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요약

이 프로토콜은 피질 허혈성 뇌졸중 후 Neurod1의 바이러스 매개 이소성 발현을 설명합니다. Neurod1은 (1) 뇌졸중 후 아급성기(7일) 동안 야생형 마우스에서 Cre-Flex AAV 시스템을 사용하여 전달되고 (2) 뇌졸중 후 만성기(21일) 동안 조건부 리포터 마우스에서 단일 AAV 벡터를 사용하여 전달됩니다.

초록

in vivo에서 신경인성 인자의 이소성 발현은 질병 모델에서 손실된 뉴런을 대체하기 위한 유망한 접근 방식으로 부상했습니다. 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV)를 포함한 비전파 바이러스 유사 입자 시스템을 통한 신경 기본 나선-루프-나선(bHLH) 전사 인자의 사용은 광범위하게 보고되었습니다. in vivo 실험의 경우, AAV는 병원성이 낮고 번역 가능성이 높기 때문에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중 후 형질도입된 세포에서 전사 인자의 이소성 발현을 조사하기 위한 두 가지 AAV 시스템을 설명합니다. 두 시스템 모두에서 Neurod1 발현은 짧은 GFAP(gfaABC(1)D) 프로모터에 의해 제어되며, 이는 신경인성 인자 발현과 결합될 때 뇌졸중 후 반응성 성상세포와 내인성 뉴런에서 상향 조절됩니다. 설명된 허혈성 뇌졸중 모델에서, 국소 허혈은 엔도텔린-1(ET-1)을 마우스의 운동 피질에 주입하여 반응성 GFAP 발현 성상세포와 생존 뉴런으로 둘러싸인 병변을 생성함으로써 유도됩니다. AAV의 뇌내 주사는 뇌졸중 후 아급성(7일) 및 만성(21일) 단계에서 Neurod1의 발현을 외부적으로 유도하기 위해 수행됩니다. AAV 주입 후 몇 주 이내에 AAV 대조군 바이러스를 투여받은 마우스에 비해 Neurod1을 이소성 발현하는 마우스에서 형질도입된 세포 중 훨씬 더 많은 수의 뉴런이 확인되었습니다. 사용된 AAV 기반 전략은 경증에서 중등도의 피질 뇌졸중 모델에서 리포터 유전자를 발현하는 뉴런 수가 증가하여 관찰된 결과를 복제했습니다. 이 프로토콜은 AAV 기반 시스템으로 전달된 전사 인자의 이소성 발현 효과를 탐색하기 위한 표준 플랫폼을 구축하여 뇌졸중의 맥락에서 신경인성 인자 발현을 이해하는 데 기여합니다.

서문

뇌졸중은 전 세계적으로 장애의 주요 원인입니다1. 뇌졸중은 뇌로 가는 혈류가 중단될 때 발생합니다. 이는 뇌혈관이 파열되는 출혈성 뇌졸중(~15%의 경우) 또는 뇌로 가는 혈류가 차단되는 허혈성 뇌졸중을 통해 발생할 수 있다1. 허혈성 뇌졸중이 가장 흔하며 뇌졸중 사례의 ~85%를 차지한다1. 뇌졸중이 발생하면 뇌로 가는 포도당과 산소의 전달이 감소하여 신경 세포가 빠르게 죽고 신경 기능이 손상됩니다.

허혈성 뇌졸중은 흥분독성, 산화 및 니트로성 스트레스, 칼슘 조절 장애, 피질 확산 탈분극, 부종, 혈액뇌장벽(BBB) 파괴 및 염증의 메커니즘을 통해 병변의 중심부에서 몇 분 이내에 세포를 잃게 됩니다 2,3. 경색 주위 영역의 세포는 몇 시간 내에 세포사멸 세포가 사멸되며, 뇌졸중 후에는 며칠 동안 사멸 세포가 사멸한다4. 경색 주위 환경은 손상 후 다양한 역할을 하는 미세아교세포와 성상세포("반응성" 성상세포)의 활성화로 이어지는 전염증 및 항염증 신호에 노출됩니다 5,6,7,8. 반응성 성상세포는 신경교섬유산단백질(GFAP)의 상향조절과 뇌졸중 후 며칠 이내에 병변 주위에 경계가 형성되는 등 여러 가지 표현형 변화를 겪으며, 이는 병변의 범위를 제한하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 손상된 조직 내의 신경 가소성에 영향을 미칩니다 8,9,10.

직접 세포 재프로그래밍(direct cellular reprogramming)은 만능 상태를 거치지 않고 하나의 성숙한 세포 유형을 다른 성숙한 세포 유형으로 변환할 수 있게 합니다11. 상주하는 뇌세포를 새로운 뉴런으로 바꾸어 부상으로 잃은 세포를 대체하는 것은 뇌 회복을 위한 매력적인 방법을 제시합니다. 뇌졸중은 손실된 뉴런을 대체하고, 치료 기간을 넓히고, 궁극적으로 기능 회복을 촉진하기 위한 치료 방법의 필요성을 감안할 때 세포 기반 치료의 이상적인 표적입니다. 이를 위해 Ascl1, Neurog2, Neurod1 및 최근에는 향상된 재프로그래밍 효능을 입증한 Ascl1(Ascl1-SA6)의 돌연변이 버전을 포함한 다양한 기본 나선-루프-나선(bHLH) 신경원성 전사 인자를 사용하여 체외 및 생체 내에서 성상세포에서 뉴런(AtN)으로의 재프로그래밍을 입증하는 많은 논문이 있었습니다 11,12,13,14. 고려해야 할 중요한 사항은 결과, 해석 및 연구 간 비교에 영향을 미칠 수 있는 많은 실험 설계 요인입니다. Ghazale 등은 동일한 bHLH 전사 인자14를 사용할 때 AtN 재프로그래밍 효율이 서로 다른 마우스 균주, AAV 혈청형 및 프로모터에 따라 다르다는 것을 입증했습니다. 손상 모델, 뇌 영역, 바이러스 투여, 유전자 전달 시기, 재프로그래밍 인자 및 전달 방식과 같은 다른 고려 사항이 결과에 영향을 미칠 것입니다. 최근 보고에 따르면 기존의 형질전환 뉴런이 재프로그래밍된 뉴런으로 잘못 해석되어 왔다15,16. 보고서가 AtN 변환이 발생한다는 것을 반드시 부정하는 것은 아니지만, 이러한 연구는 잘 통제된 실험의 중요성을 강조했으며 여러 논문에서 이 분야의 다음 단계에 대한 권장 사항을 제시했습니다 15,17,18,19. 문헌에서 명백한 것은 bHLH 전사 인자의 이소성 발현이 신경퇴행성 질환/손상의 다양한 동물 모델에서 기능적 결과를 향상시킬 수 있다는 것입니다 13,20,21,22,23,24.

여기서, 관심있는 전사 인자 인 Neurod1 프로토콜은 형질전환 된 세포13 , 22에서 이소성으로 발현됩니다. 성체 마우스에서 감각 운동 피질에 대한 허혈성 뇌졸중의 잘 정립된 endothelin-1(ET-1) 모델이 사용됩니다. ET-1의 주사는 기능 장애를 포함하여 허혈성 뇌졸중의 병태생리학을 모방한 국소 혈관 수축을 유발합니다 22,23,25. 일반적으로 사용되는 short-GFAP promoter(gfaABC(1)D)는 두 가지 바이러스 전략을 사용하여 손상 부위 및 병변 주위 영역에서 Neurod1의 이소성 발현을 유도하는 데 사용됩니다: (1) 야생형 마우스에서 AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre 전달 및 (2) tdTom-Cre 리포터 마우스에서 AAV5-GFAP-Neurod1-Cre 전달. 뇌졸중 손상 뇌에서 Neurod1의 이소성 발현 가능성을 더 자세히 이해하기 위해 AAV는 뇌졸중 후 아급성기(7일) 또는 만성기(21일)에 전달되었습니다. 두 패러다임 모두에서 이소성 Neurod1 발현 후 몇 주 이내에 훨씬 더 많은 표지된 뉴런이 발견되었습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 토론토 대학의 동물 관리 위원회(Animal Care Committee)의 승인을 받았으며 실험 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide to the Care and Use of Experimental Animals, 2판, 캐나다 동물 보호 위원회, 2017)를 준수합니다. 본 연구에서는 야생형(C57BL/6J) 및 형질전환 tdTom-Cre 리포터(B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 마우스 균주를 사용하였다. 생쥐는 생후 7-9주였고 수컷과 암컷을 모두 포함했다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 엔도텔린-1 뇌졸중 수술

참고: 모든 수술 기구 및 재료는 수술 전에 오토클레이브로 멸균됩니다. 입체식 프레임은 PREempt로 살균됩니다. 주사기는 PREempt, 70% 알코올로 멸균되고 수술 전에 멸균 PBS로 프라이밍됩니다. 엔도텔린-1(ET-1)은 수술 내내 얼음에 보관됩니다.

  1. 수술을 시작하기 전에 37°C로 설정된 발열 패드에 깨끗한 케이지를 놓고 회복 영역을 설정합니다. 또는 난방 램프를 사용하는 경우 케이지의 절반만 열 아래에 놓습니다.
    1. 이소플루란을 사용하여 생쥐를 마취하려면 동물 관리 위원회(Animal Care Committee)에서 승인한 프로토콜을 따르십시오. 마우스를 마취 유도 챔버에 놓고 산소를 1-1.5L/min으로 켠 다음 이소플루란 기화기를 3%-5%로 조정하여 마취를 시작합니다.
  2. 동물이 옆으로 누워 더 이상 서 있을 수 없게 되면 동물을 방에서 꺼내 깨끗한 표면에 놓으십시오. 수술 전과 수술 내내 발가락 꼬집음 반사가 없는지 확인하여 동물이 적절하게 마취되었는지 확인합니다.
    1. 마취 기계에서 확장된 콧방울을 동물에게 고정하고 유지 관리를 위해 이소플루란을 1%-2%로 조정합니다. 절차를 완료하는 데 최대 40분이 소요될 수 있으므로 이소플루란에 대한 노출을 최소화합니다(유도의 경우 3%-5%에서 5분, 나머지 시간은 1%-2%).
  3. 동물 털 트리머를 사용하여 동물의 목/귀 뒤에서 코까지 털을 제거하여 수술을 위해 두개골의 피부를 노출시킵니다.
  4. 동물의 체중을 측정하고 체중에 따라 적절한 용량의 수술 전 진통제(Meloxicam (2.0 mg/kg))를 피하로 투여합니다.
  5. 마취 중 각막 건조를 방지하기 위해 마우스의 각 눈에 눈 윤활제 연고를 바르십시오.
  6. 털이 잘린 피부 부위를 70% 에탄올로 살균한 후(1.3단계) 클로르헥시딘 알코올을 2회 투여하여 수술 부위를 만듭니다.
  7. 먼저 마우스의 코를 입체성 노즈콘에 놓아 마우스를 입체성 프레임으로 옮긴 다음 이어바로 두개골을 안정화합니다. 수술 과정 내내 열 지지를 위해 37°C로 설정된 가열 패드에 마우스를 보관하십시오. 이소플루란을 1%-2%로 유지하여 마우스가 1 호흡/초의 호흡수를 표시하도록 합니다.
  8. 필요한 경우 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 반복적으로 도포합니다. 귀 아래 마우스의 몸에 멸균 수술용 드레이프를 적용하여 멸균 영역의 크기를 확장합니다.
  9. #10 메스 날로 눈의 중간 지점 뒤에서 머리 뒤쪽(두정골)까지 동물의 시상면과 평행하게 수직 절개를 만듭니다. 피부를 옆으로 부드럽게 집어넣어 두개골을 노출시킵니다.
  10. Q-tip을 사용하여 두개골의 근막을 파괴하고 두개골을 건조시켜 브레그마를 노출시킵니다.
  11. .018" 드릴 비트가 있는 고속 입체 드릴을 운반하는 드릴 홀더가 있는 매니퓰레이터 암을 설정합니다.
  12. 브레그마 측면 2.25mm, 브레그마 측면 +0.0mm, 꼬리 방향 +0.0mm, 브레그마 방향 -1.0mm의 오른쪽 감각 운동 피질 좌표에서 고속 입체 드릴로 3개의 버 구멍(직경 .018")을 뚫습니다.
  13. 드릴을 26인치 길이의 바늘이 있는 0.375G 주사기로 교체합니다.
  14. 멸균 PBS에 용해된 1.5μL의 400μM ET-1을 주사기에 로드합니다. 양호한 흐름을 보장하려면 바늘 끝에서 방울이 관찰될 때까지 소량의 ET-1을 방출합니다. 주사를 수행하기 전에 멸균 Q-tip을 사용하여 초과분을 닦아내십시오.
  15. 경막에 구멍을 뚫지 않고 바늘 끝을 두개골을 지나 중간 버 구멍(오른쪽 감각 운동 피질, 브레그마 측면 + 0.0, 2.25mm 측면)으로 내립니다. 정렬되면 바늘을 뇌 안으로 1mm 내립니다.
  16. 한 번에 0.1μL를 분주하여 1μL의 ET-1을 주입합니다. Hamilton 주사기의 플런저를 앞으로 밀어 0.1 μL를 분주하고 다음 0.1 μL를 주입하기 전에 1분 동안 기다렸다가 1 μL가 분주될 때까지 주입합니다.
    1. 최종 0.1μL를 분주한 후(0.1μL x 10회 주입 = 총 1μL) 역류를 방지하기 위해 바늘을 10분 동안 제자리에 유지한 다음 천천히 위쪽으로 당겨 주사기를 제거합니다.
  17. 주사 중 바늘이 막히지 않도록 바늘 끝에서 물방울이 관찰될 때까지 소량의 ET-1을 방출합니다. 주사를 수행하기 전에 멸균 Q-tip을 사용하여 초과분을 닦아내십시오. 다음 동물에게 PREempt를 주입하기 전에 주사기를 살균한 다음 70% 알코올을 주입한 다음 PBS를 멸균합니다.
  18. 상처를 봉합하기 위해 4-0 폴리솝 폴리에스테르 멸균 봉합사를 사용하여 두개골의 위에 있는 피부를 함께 봉합합니다.
  19. 봉합된 부위에 면봉을 사용하여 항생제 연고를 투여하여 수술 후 감염을 예방합니다.
  20. 입체성 프레임에서 마우스를 제거하고 회수 구역의 깨끗하고 예열된 동물 사육장으로 옮깁니다. 이소플루란 기화기와 산소를 끕니다.
  21. 마취에서 회복하는 동안 케이지를 가열 패드 위에 두십시오. 또는 가열 l을 사용하는 경우amp l, 마우스가 과열을 방지하기 위해 마취에서 깨어날 때 케이지의 시원한 쪽으로 이동할 수 있도록 l 아래의 케이지 측면에 마우스를 놓습니다. 다음 5-10분 내에 마우스가 마취에서 나올 때 모니터링합니다.
  22. 향후 3일 동안 마우스를 모니터링하고(체중 모니터링), 수술 후 관리(수분 공급을 위한 촉촉한 으깬 차우) 및 진통제(2mg/kg meloxicam, 2-3일 동안 매일 2회 피하)를 제공합니다.

2. 뇌졸중 후 아데노 관련 바이러스(AAV) 분만(7일 - 아급성 모델 또는 21일 - 만성 모델)

주의: AAV 작업에 대한 기관의 생물 안전 지침을 참조하십시오. 토론토 대학의 지침에 따라 이 수술은 봉쇄 레벨 2 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

참고: 모든 수술 기구 및 재료는 수술 전에 오토클레이브로 멸균됩니다. 입체식 프레임은 PREempt로 살균됩니다. 주사기는 PREempt, 70% 알코올로 멸균되고 멸균 PBS로 프라이밍됩니다. AAV는 수술 내내 얼음 위에 보관됩니다.

  1. 수술을 시작하기 전에 37°C로 설정된 발열 패드에 깨끗한 케이지를 놓고 회복 영역을 설정합니다. 또는 난방 램프를 사용하는 경우 케이지의 절반만 열 아래에 놓습니다.
    1. 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취하려면 마우스를 마취 유도실에 넣고 산소를 1-1.5L/분으로 켠 다음 이소플루란 기화기를 3%-5%로 조정하여 마취를 시작합니다(주입적으로 승인된 프로토콜에 따름).
  2. 동물이 옆으로 눕고 더 이상 깨끗한 표면에 서 있을 수 없게 되면 챔버에서 동물을 제거하십시오. 수술 전과 수술 내내 발가락 꼬집음 반사가 없는지 확인하여 동물이 적절하게 마취되었는지 확인합니다.
    1. 마취 기계에서 확장된 콧방울을 동물에게 고정하고 유지 관리를 위해 이소플루란을 1%-2%로 조정합니다. 절차를 완료하는 데 최대 40분이 소요될 수 있으므로 이소플루란에 대한 노출을 최소화합니다(유도의 경우 3%-5%에서 5분, 나머지 시간은 1%-2%).
  3. 동물의 체중을 측정하고 체중에 따라 적절한 용량의 수술 전 진통제(Meloxicam (2.0 mg/kg))를 피하로 투여합니다.
  4. 마취 상태에서 각막 건조를 방지하기 위해 마우스의 각 눈에 눈 윤활제 연고를 바르십시오.
  5. 털이 잘린 피부 부위를 70% 에탄올로 살균한 다음 클로르헥시딘 알코올을 두 번 투여하여 수술 영역을 형성합니다.
  6. 먼저 마우스의 코를 입체성 노즈콘에 놓아 마우스를 입체성 프레임으로 옮긴 다음 이어바로 두개골을 안정화합니다. 수술 과정 내내 열 지지를 위해 37°C로 설정된 가열 패드에 마우스를 보관하십시오. 이소플루란을 1%-2%로 유지하여 마우스가 1 호흡/초의 호흡수를 표시하도록 합니다.
  7. 필요한 경우 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 반복적으로 도포합니다. 귀 아래 마우스의 몸에 멸균 수술용 드레이프를 적용하여 멸균 필드의 크기를 확장합니다.
  8. 그래도 남아 있으면 수술용 가위로 봉합사를 자르고 집게로 딱지를 제거합니다. 두개골을 드러내기 위해 피부를 집어넣습니다.
    참고: 만성 모델의 경우 #10 메스 칼날로 피부를 절제해야 할 수도 있습니다.
  9. 멸균 Q-tip을 사용하여 두개골을 말리고 버 구멍을 찾습니다.
  10. 26인치 길이의 바늘이 있는 0.375G 주사기를 운반하는 바늘 홀더가 있는 정위 장치의 매니퓰레이터 암을 설정합니다.
  11. 3.4 μL의 AAV(급성 연구의 경우 1 x 109 게놈 사본(GC)/μL, 만성 연구의 경우 1 x 1010 GC/μL)를 주사기에 로드합니다. 흐름이 양호한지 확인하려면 바늘 끝에서 물방울이 관찰될 때까지 소량의 AAV를 방출합니다. 주사를 수행하기 전에 멸균 Q-tip을 사용하여 초과분을 닦아내십시오.
  12. 경막에 구멍을 뚫지 않고 ET-1에 사용되는 첫 번째 버 구멍(경막 앞쪽 + 0.0 및 브레그마 측면 2.25mm의 오른쪽 감각 운동 피질)에서 두개골을 지나 바늘 끝을 내립니다. 정렬되면 바늘을 뇌 안으로 1mm 내립니다. (0 AP, +2.25 ML, 브레그마에서 -1.0 DV).
  13. 한 번에 0.1 μL를 분주하여 1 μL의 AAV(급성 연구의 경우 1 x 109 GC/μL, 만성 연구의 경우 1 x 1010 GC/μL)를 주입합니다. Hamilton 주사기의 플런저를 앞으로 밀어 0.1μL를 분주하고 1분 동안 기다렸다가 다음 0.1μL를 주입합니다. 1μL가 분주될 때까지 주입합니다. 최종 0.1μL를 분주한 후(0.1μL x 10회 주입 = 총 1μL) 역류를 방지하기 위해 바늘을 10분 동안 제자리에 유지한 다음 천천히 위쪽으로 당겨 주사기를 제거합니다.
  14. 주사 중 바늘이 막히지 않도록 바늘 끝에서 한 방울이 관찰될 때까지 소량의 AAV를 방출하십시오. 주사를 수행하기 전에 멸균 Q-tip을 사용하여 초과분을 닦아내십시오.
  15. 남아있는 두 개의 버 구멍(브레그마에서 +1 AP, +2.25 ML, -1.0 DV 및 -1 AP, +2.25 ML, -1.0 DV mm의 오른쪽 감각 운동 피질)에 AAV 주입에 대해 2.11-2.14 단계를 반복합니다. 다음 동물에게 PREempt를 주입하기 전에 주사기를 살균한 다음 70% 알코올, 마지막으로 PBS를 멸균합니다.
  16. 상처를 봉합하기 위해 4-0 폴리솝 폴리에스테르 멸균 봉합사를 사용하여 두개골의 위에 있는 피부를 함께 봉합합니다.
  17. 수술 후 감염을 예방하기 위해 봉합된 부위에 면봉을 사용하여 항생제 연고를 투여합니다.
  18. 입체성 프레임에서 마우스를 제거하고 회수 구역의 깨끗하고 예열된 동물 사육장으로 옮깁니다. 이소플루란 기화기와 산소를 끕니다.
  19. 마우스를 케이지 내부에 보관하고 케이지 외부를 PREempt와 70% 알코올로 살균한 후 마취 회복을 위해 가열 패드 위에 올려 놓습니다.
    1. 또는 난방 l을 사용하는 경우amp, l, lamp 아래 케이지 측면에 마우스를 놓으십시오.amp 마우스가 과열을 방지하기 위해 마취에서 깨어날 때 케이지의 시원한 쪽으로 이동할 수 있도록 합니다. 다음 5-10분 내에 마우스가 마취에서 나올 때 모니터링합니다.
  20. 향후 3일 동안 마우스를 모니터링하고(체중 모니터링), 수술 후 관리(수분 공급을 위한 촉촉한 으깬 차우) 및 진통제(2mg/kg meloxicam, 2-3일 동안 매일 2회 피하)를 제공합니다.

3. 조직 준비 및 해부

  1. 마우스를 안락사시키려면 마우스에 트리브로모에탄올(Avertin)(conc. 12.5 mg/mL, 250 mg/BW(kg))을 복강내 주사하고 완전한 유도를 위해 2-3분 동안 기다립니다. 케이지에서 마우스를 꺼내 동물이 적절하게 마취되었는지 확인하고 발가락 핀치 반사가 없는지 확인합니다.
  2. 흄 후드에서 식염수와 4% 파라포름알데히드를 투여하여 경심 관류26 을 수행합니다. 안락사된 동물의 머리에 70% 에탄올이 젖을 때까지 뿌립니다.
  3. 큰 가위를 사용하여 두개골 바닥의 머리를 자릅니다. 4-1/2" 홍채 가위를 사용하여 두개골 전체의 정중선을 따라 피부를 잘라냅니다. 두개골을 드러내기 위해 피부를 집어넣습니다.
  4. 목의 척추강 입구에서 홍채 가위를 삽입하고 시상 및 전두엽 봉합사를 따라 두개골을 자릅니다.
  5. 그런 다음 두 눈구멍에 가위를 삽입하고 전두-코 봉합사를 자릅니다.
  6. 뇌가 손상되지 않도록 특히 주의하십시오. 뇌가 노출될 때까지 두개골 판을 왼쪽과 오른쪽으로 들어 올립니다.
  7. 뇌를 4% 파라포름알데히드가 함유된 섬광 바이알로 옮깁니다. 뇌를 4% 파라포름알데히드로 4°C에서 4시간 동안 유지합니다.
  8. 그런 다음 뇌는 4%의 파라포름알데히드를 30%의 자당으로 대체하여 냉동 보호됩니다. 뇌가 바이알 바닥으로 가라앉을 때까지(~12시간) 4°C에서 뇌를 30% 자당으로 유지합니다.

4. 얼어붙은 뇌 절편

  1. 저온 유지 장치 챔버의 온도를 -20 °C에서 -26 °C 사이로 설정합니다.
  2. 소뇌를 가로질러 관상 절개를 만들고 뇌의 편평한 꼬리 부분을 최적 절단 온도 화합물(OCT)이 있는 저온 유지 장치 척에 부착합니다.
  3. 뇌와 함께 척을 디스크 홀더에 넣고 후각 전구를 칼날에 맞춥니다.
  4. 뇌를 20μm 두께의 관상 동맥 조각으로 나눕니다. 절편된 뇌 절편에 줄무늬나 긁힌 선이 생기지 않도록 하려면 절편 플랫폼에 테이프 조각을 올려 롤링 방지 플레이트와 플랫폼 사이에 작은 틈을 만듭니다. 페인트 브러시를 사용하여 양전하를 띤 유리 슬라이드에 캡처하기 전에 섹션의 방향을 조정할 수 있습니다.
  5. 뇌 절편이 포함된 슬라이드는 -20°C에서 보관하십시오.

5. 면역조직화학 및 정량화

  1. 표준 프로토콜22,26에 따라 범신경 마커인 NeuN에 대한 1차 항체를 사용하여 면역조직화학을 위한 절편을 처리합니다.
  2. 실온에서 5분 동안 냉동 보존된 뇌 절편을 해동합니다. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 각 5분씩 섹션을 세 번 세척합니다.
  3. PBS의 0.3% Triton X-100에 절편을 실온에서 20분 동안 배양하여 투과화합니다.
  4. 차단 용액(PBS 중 5% 일반 염소 혈청 및 0.3% Triton X-100)을 준비하고 차단 용액의 절편을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  5. 1차 항체인 rabbit anti-NeuN을 차단 용액에서 1:500 비율로 희석합니다. 1차 항체 용액이 포함된 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  6. PBS에서 0.3% Triton X-100으로 각 섹션을 5분 동안 세 번 세척합니다.
  7. 2차 항체인 goat anti-rabbit 568 또는 488을 PBS에서 1:1000 비율로 희석합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 2차 항체 용액으로 절편을 배양합니다.
  8. PBS에서 0.3% Triton X-100을 5분씩 3회 세척합니다. 실온에서 5분 동안 DAPI(PBS의 경우 1:10,000)로 절편을 배양합니다.
  9. PBS로 각각 5분씩 세 번 더 씻습니다. 얼룩진 부분을 형광 장착 매체와 유리 커버슬립이 있는 유리 슬라이드에 장착합니다. 장착된 슬라이드를 밤새 건조시키십시오.
  10. 컨포칼 현미경이 있는 20x 대물렌즈를 사용하여 각 동물에 대해 3개의 서로 다른 코로나 절편(전방의 뇌량과 후방의 전방 코미셔널 교차점의 해부학적 영역 사이)에서 뇌졸중 병변 주변의 Reporter+ 세포를 볼 수 있는 이미지 염색 슬라이드.
    참고: AAV 확산의 거리는 반구 내에서 다릅니다. 그러나 우리의 경험과 Reporter+ 세포에 대한 조직 후 처리 분석에 따르면 AAV 확산은 일반적으로 브레그마에서 약 +3mm에서 -3mm에 걸쳐 있습니다. 뇌졸중 병변(NeuN의 부재/희박한 염색으로 확인됨) 주변의 리포터+ 세포는 말뭉치가 정중선을 가로지르는 곳과 전방 커미셔 연결 사이의 영역에서 정량화되어야 합니다.
  11. 형질도입된 뉴런의 정량화를 위해 colocalization analysis를 수행합니다. 뇌 절편에서 이중 양성 세포의 수(Reporter+NeuN+)와 형질도입된 세포의 총 수(Reporter+)를 수동으로 계산합니다. 본 명세서의 결과를 위해, 마우스당 3개의 관상 절편에서 병변(내측, 측면 및 하측)을 둘러싼 >3개의 시야를 계산했습니다.

결과

야생형(C57BL/6J) 및 형질전환 tdTom-Cre 리포터 균주(특히 B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 두 개의 AAV5 기반 시스템이 ET-1 뇌졸중 손상 마우스에 사용되었습니다(그림 1A-C). 아급성 뇌졸중 모델에서 Neurod1은 Cre-Flex AAV 시스템에 패키징되어 뇌졸중 후 7일째에 야생형 마우스에 전달되었습?...

토론

이 프로토콜은 경증-중등도 ET-1 피질 뇌졸중 모델의 맥락에서 Neurod1의 이소성 발현을 조사하기 위한 두 가지 AAV 시스템과 마우스 모델에 대해 자세히 설명합니다. ET-1 뇌졸중과 관련된 여러 가지 중요한 단계는 부상의 재현성과 일관성을 위해 고려해야 할 중요한 단계입니다. 버 구멍은 의도하지 않은 수술 부상을 방지하기 위해 경막에 구멍을 뚫지 않고 조심스럽?...

공개

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 Heart and Stroke Foundation, Ontario Institute of Regenerative Medicine, Canada First Research Excellence Fund(Medicine by Design, MbD) 및 Connaught Innovation Award(토론토 대학교)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
#77 Drill Bit (.018”)David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb™ Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Needle Size 4 - 0 BraidedCovidienGL-881
Anti-NeuN Antibody (rabbit) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 MiceCharles River027
Chlorhexidine SolutionPartnarPCH-020
Contec™ PREempt™ RTU Disinfectant SolutionFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Feather Safety Razor Microtome BladesFeather12-631P
Fisherbrand Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-545M 
Fluorescence Mounting MediumAgilent TechnologiesS3023 
Hamilton SyringeHamilton Company7634-01
High Speed Stereotaxic DrillDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Polyderm Ointment USPTARO2181908
SOMNI Scientific™ The Animal Temperature Heating PadFisher Scientific04-777-177
Stereotaxic InstrumentsDavid Kopf InstrumentsModel 902
Superfrost Plus Microscope Slides, whiteFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice The Jackson Laboratory007914
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901806

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