המזרק.
  14. כדי להבטיח שהמחט לא תיחסם במהלך ההזרקה, שחרר נפח קטן של ה-AAV עד שניתן להבחין בטיפה בקצה המחט. השתמש ב-Q-tip סטרילי כדי לנגב את העודפים לפני ביצוע ההזרקה.
  15. חזור על שלבים 2.11-2.14 עבור הזרקות ה-AAV לתוך שני חורי הקוצים הנותרים (בקליפת המוח התחושתית-מוטורית הימנית ב-+1 AP, +2.25 מ"ל, -1.0 DV; ו-1 AP, +2.25 מ"ל, -1.0 DV מ"מ מברגמה. עקר מזרקים לפני הזרקת PREempt לבעל החיים הבא, ואחריו 70% אלכוהול, ולבסוף PBS סטרילי.
  16. כדי לסגור את הפצע, תפר את העור שמעל הגולגולת יחד באמצעות תפר סטרילי פוליאסטר 4-0.
  17. יש לתת משחה אנטיביוטית באמצעות צמר גפן על האזור התפור כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח.
  18. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והעבר אותו לכלוב דיור בעלי חיים נקי ומחומם מראש באזור ההתאוששות. כבה את מכשיר האידוי והחמצן של איזופלורן.
  19. שמור את העכבר בתוך הכלוב ועיקר את החלק החיצוני של הכלוב עם PREempt ו-70% אלכוהול לפני הנחתו על גבי כרית חימום להתאוששות מהרדמה.
    1. לחלופין, אם אתה משתמש במנורת חימום, הנח את העכבר בצד הכלוב מתחת למנורה כך שהעכבר יוכל לעבור לצד הקריר של הכלוב כשהוא מתעורר מההרדמה כדי למנוע התחממות יתר. עקוב אחר העכבר כשהוא יוצא מההרדמה ב-5-10 הדקות הבאות.
  20. עקוב אחר העכבר במהלך 3 הימים הבאים (ניטור משקל), ספק טיפול לאחר הניתוח (צ'או מחית לח כדי להבטיח הידרציה) ומשככי כאבים (2 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם, פעמיים ביום תת עורית, למשך 2-3 ימים) בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים.

3. הכנת רקמות ודיסקציה

  1. כדי להמית את העכבר, יש להזריק לעכבר תוך הצפק טריברומו-אתנול (אברטין) (12.5 מ"ג/מ"ל, 250 מ"ג/משקל (ק"ג)) ולאפשר 2-3 דקות לאינדוקציה מלאה. ודא שהחיה מורדמת כראוי על ידי הוצאת העכבר מהכלוב ואישור היעדר רפלקס צביטה בבוהן.
  2. במכסה אדים, בצע זלוף טרנס-קרדיאלי26 עם מי מלח ואחריו 4% פרפורמלדהיד. מרססים את ראשו של בעל החיים המורדם באתנול 70% עד להשרייה.
  3. חותכים את הראש בבסיס הגולגולת באמצעות מספריים גדולים. חותכים את העור לאורך קו האמצע של הגולגולת כולה בעזרת מספריים ישרים של קשתית בגודל 4-1/2 אינץ'. משוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
  4. מפתח חלל עמוד השדרה בצוואר, הכנס את מספרי הקשתית וחתוך את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי והבין-מצחי.
  5. לאחר מכן הכנס מספריים לשתי ארובות העיניים וחתוך את התפר הקדמי-אף.
  6. היזהר במיוחד לא לפגוע במוח. פתחו את לוחות הגולגולת שמאלה וימינה עד שהמוח נחשף.
  7. העבירו את המוח לבקבוקון נצנוץ עם 4% פרפורמלדהיד. שמור על המוח ב-4% פרפורמלדהיד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
  8. לאחר מכן המוח מוגן בהקפאה על ידי החלפת 4% פרפורמלדהיד ב-30% סוכרוז. שמור על המוח ב-30% סוכרוז ב-4 מעלות צלזיוס עד שהמוח שוקע לתחתית הבקבוקון (~12 שעות).

4. חיתוך מוחות קפואים

  1. הגדר את הטמפרטורה של תא הקריוסטט בין -20 מעלות צלזיוס ל-26 מעלות צלזיוס.
  2. בצע חתך עטרה על פני המוח הקטן והצמד את החלק השטוח והזנבי של המוח על צ'אק קריוסטט עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
  3. הנח את הצ'אק עם המוח במחזיק הדיסק ויישר את נורת הריח עם להב הסכין.
  4. חתכו את המוח לפרוסות עטרה בעובי של 20 מיקרומטר. כדי למנוע פסים או קווי שריטות על פרוסות מוח חתוכות, הנח פיסת סרט על משטח החיתוך כדי ליצור רווח קטן בין הצלחת נגד גלגול לפלטפורמה. ניתן להשתמש במברשת צבע כדי להתאים את כיוון החלק לפני צילומו על שקופית זכוכית טעונה חיובית.
  5. אחסן שקופיות המכילות חלקי מוח ב-20 מעלות צלזיוס.

5. אימונוהיסטוכימיה וכימות

  1. לעבד את החלקים לאימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן ראשוני כנגד NeuN, סמן פאן-עצבי, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים22,26.
  2. הפשירו חלקי מוח שמורים בהקפאה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את החלקים שלוש פעמים עם 1x מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) למשך 5 דקות כל אחד.
  3. דגרו את החלקים ב-0.3% Triton X-100 ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל.
  4. הכן את תמיסת החסימה (5% סרום עיזים רגיל ו-0.3% טריטון X-100 ב-PBS) ודגר את החלקים בתמיסת החסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  5. לדלל את הנוגדן העיקרי, ארנב אנטי-NeuN, ביחס של 1:500 בתמיסת החסימה. דגרו את החלקים עם תמיסת הנוגדנים העיקרית למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. שטפו את החלקים שלוש פעמים עם 0.3% Triton X-100 ב-PBS, למשך 5 דקות בכל כביסה.
  7. יש לדלל את הנוגדן המשני, עז נגד ארנב 568 או 488, ביחס של 1:1000 ב-PBS. דגרו את החלקים עם תמיסת הנוגדנים המשנית למשך שעה בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור.
  8. בצע שלוש כביסות עם 0.3% Triton X-100 ב-PBS, למשך 5 דקות כל אחת. דגרו את החלקים עם DAPI (1:10,000 ב-PBS) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. שוטפים את החלקים שלוש פעמים נוספות עם PBS, למשך 5 דקות כל אחד. הרכיב את החלקים המוכתמים על מגלשת זכוכית עם מדיום הרכבה פלואורסצנטי וכיסוי זכוכית. אפשר למגלשות המותקנות להתייבש למשך הלילה.
  10. שקופיות מוכתמות בתמונה באמצעות אובייקט פי 20 עם מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לקבל תצוגות של תאי Reporter+ סביב נגע השבץ ב-3 קטעי קורונל שונים (בין האזורים האנטומיים של חציית הקורפוס קלוסום מלפנים וחציית הקומיסורה הקדמית מאחור) עבור כל בעל חיים.
    הערה: המרחק של התפשטות ה-AAV ישתנה בתוך חצי הכדור. עם זאת, בהתבסס על הניסיון שלנו וניתוח עיבוד הרקמות של תאי Reporter+, התפשטות ה-AAV משתרעת בדרך כלל על פני כ-+3 מ"מ עד -3 מ"מ מברגמה. יש לכמת תאים מדווח + סביב נגע השבץ (כפי שזוהה על ידי היעדר/צביעה דלילה של NeuN) באזור שבין המקום שבו הקורפוס קלוסום חוצה את קו האמצע לבין חיבור הקומיסורה הקדמית.
  11. לכימות נוירונים מותמרים, בצע ניתוח קולוקליזציה. ספור ידנית את מספר התאים החיוביים הכפולים (Reporter+NeuN+) ואת המספר הכולל של תאים שהומרו (Reporter+) בפרוסות מוח. לתוצאות כאן, נספרו >3 שדות ראייה המקיפים את הנגע (מדיאלי, רוחבי ונחות) מ-3 חתכים עטרתיים לכל עכבר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לבחון את התוצאות התאיות של ביטוי מקדם GFAP קצר (gfaABC(1)D), מונע על ידי מקדם חוץ רחמי בסוג פרא (C57BL/6J) ובזנים מדווחים טרנסגניים tdTom-Cre (ספציפית, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 שתי מערכות מבוססות AAV5 שימשו בעכברים שנפגעו משבץ ET-1 (איור 1A-C

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מפרט שתי מערכות AAV ומודלים של עכברים לחקירת הביטוי החוץ רחמי של Neurod1 בהקשר של מודל שבץ מוחי ET-1 קל-בינוני. חשוב לקחת בחשבון מספר שלבים קריטיים הקשורים לשבץ ET-1 לצורך שחזור ועקביות הפציעה. יש לקדוח בזהירות חורי בור מבלי לנקב את הדורה מאטר כדי למנוע פציעה כירו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן הלב והשבץ, המכון לרפואה רגנרטיבית של אונטריו, קרן המצוינות המחקרית הראשונה של קנדה (Medicine by Design, MbD) ופרס החדשנות של קונוט (אוניברסיטת טורונטו).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#77 Drill Bit (.018”)David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb™ Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Needle Size 4 - 0 BraidedCovidienGL-881
Anti-NeuN Antibody (rabbit) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 MiceCharles River027
Chlorhexidine SolutionPartnarPCH-020
Contec™ PREempt™ RTU Disinfectant SolutionFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Feather Safety Razor Microtome BladesFeather12-631P
Fisherbrand Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-545M 
Fluorescence Mounting MediumAgilent TechnologiesS3023 
Hamilton SyringeHamilton Company7634-01
High Speed Stereotaxic DrillDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Polyderm Ointment USPTARO2181908
SOMNI Scientific™ The Animal Temperature Heating PadFisher Scientific04-777-177
Stereotaxic InstrumentsDavid Kopf InstrumentsModel 902
Superfrost Plus Microscope Slides, whiteFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice The Jackson Laboratory007914
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901806

References

  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071(2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531(2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490(2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663(2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310(2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

AAV1BHLHGFAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved