JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, kortikal iskemik inmeyi takiben Neurod1'in viral aracılı ektopik ekspresyonunu tanımlar. Neurod1, (1) inme sonrası subakut faz sırasında (7 gün) vahşi tip farelerde Cre-Flex AAV sistemi kullanılarak ve (2) inme sonrası kronik faz sırasında (21 gün) koşullu raportör farelerde tek bir AAV vektörü kullanılarak verilir.

Özet

Nörojenik faktörlerin in vivo ektopik ekspresyonu, hastalık modellerinde kaybedilen nöronların yerine konması için umut verici bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. Retrovirüs, lentivirüs ve adeno-ilişkili virüs (AAV) dahil olmak üzere yayılmayan virüs benzeri parçacık sistemleri aracılığıyla nöral temel sarmal-döngü-sarmal (bHLH) transkripsiyon faktörlerinin kullanımı kapsamlı bir şekilde bildirilmiştir. İn vivo deneyler için, AAV'ler düşük patojeniteleri ve çevrilebilirlik potansiyelleri nedeniyle giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, iskemik inme sonrası transdüksiyon hücrelerinde transkripsiyon faktörlerinin ektopik ekspresyonunu araştırmak için iki AAV sistemini tanımlar. Her iki sistemde de Neurod1 ekspresyonu, nörojenik faktör ekspresyonu ile birleştirildiğinde inme sonrası reaktif astrositlerde ve ayrıca endojen nöronlarda yukarı regüle edilen kısa GFAP (gfaABC (1) D) promotörü tarafından kontrol edilir. Tarif edilen iskemik inme modelinde, fokal iskemi, farelerin motor korteksine endotelin-1 (ET-1) enjekte edilerek, reaktif GFAP eksprese eden astrositler ve hayatta kalan nöronlarla çevrili bir lezyon oluşturularak indüklenir. AAV'nin intraserebral enjeksiyonları, inme sonrası subakut (7 gün) ve kronik (21 gün) fazlarda Neurod1 ekspresyonunu ektopik olarak indüklemek için gerçekleştirilir. AAV enjeksiyonunu takip eden haftalar içinde, ektopik olarak Neurod1 eksprese eden farelerde, AAV kontrol virüsleri alan farelere kıyasla, transdüksiyon hücreleri arasında önemli ölçüde daha yüksek sayıda nöron tanımlanır. Kullanılan AAV tabanlı stratejiler, hafif ila orta şiddette kortikal inme modelinde raportör geni eksprese eden artan sayıda nöronun gözlemlenen sonuçlarını tekrarladı. Bu protokol, AAV tabanlı sistemlerle sağlanan transkripsiyon faktörlerinin ektopik ekspresyonunun etkilerini keşfetmek için standart bir platform oluşturur ve inme bağlamında nörojenik faktör ekspresyonunun anlaşılmasına katkıda bulunur.

Giriş

İnme, dünya çapında önde gelen bir sakatlık nedenidir1. Beyne giden kan akışı bozulduğunda inme meydana gelir. Bu, beyindeki bir kan damarının patladığı hemorajik inme (vakaların ~% 15'i) veya beyne giden kan akışının engellendiği iskemik inme yoluyla ortaya çıkabilir1. İskemik inmeler en yaygın olanıdır ve inme vakalarının ~% 85'ini oluşturur1. İnme, beyne glikoz ve oksijen iletimini azaltarak hızlı nöronal hücre ölümüne ve nöral fonksiyonun bozulmasına yol açar.

İskemik inme, eksitotoksisite, oksidatif ve nitrozatif stres, kalsiyum düzensizliği, kortikal yayılım depolarizasyonu, ödem, kan-beyin bariyerinin (BBB) bozulması ve inflamasyon mekanizmaları yoluyla lezyonun çekirdeğinde dakikalar içinde hücre kaybına yol açar 2,3. Peri-enfarktüs bölgelerindeki hücreler saatler içinde ve inme sonrası günlerce apoptotik hücre ölümüne uğrar4. Peri-enfarktüs ortamı, yaralanmadan sonra çeşitli roller oynayan mikroglia ve astrositlerin ("reaktif" astrositler) aktivasyonuna yol açan pro- ve anti-enflamatuar sinyallere maruz kalır 5,6,7,8. Reaktif astrositler, glial fibriler asidik proteinin (GFAP) yukarı regülasyonunu ve inmeden sonraki günler içinde lezyonun etrafında, lezyonun derecesini sınırlamaya yardımcı olan ve yaralı doku içindeki nöroplastisiteyi etkileyen bir sınır oluşumunu içeren bir dizi fenotipik değişikliğe uğrar 8,9,10.

Doğrudan hücresel yeniden programlama, bir olgun hücre tipinin pluripotent bir durumdan geçmeden farklı bir olgun hücre tipine dönüştürülmesine izin verir11. Yerleşik beyin hücrelerini, yaralanma nedeniyle kaybedilenlerin yerine koymak için yeni nöronlara dönüştürmek, beyin restorasyonu için çekici bir yol sunar. İnme, kaybedilen nöronların yerini almak, terapötik zaman çerçevesini genişletmek ve nihayetinde fonksiyonel iyileşmeyi kolaylaştırmak için terapötik yöntemlerin gerekliliği göz önüne alındığında, hücre bazlı tedaviler için ideal bir hedeftir. Bu amaçla, Ascl1, Neurog2, Neurod1 ve daha yakın zamanda, Ascl1'in (Ascl1-SA6) gelişmiş yeniden programlama etkinliği gösteren mutasyona uğramış versiyonları dahil olmak üzere çeşitli temel sarmal-döngü-sarmal (bHLH) nörojenik transkripsiyon faktörleri kullanılarak in vitro ve in vivo olarak astrositten nörona (AtN) yeniden programlamayı gösteren birçok makale yapılmıştır 11,12,13,14. Dikkate alınması gereken önemli olan, sonuçları, yorumlamayı ve çalışmalar arasındaki karşılaştırmaları etkileyebilecek birçok deneysel tasarım faktörüdür. Ghazale ve ark. aynı bHLH transkripsiyon faktörü14 kullanıldığında AtN yeniden programlama verimliliğinin farklı fare suşları, AAV serotipleri ve promotörler arasında değiştiğini gösterdi. Yaralanma modeli, beyin bölgesi, viral dozlama, gen iletiminin zamanlaması, yeniden programlama faktörü ve uygulama şekli gibi diğer hususlar sonuçları etkileyecektir. Son raporlar, önceden var olan transdüksiyonlu nöronların yeniden programlanmış nöronlar olarak yanlış yorumlandığını göstermiştir 15,16. Raporlar, AtN dönüşümünün gerçekleştiğini mutlaka reddetmese de, bu çalışmalar iyi kontrol edilen deneylerin önemini vurgulamıştır ve birkaç makale, 15,17,18,19 alanındaki sonraki adımlar için öneriler ortaya koymuştur. Literatürden açıkça anlaşılan şey, bHLH transkripsiyon faktörlerinin ektopik ekspresyonunun, nörodejeneratif hastalık/yaralanmanın çeşitli hayvan modellerinde fonksiyonel sonuçları iyileştirebileceğidir 13,20,21,22,23,24.

Burada, ilgilenilen bir transkripsiyon faktörü olan bu protokol Neurod1, transdüksiyon hücrelerinde ektopik olarak eksprese edilir13,22. Yetişkin farelerde sensorimotor kortekse iskemik inmenin iyi bilinen endotelin-1 (ET-1) modeli kullanılır. ET-1 enjeksiyonu, fonksiyonel bozukluk22,23,25 dahil olmak üzere iskemik inme patofizyolojisini taklit eden lokal vazokonstriksiyona yol açar. Yaygın olarak kullanılan kısa GFAP promotörü (gfaABC (1) D), iki viral strateji kullanarak yaralanma bölgesinde ve perilezyonel bölgede Neurod1'in ektopik ekspresyonunu yönlendirmek için kullanılır: (1) AAV5-CAG-Flex:: GFP + AAV5-GFAP-Neurod1-Cre vahşi tip farelerde ve (2) tdTom-Cre muhabir farelerde AAV5-GFAP-Neurod1-Cre dağıtımı. İnme geçirmiş beyinde Neurod1'in ektopik ekspresyonu potansiyelini daha iyi anlamak için, AAV'ler inme sonrası subakut fazda (7 gün) veya kronik fazda (21 gün) verildi. Her iki paradigmada da, ektopik Neurod1 ekspresyonunu takip eden haftalar içinde önemli ölçüde daha fazla etiketli nöron bulundu.

Protokol

Bu protokol Toronto Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (2. Baskı, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi, 2017) bağlıdır. Bu çalışma için, vahşi tip (C57BL/6J) ve transgenik tdTom-Cre raportörü (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 fare suşları kullanıldı. Fareler 7-9 haftalıktı ve hem erkekleri hem de dişileri içeriyordu. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Endotelin-1 inme cerrahisi

NOT: Tüm cerrahi alet ve malzemeler ameliyat öncesi otoklav ile sterilize edilmektedir. Stereotaksik çerçeve PREempt ile sterilize edilir. Şırıngalar PREempt, %70 alkol ile sterilize edilir ve ameliyattan önce steril PBS ile astarlanır. Endotelin-1 (ET-1) ameliyat boyunca buz üzerinde saklanır.

  1. Ameliyata başlamadan önce, 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığına temiz bir kafes yerleştirerek iyileşme alanını ayarlayın. Alternatif olarak, bir ısıtma lambası kullanılıyorsa, kafesin sadece yarısını ısının altına yerleştirin.
    1. İzofluran kullanarak fareleri uyuşturmak için, Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanan protokolü izleyin. Fareyi anestezik indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijeni 1-1.5 L / dk'ya getirin, ardından anesteziyi başlatmak için izofluran buharlaştırıcıyı %3-5'e ayarlayın.
  2. Hayvanı yan yattığında ve artık ayakta duramadığında odadan çıkarın ve temiz bir yüzeye koyun. Ameliyattan önce ve ameliyat boyunca ayak parmağını kıstırma refleksinin olmadığını doğrulayarak hayvanın yeterince uyuşturulduğundan emin olun.
    1. Anestezik makinesinden uzatılan burun konisini hayvanın üzerine sabitleyin ve bakım için izofluranı %1-2'ye ayarlayın. İzoflura maruz kalmayı en aza indirin (indüksiyon için% 3 -% 5'te 5 dakika ve% 1 -% 2'de kalan süre), çünkü prosedürün tamamlanması 40 dakika kadar sürebilir.
  3. Ameliyat için kafatasındaki cildi ortaya çıkarmak için boynundan/kulakların arkasından hayvanın burnuna kadar kürkü çıkarmak için hayvan kılı düzelticileri kullanın.
  4. Hayvanı tartın ve ağırlığa bağlı olarak uygun preoperatif analjezik dozunu deri altına (Meloksikam (2.0 mg / kg)) uygulayın.
  5. Anestezi sırasında kornea kurumasını önlemek için farenin her bir gözüne göz kayganlaştırıcı merhem sürün.
  6. Kürklü deri bölgesini (adım 1.3) %70 etanol ile sterilize edin, ardından cerrahi bir alan oluşturmak için iki kez Klorheksidin alkol uygulayın.
  7. Önce burnunu stereotaksik burun konisine yerleştirerek fareyi bir fare stereotaksik çerçevesine aktarın, ardından kafatasını kulak çubuklarıyla sabitleyin. Ameliyat prosedürü boyunca termal destek için fareyi 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. İzofluranı %1-2'de tutun, böylece fare 1 nefes/s'lik bir solunum hızı gösterir.
  8. Gerekirse işlem sırasında kornea kurumasını önlemek için göz kayganlığı uygulamasını tekrarlayın. Steril alanın boyutunu uzatmak için farenin gövdesine, kulakların altına steril bir cerrahi örtü uygulayın.
  9. #10 neşter bıçağı ile gözlerin orta noktasının arkasından başın arkasına (parietal kemik) hayvanın sagital düzlemine paralel dikey bir kesi yapın. Cildi yanlara doğru nazikçe geri çekerek kafatasını ortaya çıkarın.
  10. Kafatasındaki fasyayı bozmak için bir Q-ucu kullanın ve bregmayı ortaya çıkarmak için kafatasının kurumasını bekleyin.
  11. .018" matkap ucu ile yüksek hızlı stereotaksik matkap taşıyan matkap tutuculu manipülatör kollarını ayarlayın.
  12. Sağ sensorimotor kortekste bregma ve +0.25 mm rostral, +1.0 mm rostral ve -1.0 mm kaudal ile bregma için 2.25 mm lateral koordinatlarda yüksek hızlı stereotaksik matkapla 3 çapak deliği (.018" çapında) delin.
  13. Matkabı 0,375 "uzunluğunda bir iğneye sahip 26 G'lik bir şırınga ile değiştirin.
  14. Steril PBS içinde çözülmüş 1,5 μL 400 μM ET-1'i şırıngaya yükleyin. İyi bir akış sağlamak için, iğnenin ucunda bir damla gözlenene kadar küçük bir hacimde ET-1 bırakın. Enjeksiyon yapmadan önce fazlalığı silmek için steril bir Q ucu kullanın.
  15. İğnenin ucunu, dura mater'i delmeden orta çapak deliğinde (sağ sensorimotor kortekste + 0.0 anterior ve bregmanın 2.25 mm lateralinde) kafatasını geçecek şekilde indirin. Hizalandıktan sonra, iğneyi beyne 1 mm indirin.
  16. Bir seferde 0,1 μL dağıtarak 1 μL ET-1 enjekte edin. 0.1 μL'yi dağıtmak için Hamilton şırıngasının pistonunu ileri doğru itin ve sonraki 0.1 μL'yi enjekte etmeden önce bir dakika bekleyin, 1 μL dağıtılana kadar enjekte edin.
    1. Son 0.1 μL dağıtıldıktan sonra (0.1 μL x 10 enjeksiyon = toplam 1 μL), geri akışı önlemek için iğneyi 10 dakika yerinde tutun ve ardından şırıngayı çıkarmak için yavaşça yukarı doğru çekin.
  17. Enjeksiyon sırasında iğnenin tıkanmamasını sağlamak için, iğnenin ucunda bir damla gözlenene kadar küçük bir ET-1 hacmini serbest bırakın. Enjeksiyon yapmadan önce fazlalığı silmek için steril bir Q ucu kullanın. Bir sonraki hayvana PREempt, ardından% 70 alkol ve ardından steril PBS enjekte etmeden önce şırıngaları sterilize edin.
  18. Yarayı kapatmak için, 4-0 polisorb polyester steril sütür kullanarak kafatasının üstündeki cildi birbirine dikin.
  19. Ameliyat sonrası enfeksiyonu önlemek için dikişli bölgeye pamuklu çubuk kullanarak antibiyotik merhem uygulayın.
  20. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kurtarma alanındaki temiz, önceden ısıtılmış bir hayvan barınağı kafesine aktarın. İzofluran buharlaştırıcısını ve oksijeni kapatın.
  21. Anesteziden iyileşme süresi boyunca kafesi bir ısıtma yastığının üzerinde tutun. Alternatif olarak, bir ısıtma lambası kullanıyorsanız, aşırı ısınmayı önlemek için farenin anesteziden uyanırken kafesin serin tarafına hareket edebilmesi için fareyi lambanın altındaki kafesin yan tarafına yerleştirin. Fareyi önümüzdeki 5-10 dakika içinde anesteziden çıkarken izleyin.
  22. Önümüzdeki 3 gün boyunca fareyi izleyin (kilo izleme), ameliyat sonrası bakım (hidrasyonu sağlamak için nemli püre yemeği) ve analjezikler (2 mg / kg meloksikam, günde 2 kez, 2-3 gün boyunca deri altında) sağlayın yerel hayvan bakım komitesi tarafından belirlenen düzenlemelere uygun olarak.

2. İnme sonrası Adeno-İlişkili Virüs (AAV) doğumu (7 gün - subakut model veya 21 gün - kronik model)

DİKKAT: AAV'lerle çalışmak için kurumsal biyogüvenlik yönergelerine bakın. Toronto Üniversitesi'ndeki yönergelere göre, bu ameliyat bir Muhafaza Seviyesi 2 Biyogüvenlik Kabininde gerçekleştirilir.

NOT: Tüm cerrahi alet ve malzemeler ameliyat öncesi otoklav ile sterilize edilmektedir. Stereotaksik çerçeve PREempt ile sterilize edilir. Şırıngalar PREempt,% 70 alkol ile sterilize edilir ve steril PBS ile astarlanır. AAV'ler ameliyat boyunca buz üzerinde saklanır.

  1. Ameliyata başlamadan önce, 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığına temiz bir kafes yerleştirerek iyileşme alanını ayarlayın. Alternatif olarak, bir ısıtma lambası kullanılıyorsa, kafesin sadece yarısını ısının altına yerleştirin.
    1. İzofluran kullanarak fareleri uyuşturmak için, fareyi anestezik indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijeni 1-1.5 L / dk'ya getirin, ardından anesteziyi başlatmak için izofluran buharlaştırıcıyı %3-5'e ayarlayın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
  2. Hayvanı yan yattığında ve artık temiz bir yüzeyde duramadığında odadan çıkarın. Ameliyattan önce ve ameliyat boyunca ayak parmağını kıstırma refleksinin olmadığını doğrulayarak hayvanın yeterince uyuşturulduğundan emin olun.
    1. Anestezik makinesinden uzatılan burun konisini hayvanın üzerine sabitleyin ve bakım için izofluranı %1-2'ye ayarlayın. İzoflura maruz kalmayı en aza indirin (indüksiyon için% 3 -% 5'te 5 dakika ve% 1 -% 2'de kalan süre), çünkü prosedürün tamamlanması 40 dakika kadar sürebilir.
  3. Hayvanı tartın ve ağırlığa bağlı olarak uygun preoperatif analjezik dozunu deri altına (Meloksikam (2.0 mg / kg)) uygulayın.
  4. Kornea kurumasının anestezi altında olmasını önlemek için farenin her bir gözüne göz kayganlaştırıcı merhem sürün.
  5. Kürklü cilt bölgesini %70 etanol ile sterilize edin, ardından cerrahi bir alan oluşturmak için iki kez Klorheksidin alkol uygulayın.
  6. Önce burnunu stereotaksik burun konisine yerleştirerek fareyi bir fare stereotaksik çerçevesine aktarın, ardından kafatasını kulak çubuklarıyla sabitleyin. Ameliyat prosedürü boyunca termal destek için fareyi 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. İzofluranı %1-2'de tutun, böylece fare 1 nefes/s'lik solunum hızını gösterir.
  7. Gerekirse işlem sırasında kornea kurumasını önlemek için göz kayganlığı uygulamasını tekrarlayın. Steril alanın boyutunu uzatmak için farenin gövdesine, kulakların altına steril bir cerrahi örtü uygulayın.
  8. Hala varsa, dikişleri bir çift cerrahi makasla kesin ve kabuğu bir çift forseps ile çıkarın. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi geri çekin.
    NOT: Kronik model için cildi # 10 neşter bıçağı ile çıkarmak gerekebilir.
  9. Kafatasını kurutmak ve çapak deliklerini bulmak için steril bir Q ucu kullanın.
  10. Stereotaksik cihazın manipülatör kollarını, 0.375 "uzunluğunda bir iğne ile 26 G'lik bir Şırınga taşıyan bir iğne tutucu ile ayarlayın.
  11. Şırıngaya 3.4 μL AAV (akut çalışma için 1 x 109 Genom Kopyası (GC) / μL; kronik çalışma için 1 x 1010 GC / μL) yükleyin. Akışın iyi olduğundan emin olmak için, iğnenin ucunda bir damla gözlenene kadar küçük bir hacimde AAV bırakın. Enjeksiyon yapmadan önce fazlalığı silmek için steril bir Q ucu kullanın.
  12. İğnenin ucunu, ET-1 için kullanılan ilk çapak deliğinde (sağ sensorimotor kortekste + 0.0 anteriorda ve bregmanın 2.25 mm lateralinde) dura mater'i delmeden kafatasını geçecek şekilde indirin. Hizalandıktan sonra, iğneyi beyne 1 mm indirin. (0 AP, +2.25 ML, Bregma'dan -1.0 DV).
  13. Bir seferde 0.1 μL dağıtarak 1 μL AAV (akut çalışma için 1 x 109 GC / μL; kronik çalışma için 1 x10 10 GC / μL) enjekte edin. 0.1 μL'yi dağıtmak için Hamilton şırıngasının pistonunu ileri doğru itin ve sonraki 0.1 μL'yi enjekte etmeden önce bir dakika bekleyin; 1 μL dağıtılana kadar enjekte edin. Son 0.1 μL dağıtıldıktan sonra (0.1 μL x 10 enjeksiyon = toplam 1 μL), geri akışı önlemek için iğneyi 10 dakika yerinde tutun ve ardından şırıngayı çıkarmak için yavaşça yukarı doğru çekin.
  14. Enjeksiyon sırasında iğnenin tıkanmamasını sağlamak için, iğnenin ucunda bir damla görülene kadar küçük bir hacimde AAV bırakın. Enjeksiyon yapmadan önce fazlalığı silmek için steril bir Q ucu kullanın.
  15. Kalan iki çapak deliğine (sağ sensorimotor kortekste +1 AP, +2.25 ML, -1.0 DV; ve bregmadan -1 AP, +2.25 ML, -1.0 DV mm'de) AAV enjeksiyonları için 2.11-2.14 adımlarını tekrarlayın. Bir sonraki hayvana PREempt, ardından %70 alkol ve son olarak steril PBS enjekte etmeden önce şırıngaları sterilize edin.
  16. Yarayı kapatmak için, 4-0 polisorb polyester steril sütür kullanarak kafatasının üstündeki cildi birbirine dikin.
  17. Ameliyat sonrası enfeksiyonu önlemek için dikişli bölgeye pamuklu çubuk kullanarak antibiyotik merhem uygulayın.
  18. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kurtarma alanındaki temiz, önceden ısıtılmış bir hayvan barınağı kafesine aktarın. İzofluran buharlaştırıcısını ve oksijeni kapatın.
  19. Fareyi kafesin içinde tutun ve anesteziden kurtulmak için bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirmeden önce kafesin dışını PREempt ve %70 alkolle sterilize edin.
    1. Alternatif olarak, bir ısıtma lambası kullanıyorsanız, aşırı ısınmayı önlemek için farenin anesteziden uyanırken kafesin serin tarafına hareket edebilmesi için fareyi lambanın altındaki kafesin yan tarafına yerleştirin. Fareyi önümüzdeki 5-10 dakika içinde anesteziden çıkarken izleyin.
  20. Önümüzdeki 3 gün boyunca fareyi izleyin (kilo izleme), ameliyat sonrası bakım (hidrasyonu sağlamak için nemli püre yemeği) ve analjezikler (2 mg / kg meloksikam, günde 2 kez, 2-3 gün boyunca) yerel hayvan bakım komitesi tarafından belirlenen düzenlemelere uygun olarak.

3. Doku hazırlama ve diseksiyon

  1. Fareyi ötenazi yapmak için, fareye intraperitoneal olarak Tribromoetanol (Avertin) (yaklaşık 12.5 mg / mL, 250 mg / BW (kg)) enjekte edin ve tam indüksiyon için 2-3 dakika bekleyin. Fareyi kafesten çıkararak ve ayak parmağını kıstırma refleksinin olmadığını doğrulayarak hayvanın yeterince uyuşturulduğundan emin olun.
  2. Çeker ocakta, salin ile transkardiyal perfüzyon26 ve ardından %4 paraformaldehit uygulayın. Ötenazi yapılan hayvanın kafasına ıslanana kadar% 70 etanol püskürtün.
  3. Bir çift büyük makas kullanarak kafatasının tabanındaki kafayı kesin. Düz 4-1 / 2 "iris makası kullanarak tüm kafatasının orta hattı boyunca cildi kesin. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi geri çekin.
  4. Boyundaki omurga boşluğunun açıklığından iris makasını sokun ve sagital ve interfrontal sütür boyunca kafatasını kesin.
  5. Daha sonra iki göz yuvasına makas sokun ve ön-nazal dikişi kesin.
  6. Beyne zarar vermemeye özellikle dikkat edin. Beyin açığa çıkana kadar kafatası plakalarını sola ve sağa doğru kaldırın.
  7. Beyni% 4 paraformaldehit içeren bir sintilasyon şişesine aktarın. Beyni 4 saat boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit içinde tutun.
  8. Beyin daha sonra %4 paraformaldehit %30 sükroz ile değiştirilerek kriyo korumalı hale getirilir. Beyin şişenin dibine batana kadar (~ 12 saat) beyni% 30 sükroz içinde 4 ° C'de tutun.

4. Donmuş beyinleri bölümlere ayırmak

  1. Kriyostat odasının sıcaklığını -20 °C ila -26 °C arasında ayarlayın.
  2. Beyincik boyunca koronal bir kesim yapın ve beynin düz, kaudal kısmını optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) ile bir kriyostat aynasına takın.
  3. Beynin bulunduğu mandreni disk tutucuya yerleştirin ve koku ampulünü bıçak bıçağıyla hizalayın.
  4. Beyni 20 μm kalınlığında koronal dilimler halinde bölümlere ayırın. Kesitli beyin dilimlerinde çizgiler veya çizik çizgileri oluşmasını önlemek için, yuvarlanma önleyici plaka ile platform arasında küçük bir boşluk oluşturmak için kesit platformuna bir parça bant yerleştirin. Pozitif yüklü bir cam slayt üzerinde yakalamadan önce bölümün yönünü ayarlamak için bir boya fırçası kullanılabilir.
  5. Beyin kesitlerini içeren slaytları -20 °C'de saklayın.

5. İmmünohistokimya ve kantifikasyon

  1. Standart protokolleregöre 22,26 pan-nöronal bir belirteç olan NeuN'ye karşı birincil bir antikor kullanarak immünohistokimya bölümlerini işleyin.
  2. Dondurularak saklanmış beyin bölümlerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çözdürün. Bölümleri 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  3. Kesitleri geçirgenleşmesi için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS'de% 0.3 Triton X-100 içinde inkübe edin.
  4. Blokaj solüsyonunu hazırlayın (PBS'de% 5 normal keçi serumu ve% 0.3 Triton X-100) ve blokaj solüsyonundaki bölümleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  5. Birincil antikoru, tavşan anti-NeuN'yi bloke edici çözeltide 1:500 oranında seyreltin. Bölümleri birincil antikor çözeltisi ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  6. Bölümleri PBS'de% 0.3 Triton X-100 ile her yıkamada 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  7. İkincil antikoru, keçi anti-tavşanı 568 veya 488'i PBS'de 1: 1000 oranında seyreltin. Bölümleri ikincil antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca ışıktan korunarak inkübe edin.
  8. PBS'de% 0.3 Triton X-100 ile her biri 5 dakika boyunca üç yıkama yapın. Bölümleri DAPI (PBS'de 1:10.000) ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  9. Bölümleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez daha yıkayın. Lekeli bölümleri bir floresan montaj ortamı ve bir cam lamel ile bir cam slayt üzerine monte edin. Monte edilmiş slaytların gece boyunca kurumasına izin verin.
  10. Her hayvan için 3 farklı koronal kesitte (korpus kallozumun anterior geçişinin anatomik bölgeleri ile anterior komissür posteriorunun geçişinin anatomik bölgeleri arasında) inme lezyonunun etrafındaki Reporter+ hücrelerinin görünümlerini elde etmek için konfokal mikroskop ile 20x objektif kullanarak lekeli slaytları görüntüleyin.
    NOT: AAV yayılımının mesafesi yarımküre içinde değişecektir. Bununla birlikte, deneyimlerimize ve Reporter+ hücrelerinin doku işleme sonrası analizine dayanarak, AAV yayılımı genellikle bregmadan yaklaşık +3 mm ila -3 mm'yi kapsar. İnme lezyonunun etrafındaki (NeuN'un yokluğu/seyrek boyanması ile tanımlandığı gibi) korpus kallozumun orta hattı geçtiği yer ile anterior komissür bağlandığı alan arasındaki alandaki raportör+ hücreler ölçülmelidir.
  11. Transdüksiyonlu nöronların miktar tayini için kolokalizasyon analizi yapın. Beyin dilimlerindeki çift pozitif hücrelerin sayısını (Reporter+NeuN+) ve transdüksiyona uğrayan toplam (Reporter+) hücre sayısını manuel olarak sayın. Buradaki sonuçlar için, fare başına 3 koronal kesitten lezyonu çevreleyen (medial, lateral ve inferior) >3 görüş alanı sayıldı.

Sonuçlar

Vahşi tipte (C57BL / 6J) ve transgenik tdTom-Cre raportör suşlarında (özellikle, B6) kısa GFAP (gfaABC (1) D) promotör güdümlü, ektopik Neurod1 ekspresyonunun hücresel sonuçlarını incelemek için. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 ET-1 inme yaralı farelerde iki AAV5 tabanlı sistem kullanıldı (Şekil 1A-C). Subakut bir inme modelinde, Neurod1, Cre...

Tartışmalar

Bu protokol, hafif-orta şiddette ET-1 kortikal inme modeli bağlamında Neurod1'in ektopik ekspresyonunu araştırmak için iki AAV sistemini ve fare modelini detaylandırır. ET-1 inme ile ilgili bir dizi kritik adımın, yaralanmanın tekrarlanabilirliği ve tutarlılığı için dikkate alınması önemlidir. İstenmeyen cerrahi yaralanmaları önlemek için çapak delikleri dura mater delinmeden dikkatlice delinmelidir. Benzer bir ilgi alanını sağlamak için tutarlı yer...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma Kalp ve İnme Vakfı, Ontario Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Kanada İlk Araştırma Mükemmeliyet Fonu (Tasarım Yoluyla Tıp, MbD) ve Connaught İnovasyon Ödülü (Toronto Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
#77 Drill Bit (.018”)David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb™ Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Needle Size 4 - 0 BraidedCovidienGL-881
Anti-NeuN Antibody (rabbit) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 MiceCharles River027
Chlorhexidine SolutionPartnarPCH-020
Contec™ PREempt™ RTU Disinfectant SolutionFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Feather Safety Razor Microtome BladesFeather12-631P
Fisherbrand Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-545M 
Fluorescence Mounting MediumAgilent TechnologiesS3023 
Hamilton SyringeHamilton Company7634-01
High Speed Stereotaxic DrillDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Polyderm Ointment USPTARO2181908
SOMNI Scientific™ The Animal Temperature Heating PadFisher Scientific04-777-177
Stereotaxic InstrumentsDavid Kopf InstrumentsModel 902
Superfrost Plus Microscope Slides, whiteFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice The Jackson Laboratory007914
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901806

Referanslar

  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609 (2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507 (2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087 (2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071 (2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531 (2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717 (2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490 (2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663 (2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107 (2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105 (2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786 (2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102 (2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856 (2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310 (2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59 (2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401 (2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115 (2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244 (2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

AAV SistemleriN rojenik Fakt rlerTranskripsiyon Fakt rleriEktopik EkspresyonN rod1skemik nmeBHLH Transkripsiyon Fakt rleriReaktif AstrositlerGFAP Promot rRetrovir sLentivir sntraserebral EnjeksiyonlarN rojenik Fakt r EkspresyonuFare ModelleriKortikal nmeN ronal Rejenerasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır